水稻中胚軸伸長基因qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻中胚軸伸長基因qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用，利用“沈農(nóng)265”和“麗江新團黑谷”的重組自交系群體，對水和赤霉素溶液兩種培養(yǎng)條件下的中胚軸長度進行QTL定位，檢測到一個在兩種處理條件下都能夠控制中胚軸長度的主效QTL，命名為qML3。同時公開了qML3兩側(cè)的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記與qML3不僅緊密連鎖而且在植株后代與所述基因共分離，因而適于直播水稻品種的分子輔助培育。
【專利說明】水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用，屬于水稻育種中 的檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 胚軸是構(gòu)成種子和幼苗及其形態(tài)建成過程中的重要部分，它連接著胚根、胚芽、子 葉和禾本科植物的胚芽鞘，通常分為上胚軸（子葉節(jié)或胚芽鞘節(jié)至胚芽的一段）、中胚軸 (禾本科植物盾片節(jié)至胚芽鞘節(jié)的一段）和下胚軸（子葉節(jié)或禾本科的盾片節(jié)至胚根的一 段）。在水稻中，上胚軸基本不活動，下胚軸的伸長也極其有限，主要靠中胚軸的伸長將胚芽 連同伸長的胚芽鞘送至土表附近，以便幼苗吸收空氣中氧氣而進行隨后的正常生長。所以， 水稻中胚軸的伸長對直播水稻萌發(fā)后的幼苗生長至關(guān)重要，選育具有中胚軸伸長特性的品 種是直播技術(shù)推廣的重要前提。關(guān)于長中胚軸水稻資源的篩選已有部分報道。林建榮等研 究表明，中胚軸伸長特性受2對隱性基因控制，并與株高存在一定的連鎖關(guān)系。隨著以分子 標(biāo)記連鎖圖譜為基礎(chǔ)的QTL分析技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)已成為研究復(fù)雜性狀遺傳機理的主要 手段之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是設(shè)計和開發(fā)位于qML3兩側(cè)的特異性分子標(biāo) 記，將這個分子標(biāo)記命名為qML3_l和qML3_2,所述片段如序列表SEQ ID N0 : 1和SEQ ID NO :2所不。具體地，本發(fā)明設(shè)計開發(fā)的分子標(biāo)記的核苷酸序列如 下：qML3-l 的上游弓丨物序列為：5, -CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3' ；qML3-l 的 下游引物序列為：5' -GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3' ；qML3-2的上游引物序列為： 5'-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3' ；qML3-2 的下游引物序列為：5'-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3'。
[0004] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：根據(jù)前期定位結(jié)果，分別測定了麗江新團黑谷和沈農(nóng) 265的目標(biāo)區(qū)域，并進行了比對分析，挑選出一對微衛(wèi)星差異，并設(shè)計出該標(biāo)記。將此標(biāo)記 應(yīng)用于麗江新團黑谷和沈農(nóng)265進行驗證，發(fā)現(xiàn)具有qML3的沈農(nóng)265在利用qML3_l檢測 時，能夠擴增出190bp左右的條帶，而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp左右的條帶。在利用 qML3_2檢測時，沈農(nóng)265能夠擴增出210bp左右的條帶，而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp 左右的條帶。并進一步對重組自交系進行驗證，發(fā)現(xiàn)這兩個該分子標(biāo)記與qML3共分離。綜 上，此分子標(biāo)記可以用于鑒定待測材料是否在qML3座位上含有沈農(nóng)265的中胚軸的增效等 位基因。
[0005] -種水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用，應(yīng)用下述步驟檢測待測材料 是否在qML3座位上含有沈農(nóng)265的中胚軸增效等位基因，具體過程為：
[0006] (l)DNA提取，具體過程為：
[0007] (la)取長至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉 末，置于1. 5ml的微量離心管（EP)中。
[0008] (lb)力卩入預(yù)熱至 65 °C 的 CTAB 抽提液[2 % (w/v)CTAB ;100mmol/LTris-Hcl， ρΗ8· 0 ;20mmol/LEDTA，ρΗ8· 0 ;1.4mol/LNaCl]600μ L。
