雙羰基還原酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雙羰基還原酶突變體及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明利用定點飽和突變獲得了催化活性等性質(zhì)得到改進的雙羰基還原酶突變體，并利用所述突變體制備3R，5S-雙羥基化合物，所獲得的3R，5S-二羥基化合物的ee值大于99％，de值為90％左右。本發(fā)明的雙羰基還原酶突變體為關(guān)鍵的藥物中間體，尤其是他汀類藥物的手性二羥基己酸鏈的合成提供了高效的催化劑，使3R，5S-二羥基化合物的工業(yè)生產(chǎn)成本得到大幅度降低。
【專利說明】雙羰基還原酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本 發(fā)明涉及雙羰基還原酶突變體及其應(yīng)用，具體而言，本發(fā)明涉及利用定點飽和突變獲得的催化活性等性質(zhì)得到改進的雙羰基還原酶突變體即利用所述雙羰基還原酶突變體制備3R，5S-雙羥基化合物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]羰基還原酶是一種氧化還原酶，在生物有機體的許多生物轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用?；谄淠艽呋a(chǎn)生高對應(yīng)選擇性的手性醇，羰基還原酶通常作為一種非常重要的生物催化劑應(yīng)用于化學(xué)和制藥工業(yè)中手性中間體的合成。而雙羰基還原酶能夠立體選擇性地將二酮酸酯的兩個羰基同時還原為相應(yīng)羥基，可以用于合成關(guān)鍵的藥物中間體，尤其是合成他汀類藥物的手性二羥基己酸鏈，如世界上暢銷的降膽固醇藥物阿托伐他汀(Atorvastatin,立普妥)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)。
[0003]目前已知的雙羰基還原酶可以作為生物催化劑，一步還原二酮底物，制備得到近乎單一光學(xué)純度的他汀類降血脂藥物關(guān)鍵手性中間體3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸叔丁酯，簡化了合成步驟，降低了生產(chǎn)污染。但是在工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用中，依然有一些問題需要進一步解決，如酶催化活性較低，使酶液的用量較大，且使反應(yīng)體系總體積增加，導(dǎo)致了生產(chǎn)批次和生產(chǎn)成本的增加。這些問題可以通過酶分子進化，提高雙羰基還原酶(DKR)的自身催化活性來解決。酶作為生物催化劑，在生物體內(nèi)能充分發(fā)揮其高效和高特異性的特點。但是在工業(yè)應(yīng)用中，卻普遍存在無法適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件和對非天然底物的催化能力低等問題。必須借助蛋白質(zhì)工程方法對酶分子進行改造以適應(yīng)不同的應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)工程方法可以概括為三種:理性設(shè)計(rational design)、非理性設(shè)計(irrational design)和半理性設(shè)計(sem1-rational design)。
[0004]理性設(shè)計是指在了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過定點突變(Site-directedMutagenesis)或其它方法改變蛋白質(zhì)分子中的個別氨基酸，從而產(chǎn)生新性狀的蛋白質(zhì)。這種方法在理論上針對性較強，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特異性、穩(wěn)定性、改變抑制劑類型、輔酶特異性等方面。
[0005]定點飽和突變技術(shù)是蛋白質(zhì)工程中的一門重要技術(shù)，屬于上述的半理性設(shè)計但又結(jié)合了理性設(shè)計和非理性設(shè)計的優(yōu)點，彌補了各自的不足，它通過對目的蛋白的編碼基因進行改造，短時間內(nèi)獲取靶位點氨基酸分別被其它19種氨基酸替代的突變體。此技術(shù)不僅是蛋白質(zhì)定向改造的強有力工具，而且是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一功能關(guān)系研究的重要手段。研究表明，多點突變往往能獲得比單點突變更為理想的進化體。多點突變是定點突變不易直接獲得的。而對于定點突變技術(shù)不能解決的這些問題，恰恰是定點飽和突變技術(shù)所擅長的獨特之處。
