一種熒光蛋白marker的制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光蛋白marker的制備，根據(jù)所需蛋白marker的大小選擇含帶不同融合標(biāo)簽的載體，引物序列視質(zhì)粒和插入序列的設(shè)計(jì)而定，長度控制在20bp左右；酶切位點(diǎn)依據(jù)不同的質(zhì)粒及GFP基因片段序列而定；將構(gòu)建的質(zhì)粒分別常規(guī)轉(zhuǎn)化,按照廠商推薦的方法分別誘導(dǎo)表達(dá)不同大小的GFP重組蛋白并純化，即可得到28KD~80KD的熒光蛋白marker，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。本發(fā)明通過重組構(gòu)建含GFP開放框和不同大小融合標(biāo)簽表達(dá)載體，分別誘導(dǎo)表達(dá)、純化后，根據(jù)需要選擇不同大小GFP蛋白混合后制備出的綠色熒光proteinmarker，批間重復(fù)性完全可以保障，保證了實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)性。
【專利說明】—種熒光蛋白marker的制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種熒光蛋白marker的制備，本發(fā)明還涉及該突光蛋白marker的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)組(Proteome)是指由一個(gè)基因組(genome),或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)(Protein)。蛋白質(zhì)組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變。在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可以多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進(jìn)行翻譯后的修飾。故一個(gè)蛋白質(zhì)組不是一個(gè)基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時(shí)可以超過基因組的數(shù)目。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)處于早期“發(fā)育”狀態(tài)，這個(gè)領(lǐng)域的專家否認(rèn)它是單純的方法學(xué)，就像基因組學(xué)一樣，不是一個(gè)封閉的、概念化的穩(wěn)定的知識體系，而是一個(gè)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動(dòng)態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對基因表達(dá)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)較為復(fù)雜，包括蛋白質(zhì)分離、鑒定和信息分析三方面的內(nèi)容。其中，凝膠電泳是與分離和鑒定相對應(yīng)的核心技術(shù)之一。
[0003]聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(AP)，N, N, N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交聯(lián)形成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如 果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。SDS-PAGE可分為圓盤狀和垂直板狀、連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。在此過程中如何檢測目標(biāo)蛋白是否分離開，只能盲目的進(jìn)行，并進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。常用的蛋白質(zhì)染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染、熒光染色等，此類染色方法對需要活性的蛋白存在影響。而且，圓盤狀SDS-PAGE進(jìn)行洗脫目的蛋白時(shí)，需要實(shí)時(shí)監(jiān)測目標(biāo)蛋白遷移情況，以確定是否洗脫收集，非常耗費(fèi)人力。若有示蹤蛋白，則可以及時(shí)觀察目標(biāo)蛋白的遷移情況，及時(shí)結(jié)束SDS-PAGE或估算洗脫目標(biāo)蛋白的時(shí)間，可謂省事省力。目前在進(jìn)行SDS-PAGE時(shí)，可以使用預(yù)染marker (通過共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián))作為示蹤蛋白，但批間重復(fù)性無法保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種可用于蛋白質(zhì)分離的熒光蛋白marker的制備，本發(fā)明還提供該熒光蛋白作為示蹤蛋白的應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