[0009] (lc)輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態(tài)，放于60°C的水浴30_60min，期間每 5min輕輕倒轉(zhuǎn)離心管使之分散均勻。
[0010] (Id)取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，室溫振蕩，充分 混勻，然后于臺式冷凍離心機上l〇〇〇〇rpm離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。
[0011] (le)重復(fù)3-4次，直至中間沒有蛋白層為止。
[0012] (If)將上清液逐滴加入2倍體積的-20°C預(yù)冷的無水乙醇中，_20°C放置30min以 上。
[0013] (lg)此時可見DNA成棉絮狀小團漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去 殘液，在超凈工作臺上吹干。
[0014] (lh)用 100μ L 的 TE 緩沖液（10mmol/LTris-Hcl ;lmmol/LEDTA，pH8. 0)回溶待用。
[0015] (li)取 1.5yL用于 PCR擴增。
[0016] (2)進行PCR擴增，其條件為：PCR反應(yīng)體系為15 μ L，含50mM KC1，10mM Tris-HCl(pH8. 8),0. 1% Triton-X, 1.5mM MgC12,200yM each of dNTPs,0. 2μΜ of each primer, 5 % (v/v)dimethyl sulfoxide 和 0.5U Taq DNA 聚合酶。應(yīng)用美國 AB 公司的 ABI-9700進行擴增，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ;每個循環(huán)94°C預(yù)變性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30個循環(huán)；最后72°C延伸8min。
[0017] (3)PCR產(chǎn)物檢測，其條件為：擴增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，取8yL上樣于3. 5%的 瓊脂糖凝膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時，或利用5% PAGE凝膠電泳45min，利用凝膠 成像系統(tǒng)成像觀察。
[0018] 該發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明利用"沈農(nóng)265"和"麗江新團黑谷"的重組自交系 群體，對水和赤霉素溶液兩種培養(yǎng)條件下的中胚軸長度進行QTL定位。與其他研究者的結(jié) 果比較發(fā)現(xiàn)，主效基因 qML3在不同群體、不同環(huán)境下重演性很好，可以作為基因克隆的首 選目標(biāo)。本發(fā)明在兩個不同環(huán)境下檢測qML3的加性效應(yīng)值分別為0. 29和0. 41，貢獻率分 別為24. 97%和33. 36%。本發(fā)明公開了兩個水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標(biāo)記，所述 分子標(biāo)記與水稻中胚軸伸長基因 qML3不僅緊密連鎖而且在植株后代與所述基因共分離， 因而為篩選適于直播水稻品種和分子標(biāo)記輔助育種提供了一條很好的途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明實施例中qML3_l分子標(biāo)記的檢測結(jié)果示意圖。
[0020] 圖2是本發(fā)明實施例中qML3_2分子標(biāo)記的檢測結(jié)果示意圖。
[0021] 圖中標(biāo)記說明：M :分子標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)；1 :沈農(nóng)265 ;2 : _江新團黑谷；3_12 :長中胚軸 株系；13-22 :短中胚軸株系。

【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發(fā) 明。
[0023] 實施例
[0024] 本發(fā)明所采用的標(biāo)記為，設(shè)計和開發(fā)位于qML3兩側(cè)的特異性分子標(biāo) 記，將這個分子標(biāo)記命名為qML3_l和qML3_2,所述片段如序列表SEQ ID N0 : 1和SEQ ID NO :2所不。具體地，本發(fā)明設(shè)計開發(fā)的分子標(biāo)記的核苷酸序列如 下：qML3-l 的上游引物序列為：5' -CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3' ；qML3-l 的 下游引物序列為：5' -GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3' ；qML3-2的上游引物序列為： 5'-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3' ；qML3-2 的下游引物序列為：5'-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3'。
