一種注射級α-環(huán)糊精的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種注射級α-環(huán)糊精的制備方法，采用環(huán)氧基樹脂作載體制備α-CGTase固定化酶，將淀粉制成淀粉乳，加入α-CGTase固定化酶進(jìn)行淀粉液化，再轉(zhuǎn)入用裝填有α-CGTase固定化酶的填充反應(yīng)器中反應(yīng)，轉(zhuǎn)化液經(jīng)超濾收集透出液；透出液經(jīng)α-淀粉酶和糖化酶處理、活性炭脫色、反滲透膜濃縮、重結(jié)晶，過濾去除β-環(huán)糊精，母液再進(jìn)一步經(jīng)反滲透膜濃縮，結(jié)晶，過濾，烘干研磨即得注射級α-環(huán)糊精。本發(fā)明制得的固定化酶具有穩(wěn)定性好、可以重復(fù)利用，且極易與產(chǎn)物、底物分離，酶的利用效率高、可連續(xù)操作及自動(dòng)化控制，工藝簡便，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。采用無溶劑過程生產(chǎn)α-環(huán)糊精，生產(chǎn)設(shè)備簡單，反應(yīng)條件溫和，能耗低，無溶劑殘留污染，更加環(huán)保節(jié)能。
【專利說明】一種注射級Ct -環(huán)糊精的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種注射級α -環(huán)糊精的制備方法。
技術(shù)背景
[0002]環(huán)糊精是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶解淀粉或淀粉類基質(zhì)產(chǎn)生的由D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵連接而形成的一類環(huán)狀低聚化合物。根據(jù)葡萄糖單元數(shù)目的不同，環(huán)糊精可以分為α _、β _、Y _、δ -環(huán)糊精等，其中最常見的是聚合度為6、7、8的α -、β Y _環(huán)糊精。
[0003]環(huán)糊精的立體結(jié)構(gòu)是中空圓筒形，在它的圓筒內(nèi)部有非極性的C3和C5上的氫以及通過醚鍵連接的氧原子，故圓筒內(nèi)腔呈疏水性；而葡萄糖的C2和C3上的仲羥基位于圓筒的寬側(cè)開口處，C6上的伯羥基位于圓筒的窄側(cè)開口處，故圓筒外部呈親水性。由于這種結(jié)構(gòu)，使它具有容納與其形狀和大小適合的疏水性分子或基團(tuán)嵌入圓筒內(nèi)而形成包合物的特性。環(huán)糊精在包合物中作為“主分子”，在其圓筒內(nèi)腔將其它物質(zhì)作為“客分子”包合起來。這種包合物與 尿素和硫脲的分子與分子間晶格空洞形成的包合物不同，因環(huán)糊精形成的包合物是在空腔內(nèi)，而不是在晶格中，所以它在水中溶解時(shí)，包合物仍然穩(wěn)定，并不分裂。而且α-環(huán)糊精在水中的溶解度大(25°C達(dá)到127g/L)，且空腔較小，因此在藥物包合中有著重要的作用，并廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域。
[0004]目前α-環(huán)糊精的生產(chǎn)主要采用酶法制備，菌種發(fā)酵后，從菌液中通過離心或者板框過濾分離得到α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(a-CGTase )。同時(shí)將淀粉與水調(diào)漿制成淀粉乳后升溫至90°C ±1°C糊化至固體狀，再加入α-淀粉酶或者a-CGTase攪拌液化。液化后降溫至50°C ±1°C，加入環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和癸醇，攪拌反應(yīng)生成α-環(huán)糊精-癸醇復(fù)合物。過濾除去濾液后，α-環(huán)糊精-癸醇復(fù)合物經(jīng)過水蒸汽蒸餾去除癸醇，經(jīng)過濃縮結(jié)晶干燥即得α-環(huán)糊精。在此工藝制備過程中，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在水溶液中不穩(wěn)定，一次性使用難以回收利用，很難連續(xù)化生產(chǎn)，且在后續(xù)的反應(yīng)過程中需要對其進(jìn)行滅活，增加生產(chǎn)成本。在轉(zhuǎn)化過程中，需要加入不同的有機(jī)溶劑，如癸醇等，使α-環(huán)糊精包合沉淀下來，再通過水蒸汽蒸餾去除癸醇，但由于癸醇的沸點(diǎn)高達(dá)229°C，很難從水溶液中去除。采用水蒸汽蒸餾法需高壓飽和蒸汽蒸餾10至15小時(shí)，該法需使用高溫高壓手段，存在能耗過高、危險(xiǎn)系數(shù)較大、操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)(多達(dá)15h)、溶媒無法回收利用、有機(jī)溶劑易殘留于樣品中等缺點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)室分析和實(shí)際生產(chǎn)操作帶來諸多不便。