本發(fā)明所述的突光蛋白marker的制備,包括下述方法:根據(jù)所需蛋白marker的大小選擇含帶不同融合標(biāo)簽的載體，如PET16b、PET32A、PET42A、MBP-Tag載體，GST-Tag載體等原核表達(dá)載體；引物序列視質(zhì)粒和插入序列(GFP基因開放框)的設(shè)計(jì)而定，長度控制在20bp左右；酶切位點(diǎn)依據(jù)不同的質(zhì)粒及GFP基因片段序列而定；將構(gòu)建的質(zhì)粒分別常規(guī)轉(zhuǎn)化E.Coli BL21DE3 (novagen),按照廠商推薦的方法分別誘導(dǎo)表達(dá)不同大小的GFP重組蛋白，并分別用Hitrap (novagen)常規(guī)純化不同大小的GFP重組蛋白，即可得到28HT80KD的熒光蛋白marker，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
[0006]如果制備80KD以上的熒光蛋白marker，可以選擇在28 KD~80 KD構(gòu)建的表達(dá)載體基礎(chǔ)上，繼續(xù)插入所需大小蛋白的目的基因(可以選擇GFP開放框的基因，也可以選擇任何開放框的基因片段)進(jìn)行融合表達(dá)；引物序列視質(zhì)粒和插入序列(所選目的基因)的設(shè)計(jì)而定，長度控制在20bp左右；酶切位點(diǎn)依據(jù)不同的質(zhì)粒及表達(dá)基因序列而定；將構(gòu)建的質(zhì)粒分別常規(guī)轉(zhuǎn)化E.Coli BL21DE3 (novagen),按照廠商推薦的方法分別誘導(dǎo)表達(dá)不同大小的GFP重組蛋白，并分別用Hitrap (novagen)常規(guī)純化不同大小的GFP重組蛋白，即可得到80KD以上的熒光蛋白marker，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
[0007]采用本方法制備的熒光蛋白marker作為示蹤蛋白的應(yīng)用:生產(chǎn)時(shí)，根據(jù)蛋白marker所需條帶大小,選擇純化后的相應(yīng)大小綠色突光protein marker進(jìn)行混合,分裝，即可作為蛋白marker的示蹤蛋白。
[0008]本發(fā)明通過重組構(gòu)建含GFP開放框和不同大小融合標(biāo)簽表達(dá)載體，分別誘導(dǎo)表達(dá)、純化后，根據(jù) 需要選擇不同大小GFP蛋白混合后制備出的綠色突光protein marker,批間重復(fù)性完全可以保障，保證了實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)性。
【具體實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明的制備方法可以通過下述具體實(shí)施例加以詳細(xì)說明。
[0010]1、綠色熒光蛋白基因序列的獲得
參照NCBI (序列號:ABE28521)中GFP序列，合成其讀碼框并分別在5’添加酶切位點(diǎn)Nde1-BamH1-SalI (5，一 3’)，3’添加酶切位點(diǎn) ECOR1-Hindlll-XhoI (5，一 3，)。
[0011]2、30KDGFP蛋白的表達(dá)和純化
采用常規(guī)分子生物學(xué)方法，將GFP閱讀框插入細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒PET30A (novagen)的NdeI和XhoI之間，得到細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒30KDGFP-PET30A。將該質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化E.Coli BL21DE3 (novagen)，按照廠商推薦的方法誘導(dǎo)表達(dá)30KDGFP重組蛋白，并用Hi trap (novagen)常規(guī)純化rRVFN重組蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
[0012]3、45KDGFP蛋白的表達(dá)和純化:
采用常規(guī)分子生物學(xué)方法，將GFP閱讀框插入細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒PET32A (novagen)的BamHI和HindiII之間，得到細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒45KDGFP-PET32A。將該質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化E.Coli BL21DE3 (novagen)，按照廠商推薦的方法誘導(dǎo)表達(dá)45KDGFP重組蛋白，并用Hitrap (novagen)常規(guī)純化45KDGFP重組蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
[0013]4、60KDGFP蛋白的表達(dá)和純化:采用常規(guī)分子生物學(xué)方法，將GFP閱讀框插入細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒PET42A (novagen)的BamHI和ECORI之間，得到細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒60KDGFP-PET42A。將該質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化E.Coli BL21DE3 (novagen)，按照廠商推薦的方法誘導(dǎo)表達(dá)60KDGFP重組蛋白，并用Hitrap (novagen)常規(guī)純化60KDGFP重組蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白