[0006]因此，如果能夠利用定點飽和突變技術(shù)改造雙羰基還原酶，提高其催化活性、底物特異性和/或穩(wěn)定性，就可以解決現(xiàn)有技術(shù)中如酶液用量較大、生產(chǎn)成本高等問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]因此，本發(fā)明的一個目的在于利用定點飽和突變技術(shù)改造雙羰基還原酶，提高其催化活性、底物特異性和/或穩(wěn)定性。
[0008]本發(fā)明的第一方面涉及一種雙羰基還原酶突變體，其含有選自如下所示的氨基酸序列之一:
[0009]a) SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:6 ；
[0010]b)與a)中所示序列具有至少70%同一性且具有改進的雙羰基還原酶活性的序列；或
[0011]c)a)中的序列經(jīng)刪除、添加和/或替換一個或多個氨基酸殘基而得到且具有改進的雙羰基還原酶活性的序列，
[0012]其中b)中所示的序列不是SEQ ID NO:7所示的序列。
[0013]在一個實施方案中，所述的雙羰基還原酶突變體含有如SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列。
[0014]在另一個實施方案中，所述的雙羰基還原酶突變體含有如SEQ ID NO:1、2或3所示的氨基酸序列。
[0015]在另一個實施方案中，所述的雙羰基還原酶突變體含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0016]本發(fā)明的第二方面涉及如上所述的雙羰基還原酶突變體的核苷酸編碼序列，其中該核苷酸編碼序列不含有SEQ ID NO:8所示的序列。
[0017]在一個實施方案中，所述核苷酸編碼序列含有如下所示的序列:
[0018]a) SEQ ID NO:9_14 所示的序列；
[0019]b)與a)所述的序列具有至少70%同一性且編碼具有改進的雙羰基還原酶活性的蛋白質(zhì)的序列；或
[0020]c)與a)所述的序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件雜交且編碼具有改進的雙羰基還原酶活性的蛋白質(zhì)的序列。
[0021 ] 本發(fā)明的第三方面涉及一種含有如上所述的核苷酸編碼序列的表達盒。
[0022]本發(fā)明的第四方面涉及一種含有有效連接其中的如上所述的核苷酸編碼序列的重組載體，優(yōu)選地，所述重組載體是重組表達載體。
[0023]本發(fā)明的第五方面涉及一種含有如上所述的重組載體的宿主細胞。
[0024]本發(fā)明的第六方面涉及一種生產(chǎn)3R，5S- 二羥基化合物的方法，其包括步驟:將如上所述的雙羰基還原酶突變體或如上所述的核苷酸編碼序列編碼的蛋白質(zhì)或利用如上所述的表達盒或如上所述的重組載體或如上所述的宿主細胞獲得的蛋白質(zhì)與二酮類化合物在使所述雙羰基還原酶發(fā)揮作用的條件下接觸一段時間， [0025]其中二酮類化合物為已經(jīng)在市場上商業(yè)化的原料或者容易制備的通式I的酮類化合物:
[0026]
OOO
R~產(chǎn)y觀2 (通式I)
[0027]其中，Rl選自芳香基、烷基、環(huán)烷基、烷基取代的芳香基、鹵素取代的芳香基、芳烷雜環(huán)基、環(huán)狀雜烷基或環(huán)狀雜燒化烷基；R2選自烷基、環(huán)烷基、齒烷基或齒環(huán)烷基。
[0028]在一個實施方案中，所述二酮類化合物選自6-芐氧基-3，5-二氧代-己酸叔丁酯、6-芐氧基-3，5- 二氧代-己酸新戊酯、6-芐氧基-3，5- 二氧代-己酸甲酯、6-芐氧基-3，5-二氧代-己酸乙酯。
[0029]換言之，本發(fā)明以紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis) SK121菌株的雙擬基還原酶(DKR)基因(如SEQ ID N0:7所示)為出發(fā)基因，進行基因突變，通過定向篩選的方法獲得酶活性提高的雙羰基還原酶突變體。
[0030]本發(fā)明的來源于紅串紅球菌SK121菌株的雙羰基還原酶的突變體的氨基酸序列含有如下序列:
[0031](I)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:突變位點為F231W:
[0032]MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVffVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG ；
[0033](2) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列:突變位點為I94V+F231W:
[0034]MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVG LTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG ；
[0035](3) SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列:突變位點為I94V+V151Q+F231W:
[0036]MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQMDWGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAV⑶GFYNYKG ；
[0037](4) SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列:突變位點為V239I+R257K:
[0038]MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDIVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG ；
[0039](5) SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列:突變位點為V151Q+R257K:
[0040]MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG ;或
[0041](6) SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列:突變位點為I94V+V151Q:
[0042]MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQMDWGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAV⑶GFYNYKG ；[0043]上述雙羰基還原酶突變體的編碼DNA序列包含以下DNA序列:
[0044](1)SEQ ID NO:9，其為SEQ ID NO:8所示的雙羰基還原酶基因序列中第691_693bp的TTC突變?yōu)門GG ；
[0045](2) SEQ ID N0:10，其為SEQ ID NO:8所示的雙羰基還原酶基因序列中第691-693bp 的 TTC 突變?yōu)?TGG，且第 280_282bp 的 ATT 突變?yōu)?GTT、GTC、GTA 或 GTG ；
[0046](3) SEQ ID N0:11，其為SEQ ID NO:8所示的雙羰基還原酶基因序列中第691-693bp 的 TTC 突變?yōu)?TGG，第 280_282bp 的 ATT 突變?yōu)?GTT、GTC、GTA 或 GTG，且第451-453bp 的 GTC 突變?yōu)?CAA 或 CAG ；
[0047](4) SEQ ID N0:12，其為SEQ ID NO:8所示的雙羰基還原酶基因序列中第715-717bp 的 GTC 突變?yōu)?ATT、ATC 或 ATA，且第 769_771bp 的 CGC 突變?yōu)?AAA 或 AAG ；
[0048](5) SEQ ID N0:13，其為SEQ ID NO:8所示的雙羰基還原酶基因序列中第451-453bp的GTC突變?yōu)镃AA或CAG，且第769_771bp的CGC突變?yōu)锳AA或AAG ;或
[0049](6) SEQ ID N0:14，其為SEQ ID NO:8所示的雙羰基還原酶基因序列中第451-453bp 的 GTC 突變?yōu)?CAA 或 CAG，且第 280_282bp 的 ATT 突變?yōu)?GTT、GTC、GTA 或 GTG。
[0050]利用本發(fā)明上述突變體制備3R，5S-雙羥基化合物，所獲得的3R，5S- 二羥基化合物的ee值大于99%，de值為90%左右。本發(fā)明的雙羰基還原酶突變體為關(guān)鍵的藥物中間體，尤其是他汀類藥物的手性二羥基己酸鏈的合成提供了高效的催化劑，使3R，5S-二羥基化合物的工業(yè)生產(chǎn)成本得到大幅度降低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1為本發(fā)明所涉及合成3R，5S_雙羥基化合物的化學(xué)反應(yīng)過程。
[0052]圖2為本發(fā)明所涉及合成3R，5S- 二羥基_6_芐氧基-己酸叔丁酯的化學(xué)反應(yīng)方程式。
[0053]圖3為本發(fā)明所涉及合成3R，5S- 二羥基_6_芐氧基-己酸新戊酯的化學(xué)反應(yīng)方程式。
[0054]圖4為結(jié)合NAD的雙羰基還原酶的三維結(jié)構(gòu)模擬圖。
[0055]圖5為標(biāo)出有效突變位點的雙羰基還原酶的三維結(jié)構(gòu)模擬圖。
【具體實施方式】
[0056]本申請采用定點飽和突變的方法對雙羰基還原酶(DKR)的基因進行突變，從而改變酶的氨基酸序列，實現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，再通過定向篩選的方法，得到酶活性大幅度提高的雙羰基還原酶突變體，酶活提高為雙羰基還原酶母本的2倍以上，甚至是3倍，從而大幅度降低了 3R，5S-二羥基化合物工業(yè)生產(chǎn)中的成本。在某些實施方案中，得到的產(chǎn)品的ee值大于99%，de值為90%左右。