且國內(nèi)在實(shí)際生產(chǎn)過程中，α -環(huán)糊精產(chǎn)品的質(zhì)量較差，尚未有符合注射級藥用標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品的生產(chǎn)，不利于α -環(huán)糊精在醫(yī)藥產(chǎn)品的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種注射級α -環(huán)糊精的制備方法，其采用環(huán)氧基樹脂作為固定化載體得到穩(wěn)定的a-CGTase固定化酶，并采用無溶劑方法制備α-環(huán)糊精，能夠有效地克服現(xiàn)在技術(shù)中存在的能耗大，反應(yīng)強(qiáng)烈，有機(jī)溶劑殘留，產(chǎn)品質(zhì)量低的問題。[0006]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:
一種注射級α -環(huán)糊精的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
(a)a -CGTase產(chǎn)生菌的誘導(dǎo)表達(dá):
a -CGTase產(chǎn)生菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后離心，收集上清液即為粗酶液；粗酶液經(jīng)過超濾濃縮得到濃縮粗酶液；
(b)a -CGTase固定化酶的制備:
將環(huán)氧基樹脂加入磷酸緩沖溶液浸泡至溶脹后，加入上述濃縮粗酶液，經(jīng)振蕩固定化反應(yīng)后離心，棄去上清液，加入巰基乙醇封閉剩余的環(huán)氧基團(tuán)，過濾，洗滌，直至洗出液無酶活性，即得a-CGTase固定化酶，4°C保存，備用；
(C)淀粉的液化:
在分批攪拌罐中加入淀粉制成淀粉乳，加入CaCl2后，調(diào)整pH，加入a -CGTase固定化酶并攪拌反應(yīng)得到淀粉液化液；
Cd)淀粉的轉(zhuǎn)化: 將a-CGTase固定化酶填充在填充反應(yīng)柱中，兩端用玻璃纖維塞隔離，擰緊兩端旋帽使填充反應(yīng)柱內(nèi)部呈密封狀態(tài)；將液化儲(chǔ)罐中的淀粉液化液用恒流泵輸入填充反應(yīng)柱進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；得到的轉(zhuǎn)化液經(jīng)超濾，透過液為α-環(huán)糊精溶液，截留液繼續(xù)打入填充反應(yīng)柱進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；α -環(huán)糊精溶液加入固定化α -淀粉酶和固定化糖化酶反應(yīng)，以除去未轉(zhuǎn)化的淀粉，并改善轉(zhuǎn)化液的濾過性；轉(zhuǎn)化液通砂芯漏斗過濾回收固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶，濾液儲(chǔ)存于儲(chǔ)液罐中；
Ce)精制純化:
濾液中加入活性炭攪拌后過濾，經(jīng)反滲透膜濃縮，5°C~15°C攪拌，待β-環(huán)糊精重結(jié)晶后，過濾棄晶體，母液經(jīng)過進(jìn)一步反滲透膜濃縮至α -環(huán)糊精含量在40%~50%時(shí)，(TC~5°C攪拌結(jié)晶得α-環(huán)糊精，烘干研磨即得注射級α-環(huán)糊精。
[0007]步驟(a)中,所述a-CGTase產(chǎn)生菌為軟化芽孢桿菌(ifeci77i/5.?acera/75.)、嗜熱脂肪芽孢菌iB.Siearo?Α6?τ?ο/7ΑΗ".5)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌{Klebsiella oxytoca )等,優(yōu)選基因工程菌萬.co7i現(xiàn)(DE3)/pet24a (+)(中國典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)。
[0008]步驟(b)中，所述環(huán)氧基載體為所有含有環(huán)氧基功能基的載體，優(yōu)選環(huán)氧基樹脂Eupergit C250L。
[0009]優(yōu)選的，步驟(b)中，所述的環(huán)氧基樹脂和酶在pH6~9的磷酸緩沖液中，4°C至室溫反應(yīng)2~24h，將酶固定于樹脂上，制成固載量為10~200mg酶/g樹脂。
[0010]優(yōu)選的，步驟(C)中，液化反應(yīng)控制ρΗ5.0~7.0，優(yōu)選6.5，反應(yīng)溫度40°C~70°C，優(yōu)選55°C，控制液化D.E值為2.5~4.5，優(yōu)選3.0。
[0011]優(yōu)選的，步驟(d)中所述填充反應(yīng)柱的高徑比為6~9，優(yōu)選7.8;反應(yīng)液流速為1.0ml/min~2.0ml/min,優(yōu)選1.5ml/min ;反應(yīng)溫度30 V~50 °C,優(yōu)選35 V ;反應(yīng)時(shí)間IOmin~60min ;固定化α -淀粉酶與固定化糖化酶酶活比例為1:0.5~1:0.8，優(yōu)選比例為1:0.7 ;添加量為投料淀粉量干重的0.03%~0.05%，優(yōu)選的0.03%。