定量備用。
[0014] 5、90KDGFP蛋白的表達(dá)和純化
采用常規(guī)分子生物學(xué)方法，將GFP閱讀框插入細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒60KDGFP-PET42A(novagen)的SalI和HindIII之間，得到細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒90KDGFP-PET42A。將該質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化E.Coli BL21DE3 (novagen),按照廠商推薦的方法誘導(dǎo)表達(dá)rRVFN重組蛋白，并用Hitrap (novagen)常規(guī)純化90KDGFP重組蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
[0015]6、綠色突光蛋白marker的制備
將上述 2-5 中純化好的 30KDGFP, 45KDGFP, 60KDGFP, 90KDGFP,按照 1:2:2:1 (質(zhì)量t匕)混合(蛋白總濃度2mg/ml)，并加入終濃度10%甘油，分裝，即可得到綠色熒光蛋白marker, -20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0016]根據(jù)實(shí)際需要，參考上述2-6步驟，可以制備28HT180KD之間的熒光蛋白。條帶清晰，亮度類似，但配置不同濃度的條帶便于觀察。
[0017]將得到的綠色熒光蛋白marker與上樣緩沖液預(yù)先混合，直接凝膠上樣，無需煮沸。進(jìn)行SDS-PAGE時(shí),其中I孔直接加入IOul綠色突光protein marker,不需加loadingbuffer和加熱處理。
[0018]與膜兼容:Western blotting時(shí)綠色條帶將轉(zhuǎn)移到膜上應(yīng)用，監(jiān)測SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳期間蛋白的遷移，監(jiān)測Western blotting蛋白轉(zhuǎn)移到膜上的情況；測定SDS聚丙烯酰胺凝膠和Western blots上的蛋白分子量。
[0019]采用本發(fā)明方法制備的熒光蛋白marker進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳期間可隨時(shí)觀察樣品所處的位置，使用圓盤狀SDS-PAGE電洗脫回收目的蛋白時(shí)不需實(shí)時(shí)觀察，只需選擇合適大小的示蹤GFP蛋白，根據(jù)其遷移位置，及時(shí)進(jìn)行目的蛋白洗脫收集即可。
[0020]同時(shí)，本發(fā)明制備的熒光蛋白marker可用于監(jiān)測SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳期間蛋白的遷移；監(jiān)測Western blotting蛋白轉(zhuǎn)移到膜上的情況；測定SDS聚丙烯酰胺凝膠和Western blots上的蛋白分子量。
[0021]上述實(shí)例只是為了說明本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)，其目的是在于讓本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡是根據(jù)本
【發(fā)明內(nèi)容】
的實(shí)質(zhì)所作出的等效的變化，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種突光蛋白marker的制備,其特征在于:包括下述方法: 根據(jù)所需蛋白marker的大小選擇含帶不同融合標(biāo)簽的載體，引物序列視質(zhì)粒和插入序列的設(shè)計(jì)而定，長度控制在20bp左右；酶切位點(diǎn)依據(jù)不同的質(zhì)粒及GFP基因片段序列而定；將構(gòu)建的質(zhì)粒分別常規(guī)轉(zhuǎn)化，按照廠商推薦的方法分別誘導(dǎo)表達(dá)不同大小的GFP重組蛋白并純化，即可得到28HT80KD的熒光蛋白marker，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突光蛋白marker的制備,其特征在于:在構(gòu)建上述表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，繼續(xù)插入所需大小蛋白的目的基因進(jìn)行融合表達(dá)；引物序列視質(zhì)粒和插入序列的設(shè)計(jì)而定，長度控制在20bp左右；酶切位點(diǎn)依據(jù)不同的質(zhì)粒及表達(dá)基因序列而定；將構(gòu)建的質(zhì)粒分別常規(guī) 轉(zhuǎn)化，按照廠商推薦的方法分別誘導(dǎo)表達(dá)不同大小的GFP重組蛋白并分別安排純化，即可得到80KD以上的熒光蛋白marker，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
3.權(quán)利要求1或2制備的熒光蛋白marker作為示蹤蛋白的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/66GK103923939SQ201410197289
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】趙巧輝, 李桂林, 郭立攀, 李艷姣, 付光宇, 吳學(xué)煒 申請人:鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司