[0057]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明的突變體在3R，5S_雙羥基化合物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，其雙羰基還原酶突變體的用量僅為出發(fā)基因編碼的雙羰基還原酶用量的34%，適用于工業(yè)應(yīng)用。
[0058]在一個實施方案中，本發(fā)明使用定點飽和突變技術(shù)，以來源于紅串紅球菌SK121菌株的雙羰基還原酶(DKR)基因為出發(fā)基因，進行基因突變，通過定向篩選的方法獲得酶活性提高的雙羰基還原酶突變體。本發(fā)明的雙羰基還原酶突變體的突變氨基酸殘基位于底物結(jié)合位點或與底物和NAD結(jié)合相關(guān)、與NAD質(zhì)子傳遞相關(guān)的的區(qū)域，例如194位于NAD結(jié)合區(qū)域，V151、F231、V239和R257四個氨基酸均處于底物結(jié)合位點附近，這些氨基酸的改變可能提高了底物結(jié)合的特異性，從而使酶的活性得到提高。本發(fā)明的實驗結(jié)果表明，單一的F231W突變即可顯著的提高雙羰基還原酶的活性。在F231W突變的基礎(chǔ)上，進一步引入I94V和/或V151Q突變可以進一步提高雙羰基還原酶的活性。R257K的突變與V239I或V151Q的突變組合也可以顯著提高雙羰基還原酶的活性。
[0059]上述得到的雙羰基還原酶突變體可以通過基因工程手段，將其基因連接到pET-22b (+)以及其它表達載體后在大腸桿菌中過量表達。經(jīng)過量表達的雙羰基還原酶突變體在SDS-PAGE上呈現(xiàn)的分子量約為30KD，在30°C，pH6.0條件下，可以一步還原3R，5S-雙羥基化合物的制備原料得到光學(xué)純度較高的3R，5S-雙羥基化合物。
[0060]本發(fā)明所述的3R，5S_雙羥基化合物的制備原料，可以為已經(jīng)在市場上商業(yè)化
的原料或者容易制備的麗類化合物
【權(quán)利要求】
1.一種雙羰基還原酶突變體，其含有選自如下所示的氨基酸序列之一:
a)SEQID NO:1 至 SEQ ID NO:6 ； b)與a)中所示序列具有至少70%同一性且具有改進的雙羰基還原酶活性的序列；或 c)a)中的序列經(jīng)刪除、添加和/或替換一個或多個氨基酸殘基而得到且具有改進的雙羰基還原酶活性的序列， 其中b)中所示的序列不是SEQ ID NO:7所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙羰基還原酶突變體，其含有如SEQID ΝΟ:1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙羰基還原酶突變體，其含有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的雙羰基還原酶突變體的核苷酸編碼序列，其中該核苷酸編碼序列不含有SEQ ID NO:8所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核苷酸編碼序列，其中所述核苷酸編碼序列含有如下所示的序列:
6.一種含有權(quán)利要求4或5所述的核苷酸編碼序列的表達盒。
7.一種含有有效連接其中的權(quán)利要求4或5所述的核苷酸編碼序列的重組載體，優(yōu)選地，所述重組載體是重組表達載體。
8.一種含有權(quán)利要求7所述重組載體的宿主細胞。
9.一種生產(chǎn)3R，5S- 二羥基化合物的方法，其包括步驟:將權(quán)利要求1-3任一項所述的雙羰基還原酶突變體或權(quán)利要求4或5所述的核苷酸編碼序列編碼的蛋白質(zhì)或利用權(quán)利要求6的表達盒或權(quán)利要求7的重組載體或權(quán)利要求8的宿主細胞獲得的蛋白質(zhì)與二酮類化合物在使所述雙羰基還原酶發(fā)揮作用的條件下接觸一段時間， 其中二酮類化合物為已經(jīng)在市場上商業(yè)化的原料或者容易制備的通式I的酮類化合物:
OOO

(通式 I) 其中，Rl選自芳香基、烷基、環(huán)烷基、烷基取代的芳香基、鹵素取代的芳香基、芳烷雜環(huán)基、環(huán)狀雜烷基或環(huán)狀雜燒化烷基；R2選自烷基、環(huán)烷基、齒烷基或齒環(huán)烷基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)3R，5S-二羥基化合物的方法，其中所述二酮類化合物選自6-芐氧基-3，5- 二氧代-己酸叔丁酯、6-芐氧基-3，5- 二氧代-己酸新戊酯、6-芐氧基-3，5- 二氧代-己酸甲酯、6-芐氧基-3，5- 二氧代-己酸乙酯。
【文檔編號】C12N9/02GK103966176SQ201410196920
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】洪浩, 詹姆斯·蓋吉, 高峰, 劉立輝, 于文燕, 劉芳, 郭莉娜, 張娜 申請人:凱萊英醫(yī)藥集團（天津）股份有限公司, 凱萊英生命科學(xué)技術(shù)(天津)有限公司, 天津凱萊英制藥有限公司, 凱萊英醫(yī)藥化學(xué)（阜新）技術(shù)有限公司, 吉林凱萊英醫(yī)藥化學(xué)有限公司