[0025] 根據(jù)定位結(jié)果，分別測定了麗江新團黑谷和沈農(nóng)265的目標(biāo)區(qū)域，并進行了比對 分析，挑選出一對微衛(wèi)星差異，并設(shè)計出該標(biāo)記。將此標(biāo)記應(yīng)用于麗江新團黑谷和沈農(nóng)265 進行驗證，發(fā)現(xiàn)具有qML3的沈農(nóng)265在利用qML3_l檢測時，能夠擴增出190bp左右的條帶， 而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp左右的條帶。在利用qML3_2檢測時，沈農(nóng)265能夠擴增 出210bp左右的條帶，而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp左右的條帶。并進一步對重組自 交系進行驗證，發(fā)現(xiàn)這兩個該分子標(biāo)記與qML3共分離。綜上，此分子標(biāo)記可以用于鑒定待 測材料是否在qML3座位上含有沈農(nóng)265的中胚軸的增效等位基因。
[0026] 本發(fā)明實施例中的水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用，應(yīng)用下述步驟 檢測待測材料是否在qML3座位上含有沈農(nóng)265的中胚軸增效等位基因，具體過程為：
[0027] (l)DNA提取，具體過程為：
[0028] (la)取長至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉 末，置于1. 5ml的微量離心管（EP)中。
[0029] (lb)加入預(yù)熱至 65 °C 的 CTAB 抽提液[2 % (w/v)CTAB ;100mmol/LTris-Hcl， ρΗ8· 0 ;20mmol/LEDTA，ρΗ8· 0 ;1.4mol/LNaCl]600μ L。
[0030] (lc)輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態(tài)，放于60°C的水浴30-60min，期間每 5min輕輕倒轉(zhuǎn)離心管使之分散均勻。
[0031] (Id)取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，室溫振蕩，充分 混勻，然后于臺式冷凍離心機上l〇〇〇〇rpm離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。
[0032] (le)重復(fù)3-4次，直至中間沒有蛋白層為止。
[0033] (If)將上清液逐滴加入2倍體積的_20°C預(yù)冷的無水乙醇中，_20°C放置30min以 上。
[0034] (lg)此時可見DNA成棉絮狀小團漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去 殘液，在超凈工作臺上吹干。
[0035] (lh)用 100μ L 的 TE 緩沖液（10mmol/LTris-Hcl ;lmmol/LEDTA，pH8. 0)回溶待用。
[0036] (li)取 1.5yL用于 PCR擴增。
[0037] (2)進行PCR擴增，其條件為：PCR反應(yīng)體系為15 μ L，含50mM KC1，10mM Tris-HCl(pH8. 8),0. 1% Triton-X, 1.5mM MgC12,200yM each of dNTPs,0. 2μΜ of each primer, 5 % (v/v)dimethyl sulfoxide 和 0.5U Taq DNA 聚合酶。應(yīng)用美國 AB 公司的 ABI-9700進行擴增，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ;每個循環(huán)94°C預(yù)變性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30個循環(huán)；最后72°C延伸8min。
[0038] (3)PCR產(chǎn)物檢測，其條件為：擴增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，取8μ L上樣于3. 5%的 瓊脂糖凝膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時，或利用5% PAGE凝膠電泳45min，利用凝膠 成像系統(tǒng)成像觀察。如圖1所示為qML3_l分子標(biāo)記的檢測結(jié)果，能夠擴增出190bP條帶的 株系具有qML3基因。如圖2所示為qML3-2分子標(biāo)記的檢測結(jié)果，能夠擴增出210bP條帶 的株系具有qML3基因。
