一種苯乙醛還原酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種催化活性提高的苯乙醛還原酶突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID：4、6或8所示。本發(fā)明所得的突變體Leu102Phe、Leu102Arg和Leu102Glu為活性提高的突變體，更適合于生物化工行業(yè)的應用。經(jīng)改造后的苯乙醛還原酶Leu102Phe、Leu102Arg和Leu102Glu突變體的活性有不同程度的提高，催化苯乙酮還原的活力為野生型苯乙醛還原酶的1.41、1.41和1.21倍，催化異丙醇氧化的活力為野生型苯乙醛還原酶的1.54、1.6和1.12倍。
【專利說明】一種苯乙醛還原酶突變體
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種可用作生物催化劑催化手性醇合成的苯乙醒還原酶(Phenyacetaldehyde Reductase, PAR)突變體。
【背景技術】
[0002]手性醇(Chiral Alcohols)是一類重要的合成中間體，其廣泛應用于精細化學、農(nóng)藥、液晶材料的合成，尤其是手性藥物的合成。以手性α-氯代芳香醇為例，單一光學活性的手性α-氯代芳香醇已被用于合成一系列具有生物活性的藥物，如抗抑郁藥物、抗糖尿病藥物、β腎上腺受體激動劑等。 [0003]利用羰基還原酶催化前手性酮羰基的不對稱還原是制備手性醇的常見方法，該方法因高效率、高立體選擇性、反應條件溫和、環(huán)保等優(yōu)點而受到廣泛的關注。然而，由于在應用過程中的底物通常和天然底物具有較大差異，大部分的醛酮羰基還原酶底物譜比較窄或催化一些重要手性醇合成的活力較低。以苯乙醛還原酶為例，其催化苯乙酮還原的活力僅為催化苯乙醛還原的 35% (App1.Environ.Microbiol.，1997，63(10):3783-3788)。較低的催化活性會降低反應的速度、產(chǎn)率和最終產(chǎn)量，同時隨著反應時間的延長酶的活性會進一步降低甚至失活。
[0004]利用定點突變等蛋白質(zhì)工程技術是對酶進行改造從而獲得性質(zhì)改善的突變體的有效手段。對酶的改造一般使用兩種手段，一種是進行隨機突變的定向進化，另一種是進行定點突變的理性改造。定向進化是在沒有足夠的酶的結(jié)構(gòu)和功能信息的情況下對酶進行隨機的突變建立突變體庫，然后通過大規(guī)模的篩選得到性質(zhì)改善的突變體。例如Andre等對來源于Candida parapsilosis的羰基還原酶亞基間相互作用區(qū)域的幾個環(huán)區(qū)進行了隨機突變，通過篩選得到的含A275S/L276Q雙點突變的突變體活力為野生型的1.4倍(J.Biotechnol.，2013，165(1):52-62)。理性改造則是在結(jié)構(gòu)與功能的關系的基礎上，對能夠影響功能的關鍵位點進行定點突變，從而實現(xiàn)精確的改造。如在Karla等對來源于Thermoanaerobacter ethanolicus的醇脫氧還原酶(TeSADH)結(jié)構(gòu)模型的基礎上進行了定點突變，得到的WllOA突變體能夠催化芳香酮的不對稱還原生成相應的手性醇，而野生型的 TeSADH 不能催化芳香酮的還原(Protein Eng.，Des.Sel.，2007，20(2):47-55)。
[0005]盡管酶改造在提高羰基還原酶酶活力方面取得了一些進步，但目前成功的例子并不多，尤其是通過定點突變的理性改造。隨著越來越多的羰基還原酶晶體結(jié)構(gòu)的解析，基于結(jié)構(gòu)和功能的理性改造將會繼續(xù)是手性醇生物不對稱合成領域的研究熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術不足，提供了一種催化活性提高的苯乙醛還原酶突變體，其氨基酸序列如其氨基酸序列如SEQ ID NO:4、6或8所示。
[0007]上述苯乙醛還原酶突變體為苯乙醛還原酶的氨基酸發(fā)生如下任意一種情況的突變:(1)苯乙醛還原酶的氨基酸序列中第102位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?br> (2)苯乙醛還原酶的氨基酸序列中第102位亮氨酸突變?yōu)榫彼幔?br> (3)苯乙醛還原酶的氨基酸序列中第102位亮氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?br> 其中，所述的苯乙醛還原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，基因序列如SEQ ID NO:I所示。
[0008]上述的苯乙醛還原酶突變體可作為催化劑用于手性化合物的合成，所述手性化合物優(yōu)選(R)-Q-氯代苯乙醇或(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
[0009]本發(fā)明還提供了編碼上述苯乙醛還原酶突變體的基因，其核苷酸序列序列如SEQIDN0:3、5 或 7 所示。
[0010]本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建上述苯乙醛還原酶突變體的基因工程菌的方法，具體包括如下步驟:
1)采用化學合成或PCR方法獲得編碼所述苯乙醛還原酶突變體的基因；
2)將步驟I)獲得的苯乙醛還原酶突變體基因連接至原核表達載體，得到重組表達載體，本發(fā)明中采用了的表達載體為pET_22b (+)，也可選用……。