[0012]優(yōu)選的，步驟(e)中，加入活性炭3%~8%，優(yōu)選5% ;反滲透膜采用熱性螺旋反滲透膜，截留分子量為150~300，操作壓力為3.5~5.5MPa，工作溫度為30°C~40°C，流速為20L/h。[0013]更進(jìn)一步的，步驟(e)中，加入活性炭5%，反滲透膜采用熱性螺旋反滲透膜，截留分子量為200，操作壓力為4.0MPa，工作溫度為35°C，流速為20L/h。
[0014]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明的環(huán)氧基樹脂Eupergit C250l直徑約100-250 μ m,具有化學(xué)、機(jī)械性能穩(wěn)定，可長期存放的特點(diǎn)；具有較高的反應(yīng)活性，可以和蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、羥基等集團(tuán)反應(yīng)形成穩(wěn)定多點(diǎn)共價(jià)鍵；固定化后未反應(yīng)的環(huán)氧基團(tuán)易于使用巰基乙醇或二硫蘇糖醇進(jìn)行封閉等優(yōu)點(diǎn)。目前還未有以Eupergit C250l固定化a -CGTase的報(bào)道。
[0015]2、本發(fā)明首次采用環(huán)氧基樹脂作為固定化載體制備a -CGTase固定化酶，制得的固定化酶具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、有很好的機(jī)械操作強(qiáng)度，可以反復(fù)重復(fù)利用，且極易與產(chǎn)物、底物分離，酶的利用效率高、可連續(xù)操作及自動(dòng)化控制，工藝簡便，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:1)本發(fā)明將ΡΗ6.0~9.0的磷酸緩沖溶液預(yù)先浸泡Eupergit C25%，促進(jìn)了載體對酶的吸附，并加快了固定化的反應(yīng)歷程以減少固定化造成的酶損失，本發(fā)明的酶活回收率為50%以上。2) a -CGTase經(jīng)過固定化后穩(wěn)定性明顯提高，試驗(yàn)表明經(jīng)過30個(gè)批次的重復(fù)使用，其相對酶活依然可達(dá)初始酶活的55%以上。固定化酶4°C保存14 個(gè)月后活力還在80%以上，說明固定化后a-CGTase有較好的貯存穩(wěn)定性。3)與游離酶相比，使用固定化酶對底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，淀粉轉(zhuǎn)化生成環(huán)糊精的時(shí)間明顯縮短從原來的24h縮短到2~3h。
[0016]3、本發(fā)明采用無溶劑過程生產(chǎn)α-環(huán)糊精，采用固定化酶液化淀粉，通過填充式反應(yīng)器進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)液通過超濾膜機(jī)組不斷收集產(chǎn)品，并通過反滲透膜濃縮樣品，低溫結(jié)晶過濾后得到產(chǎn)品，整個(gè)反應(yīng)過程條件溫和，無任何有機(jī)溶劑，所用生產(chǎn)設(shè)備簡單，可連續(xù)化生產(chǎn)。傳統(tǒng)的添加有機(jī)溶劑的方法，需要液化罐、蒸餾罐、高效旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)薄膜器等，并要通往飽和的高壓水蒸汽和1-癸醇，反應(yīng)條件劇烈，能耗高，溶劑易殘留污染。
[0017]4、本發(fā)明采用固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶處理反應(yīng)液，一方面降解未轉(zhuǎn)化的淀粉，同時(shí)增加了反應(yīng)液的濾過性，另一方面避免反應(yīng)過程中酶的滅活操作。精制過程中加入活性炭脫色，再經(jīng)過0.45 μ m、0.22 μ m濾膜過濾，然后再進(jìn)行反滲透系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，在5°C~15°C進(jìn)行結(jié)晶過濾除去少量的β -環(huán)糊精，繼續(xù)反滲透濃縮至40%~50%時(shí)，O~5°C進(jìn)行結(jié)晶過濾制得α -環(huán)糊精，烘干研磨得最終成品，純度達(dá)99.9%以上，滿足美國藥典USP36中注射級藥用輔料α -環(huán)糊精的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0019]圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
[0020]圖2為本發(fā)明的淀粉轉(zhuǎn)化和精制純化的原理示意圖；