[0039] 以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為 本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用，其特征在于：設(shè)計和開發(fā) 位于qML3兩側(cè)的特異性分子標(biāo)記，將這個分子標(biāo)記命名為qML3_l和qML3_2，所述 片段如序列表SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所設(shè)計開發(fā)的分子標(biāo)記的核苷酸 序列如下：qML3-l 的上游引物序列為：5' -CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3' ；qML3-l 的下游引物序列為：5' -GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3' ；qML3-2的上游引物序列為： 5'-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3' ；qML3-2 的下游引物序列為：5'-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用，其特征在于： 采用上述分子標(biāo)記，分別測定了麗江新團黑谷和沈農(nóng)265的目標(biāo)區(qū)域，并進行了比對分析， 挑選出一對微衛(wèi)星差異，并設(shè)計出該標(biāo)記；將此標(biāo)記應(yīng)用于麗江新團黑谷和沈農(nóng)265進行 驗證，發(fā)現(xiàn)具有qML3的沈農(nóng)265在利用qML3_l檢測時，能夠擴增出190bp的條帶，而麗江 新團黑谷能夠擴增出200bp的條帶；在利用qML3_2檢測時，沈農(nóng)265能夠擴增出210bp的 條帶，而麗江新團黑谷能夠擴增出200bp的條帶；并進一步對重組自交系進行驗證，發(fā)現(xiàn)這 兩個該分子標(biāo)記與qML3共分離；此分子標(biāo)記能用于鑒定待測材料是否在qML3座位上含有 沈農(nóng)265的中胚軸的增效等位基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻中胚軸伸長基因 qML3的分子標(biāo)記與應(yīng)用，其特征在于： 采用下述步驟檢測待測材料是否在qML3座位上含有沈農(nóng)265的中胚軸增效等位基因，具體 過程為： (l)DNA提取，具體過程為： (la) 取長至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉末，置 于1. 5ml的微量離心管（EP)中； (lb) 加入預(yù)熱至 65°C 的 CTAB 抽提液[2% (w/v)CTAB ;100mmol/LTris-Hcl，ρΗ8· 0 ; 20mmol/LEDTA，ρΗ8· 0 ;1·4mol/LNaCl]600 μ L ; (lc) 輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態(tài)，放于60°C的水浴30-60min，期間每5min 輕輕倒轉(zhuǎn)離心管使之分散均勻； (ld) 取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，室溫振蕩，充分混勻， 然后于臺式冷凍離心機上l〇〇〇〇rpm離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； (le) 重復(fù)3-4次，直至中間沒有蛋白層為止； (lf) 將上清液逐滴加入2倍體積的-20°C預(yù)冷的無水乙醇中，_20°C放置30min以上； (lg) 此時可見DNA成棉絮狀小團漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去殘液， 在超凈工作臺上吹干； (lh) 用 100μ L 的 TE 緩沖液（10mmol/LTris-Hcl ;lmmol/LEDTA，ρΗ8· 0)回溶待用； (li) 取1.5yL用于PCR擴增； ⑵進行PCR擴增，其條件為：PCR反應(yīng)體系為15μ L，含50mM KC1，10mM Tris-HCl(pH8. 8),0. 1% Triton-X, 1.5mM MgC12,200yM each of dNTPs,0. 2μΜ of each primer，5 % (v/v)dimethyl sulfoxide 和 0.5U Taq DNA 聚合酶；應(yīng)用美國 AB 公司的 ABI-9700進行擴增，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ;每個循環(huán)94°C預(yù)變性lmin，550°C退火 lmin，72°C延伸2min，30個循環(huán)；最后72°C延伸8min ; (3) PCR產(chǎn)物檢測，其條件為：擴增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，取8 μ L上樣于3. 5%的瓊脂 糖凝膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時，或利用5% PAGE凝膠電泳45min，利用凝膠成像 系統(tǒng)成像觀察。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152441SQ201410239095
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】姜樹坤, 張鳳鳴, 白良明, 孫世臣, 劉丹, 張喜娟, 王嘉宇, 丁國華, 王彤彤, 姜輝 申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所