[0011]3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)得到基因工程菌。 [0012]本發(fā)明要解決的另一個問題是提供一種應用上述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)苯乙醛還原酶及其突變體的方法，以構(gòu)建得到的產(chǎn)苯乙醛還原酶及其突變體的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，菌株在種子活化后接種到基本培養(yǎng)基，于37°C、220rpm條件下培養(yǎng)；當OD值為2_3時，將菌株轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基誘導蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。誘導過程中的使用的誘導劑為IPTG，誘導劑的濃度為 0.05-0.5mM。
[0013]所述的基本培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g。
[0014]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(IL):胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，氯化鋅
0.1g,甘油 5mL。
[0015]本發(fā)明采用定點突變技術將苯乙醛還原酶基因進行定點突變，克隆連接到原核表達載體pET-22b (+)后轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)，經(jīng)純化驗證得到可以產(chǎn)較好催化活性的苯乙醛還原酶突變體的重組大腸桿菌，得到苯乙醛還原酶突變體的催化活力為野生型苯乙醛還原酶的1.2-2.7倍。這為苯乙醛還原酶的應用提供了良好基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是實施例2中苯乙醛還原酶突變體上下游基因片段的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖，M:DNA Marker，泳道I~4:L102F突變體上下游基因片段，泳道6~9:L102R突變體上下游基因片段，泳道10~13:L102E突變體上下游基因片段。
[0017]圖2是實施例2中苯乙醛還原酶突變體基因重疊PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖，M =DNAMarker，泳道1:L102F突變體基因，泳道2:L102R突變體基因，泳道3:L102E突變體基因。
[0018]圖3是實施例4中苯乙醛還原酶突變體純化情況的SDS-PAGE電泳分析，泳道1:苯乙醛還原酶，泳道2:L102F突變體，泳道3:L102R突變體，泳道4:L102E突變體。
【具體實施方式】
[0019]根據(jù)下述實施例，可以更好地說明本發(fā)明。然而，專業(yè)人員容易理解，實施例所描述的具體物料配比、工藝條件及其結(jié)果等僅用于說明本發(fā)明，而不應當限制本發(fā)明。
[0020]實施例1:苯乙醛還原酶基因和重組表達載體的構(gòu)建。
[0021]根據(jù)苯乙醛還原酶的基因序列(SEQ NO:1)，采用化學合成的方法獲得野生型苯乙醛還原酶的基因序列，獲得的苯乙醛還原酶基因被連接至pET-22b(+)載體(購于Novogen公司)，獲得重組表達載體pET-PAR。
[0022]實施例2:苯乙醛還原酶突變體基因的構(gòu)建
本發(fā)明采用重疊PCR的方法對苯乙醛還原酶的第102位的亮氨酸進行氨基酸替換，首先以pET-PAR為模板分別利用含突變位點的引物與全長序列上下游引物通過PCR擴增反應獲得突變體上下游基因序列，然后突變體上下游引物通過重疊PCR獲得全長突變體基因序列。引物設計如下:
全長基因序列引物(酶切位點由下劃線標出，5’ -3’ ):
FL-F:CATATGAAGGCGATCCAGTACACG SEQ NO:9
FL-R: CTCGAGCAGACCAGGGACCAC SEQ NO: 10
定點突變引物(突變位點由下劃線標出，5’ -3’ ):
Leul02Phe
L102F-F:ATAGTTCTCTTCTCCTTGTGAGC SEQ NO:11
L102F-R:GCTCACAAGGAGAAGAGAACTATT SEQ NO:12
Leul02Arg
L102R-F:ATAGTTCTCCGCTCCTTGTGAGC SEQ NO:13
L102R-R:GCTCACAAGGAGCGGAGAACTATT SEQ NO:14
Leul02Glu
L102E-F:ATAGTTCTCGAATCCTTGTGAGC SEQ NO:15
L102E-R:GCTCACAAGGATTCGAGAACTATT SEQ NO:16
1.突變體基因上下游片段的獲得
PCR 反應條件:94 0C 4min ；94 °C Imin, 65 °C Imin, 72 °C Imin,進行 25 個循環(huán)；72°C IOmin。
[0023]PCR反應體系:
I)上游片段:總體積為25 μ L，其中ExTaq HS DNA聚合酶0.5U，IOXExTaq HS緩沖液
2.5 μ L，pET-PAR(質(zhì)粒模板，約30ng/ μ L) I μ L，F(xiàn)L-F (正向引物，25mM) I μ L，定點突變引物上游引物如L102F-F(反向引物，25mM) I μ L，dNTPs混合物I μ L，補ddH20 M 25 μ L0
[0024]2)下游片段:總體積為25 μ L，其中ExTaq HS DNA聚合酶0.5U，IOXExTaq HS緩沖液2.5 μ L，pET-PAR (質(zhì)粒模板，約30ng/μ L) I μ L，定點突變引物下游引物如L102F-R (正向引物，25mM) I μ L, FL-R(反向引物，25mM) I μ L, dNTPs 混合物 I μ L，補 ddH20 至 25μ L。
[0025]反應結(jié)束后用I %的瓊脂糖凝膠電泳對目的片段(306bp和744bp，圖1)進行回收。