圖中，I填充反應(yīng)柱，2 a -CGTase固定化酶，3液化儲(chǔ)罐，4超濾膜機(jī)組，5固定化淀粉酶與固定化糖化酶，6恒流泵，7反應(yīng)釜，8砂芯漏斗，9反滲透膜機(jī)組，10結(jié)晶儲(chǔ)罐，11儲(chǔ)液罐。
[0021]圖3為a -CGTase固定化酶操作穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn)批次與酶活關(guān)系圖。
[0022]圖4為本發(fā)明的注射級α -環(huán)糊精的HPLC色譜圖。
【具體實(shí)施方式】[0023]下面用具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限定本專利。
[0024]實(shí)施例一:
步驟1:
取基因工程菌疋coli BL21 (DE3)/pet24a (+)(中國典型微生物保藏中心，CCTCCM208063)接種于LB培養(yǎng)基中，30~37°C培養(yǎng)6~12h后，轉(zhuǎn)至TB培養(yǎng)基中，30~37 °C培養(yǎng)2~6h后，加入0.01%的IPTG并降溫至20~28 V培養(yǎng)30~36h得到發(fā)酵液。取發(fā)酵液，經(jīng)高速冷凍離心機(jī)6000rpm離心20min后得上清液。取上清液按文獻(xiàn)ASpectrophotometric Assay for the Cyclization Activity of Cyclomaltohexaose(a -Cyclodextrin) Glucanotransferase 方法測定酶活，以環(huán)化活力計(jì)為 50U/ml。
[0025]取上清液，調(diào)節(jié)超濾膜機(jī)組膜前壓力為IMPa，膜后壓力為0.4MPa，下進(jìn)入超濾膜過濾系統(tǒng)(超濾膜截留孔徑為10000)，工作溫度30°C~40°C，水和一些小分子物質(zhì)通過膜，而α-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶被截留并返回料液罐進(jìn)一步濃縮，直至料液呈漿狀。檢測其酶活為 50000U/ml。
[0026]步驟2:
稱取IOg Eupergit C25tllj(多孔丙烯酸微球，由甲基丙烯酰氨，N, N,-亞甲基-雙-(甲基丙烯酰氨)縮水甘油甲基丙烯酸酯形成的含有環(huán)氧官能團(tuán)的聚合物，孔徑為100~250 μ m，德國Rohm Pharma公司產(chǎn)品),加入pH6.5的磷酸緩沖液100mL浸泡至溶脹。加入步驟I中得到的濃縮粗酶液20ml ，30°C水浴搖床中反應(yīng)6至15小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為50至200rpm。反應(yīng)完成后，4000rpm離心20min,棄上清液,加入50ml 2%~5%的巰基乙醇封閉剩余的環(huán)氧基團(tuán)，充分反應(yīng)10~15h后過濾，磷酸緩沖液洗滌，沖洗巰基乙醇及游離的未固定的酶，直至洗出液無酶活性，即得固定化α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，4°C保存。測定固定化后的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活，與原酶液對比，計(jì)算酶的酶活力回收率為55.54%。取固定化酶進(jìn)行操作穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如附圖4所示，從圖可以看出，經(jīng)過30個(gè)批次的重復(fù)使用，其相對酶活依然可達(dá)初始酶活的55%以上。
[0027]步驟3:
取食品級馬鈴薯淀粉，加入水后調(diào)成濃度為15%的馬鈴薯淀粉乳，置于分批攪拌罐反應(yīng)器中，加入0.02%的CaCl2，維持溫度在40°C~55°C之間，加入步驟2中的固定化酶攪拌反應(yīng)。當(dāng)?shù)矸廴樽兂吻鍟r(shí)，每隔IOmin取樣檢測液化淀粉的D.E值(反應(yīng)液中還原糖量/干物質(zhì)量)，檢測結(jié)果如下表，當(dāng)達(dá)到2.4~4.5時(shí)用碘顯本色時(shí)即停止液化。經(jīng)外觀檢查，馬鈴薯淀化液呈淡黃色，液化完全，流動(dòng)性較好，無淀粉固體殘留。經(jīng)4000rpm離心20min后，上清液即為轉(zhuǎn)化完全的馬鈴薯淀粉，固體即為回收的固定化酶，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗后于4°C保藏。
[0028]表1液化淀粉的D.E值檢測結(jié)果表
【權(quán)利要求】
1.一種注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (a)a -CGTase產(chǎn)生菌的誘導(dǎo)表達(dá): a-CGTase產(chǎn)生菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后離心，收集上清液即為粗酶液；粗酶液經(jīng)過超濾濃縮得到濃縮粗酶液； (b)a -CGTase固定化酶的制備: 將環(huán)氧基樹脂加入磷酸緩沖溶液浸泡至溶脹后，加入上述濃縮粗酶液，經(jīng)振蕩固定化反應(yīng)后離心，棄去上清液，加入巰基乙醇封閉剩余的環(huán)氧基團(tuán)，過濾，洗滌，直至洗出液無酶活性，即得a-CGTase固定化酶，4°C保存，備用； (C)淀粉的液化: 在分批攪拌罐中加入淀粉制成淀粉乳，加入CaCl2后，調(diào)整pH，加入a -CGTase固定化酶并攪拌反應(yīng)得到淀粉液化液； Cd)淀粉的轉(zhuǎn)化: 將a-CGTase固定化酶填充在填充反應(yīng)柱中，兩端用玻璃纖維塞隔離，擰緊兩端旋帽使填充反應(yīng)柱內(nèi)部呈密封狀態(tài)；將液化儲(chǔ)罐中的淀粉液化液用恒流泵輸入填充反應(yīng)柱進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；得到的轉(zhuǎn)化液經(jīng)超濾，透過液為α-環(huán)糊精溶液，截留液繼續(xù)打入填充反應(yīng)柱進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；α -環(huán)糊精溶液加入固定化α -淀粉酶和固定化糖化酶反應(yīng)，以除去未轉(zhuǎn)化的淀粉，并改善轉(zhuǎn)化液的濾過性；轉(zhuǎn)化液通砂芯漏斗過濾回收固定化α-淀粉酶和固定化糖化酶，濾液儲(chǔ)存于儲(chǔ)液罐中； Ce)精制純化: 濾液中加入活性炭攪拌后過濾，經(jīng)反滲透膜濃縮，5°C~15°C攪拌，待β-環(huán)糊精重結(jié)晶后，過濾棄晶體，母液經(jīng)過進(jìn)一步反滲透膜濃縮至α -環(huán)糊精含量在40%~50%時(shí)，(TC~5°C攪拌結(jié)晶得α-環(huán)糊精，烘干研磨即得注射級α-環(huán)糊精。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，所述α -CGTase產(chǎn)生菌為軟化芽孢桿菌iBaciIlus macerans )、嗜熱脂肪芽孢菌(B.StearothermophiIus)或產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，所述a-CGTase產(chǎn)生菌為基因工程菌疋co7i BL21 (DE3Vpet24a (W，中國典型微生物保藏中心保藏，保藏號(hào):CCTCCM208063。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(b)中，所述環(huán)氧基載體為環(huán)氧基樹脂Eupergit C25tllj。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(b)，所述的環(huán)氧基樹脂和酶在PH6~9的磷酸緩沖液中，4°C至室溫反應(yīng)2~24h，將酶固定于樹脂上，制成固載量為10~200mg酶/g樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(c)中，液化反應(yīng)控制ΡΗ5.0~7.0，反應(yīng)溫度40°C~70°C，控制液化D.E值為2.5~4.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(C)中，液化反應(yīng)控制ΡΗ6.5，反應(yīng)溫度55°C，控制液化D.E值為3.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(d)中，所述填充反應(yīng)柱的高徑比為6~9,反應(yīng)液流速為1.0ml/min~2.0ml/min,反應(yīng)溫度30°C~50°C，反應(yīng)時(shí)間IOmin~60min，固定化α -淀粉酶與固定化糖化酶的加入量為投料淀粉量干重的0.03%~0.05%，其中固定化α -淀粉酶與固定化糖化酶的酶活比為1:0.5~1:0.8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(e)中，加入活性炭3%~8% ;反滲透膜采用熱性螺旋反滲透膜，截留分子量為150~300，操作壓力為.3.5~5.5MPa，工作溫度為30°C~40°C，流速為20L/h。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的注射級α-環(huán)糊精的制備方法，其特征在于:步驟(e)中，加入活性炭5%，反滲透膜采用熱性螺旋反滲透膜，截留分子量為200，操作壓力為4.0MPa，工作溫度為35°C，流速為20L/h。
【文檔編號(hào)】C12P19/04GK103981238SQ201410248930
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月7日
【發(fā)明者】張穎, 劉鵬, 姜壽俊, 孫健, 高國銳, 劉元鑫, 孫劍峰, 王學(xué)斌, 葛慶燕, 閆飛, 劉駿, 郭鳳霞, 徐丹 申請人:濟(jì)南康和醫(yī)藥科技有限公司