[0026]2.突變體全長基因的獲得
PCR 反應條件-MV 4min ；94°C lmin,65°C lmin,72°C lmin，進行 5 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0027] PCR反應體系:總體積為25 μ L，其中ExTaq HS DNA聚合酶0.5U，IOXExTaq HS緩沖液2.5 μ L，突變體上游片段I μ L，突變體下游片段I μ L，dNTPs混合物I μ L，補ddH20至25 μ Lo
[0028]反應結(jié)束后在反應體系中分別加入FL-F (25mM)和FL-R (25mM)各I μ L對突變體全長基因序列進行擴增。
[0029]PCR 反應條件:94 °C 4min ；94 °C lmin, 65 °C lmin, 72 °C lmin,進行 25 個循環(huán)；72°C IOmin。
[0030] 反應結(jié)束后用I %的瓊脂糖凝膠電泳對目的片段(1050bp，圖2)進行凝膠回收。
[0031]實施例2:突變體重組表達載體的構(gòu)建
將上述的得到的突變體基因通過酶連接反應連接至PMD-19-T載體，得到重組克隆載體T-L102F、T-L102R、T-L102E和T-L102R。取得到的突變體重組克隆載體各5 μ L，分別與25 μ L的Ε.coli DH5 α感受態(tài)細胞(購于北京天根生物公司)混合，冰浴30min，42°C熱激lmin30S，冰浴2min ;加入500 μ L LB培養(yǎng)基后于37°C、220rpm培養(yǎng)Ih ;取培養(yǎng)Ih后的菌液約50 μ L涂布于含40 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12~16h，得到重組菌(分別含 T-L102F、T-L102R 和 T-L102E)。
[0032]挑取上述重組菌單菌落于含40 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C、220rpm培養(yǎng)12~16h后提取所含重組質(zhì)粒。
[0033]分別用NdeI 和 XhoI 雙酶切 T-L102F、T-L102R、T-L102E 和 pET_22b (+)，用 I %的瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產(chǎn)物中的突變體和表達載體片段進行凝膠回收，用T4-DNA連接酶連接膠回收得到的各突變體和表達載體片段，得到突變體重組表達載體PET-L102F、PET-L102R和pET-L102E。取得到的突變體重組克隆載體各5 μ L，分別與25 μ L的E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞(購于北京天根生物公司)混合，冰浴30min，42°C熱激lmin30S，冰浴2min ;加入500 μ L LB培養(yǎng)基后于37°C、220rpm培養(yǎng)Ih ;取培養(yǎng)Ih后的菌液約50 μ L涂布于含40 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12~16h，得到突變體重組菌E.coliBL21 (分別含 pET-L102F、pET_L102R 和 pET_L102E)。
[0034]實施例3:苯乙醛還原酶及其突變體的表達
挑取重組菌E.coliBL21 (含苯乙醛還原酶及其突變體的重組表達質(zhì)粒)于含40 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量轉(zhuǎn)接至含40 μ g/mL氨芐青霉素的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37°C、220rpm培養(yǎng)至OD6c?約為0.6~1.0時加入
0.3mM IPTG進行誘導，誘導條件為20°C、22rpm，誘導時間為20h。誘導表達結(jié)束后于4°C、4500g離心15min，棄上清后加入磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)重懸菌體待用。
[0035]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(IL):胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，氯化鋅0.1g,甘油5mL。
[0036]實施例4:苯乙醛還原酶及其突變體的純化
采用鎳離子金屬螯合親和層析對苯乙醛還原酶及其突變體進行純化。上述重懸后的菌體進行高壓破碎后菌體破碎液于12000g離心30min，將上清液加載于已用上述磷酸鉀緩沖液平衡好的HisTrapTM FF柱(GE Healthcare),利用AKTA Purifier全自動層析儀進行咪唑濃度階段洗脫，A泵為上述磷酸鉀緩沖液，B泵為含500mM咪唑的上述磷酸鉀緩沖液，洗脫條件為流速lmL/min。上樣完成后以7% B洗脫10個柱體積，7% -50% B洗脫15個柱體積，50% -100% B洗脫10個柱體積。含目的蛋白質(zhì)峰的樣品被收集起來進行超濾濃縮和緩沖液交換。以上操作均在4°C下進行。[0037]用SDS-PAGE分析苯乙醛還原酶及其突變體的純化情況，其中SDS-PAGE的膠濃度為12 %，90V的電壓進行樣品濃縮，130V的電壓進行樣品分離。SDS-PAGE結(jié)果表明苯乙醛還原酶及其突變體經(jīng)過純化后得到電泳純的蛋白質(zhì)樣品，電泳條帶顯示的分子量大小為40kD左右(圖3)。
[0038]實施例5:苯乙醛還原酶及其突變體催化還原反應的活力測定
苯乙醛還原酶及其突變體的酶活力采用光學偶聯(lián)法測定，即檢測340ηΜ(ε =6，220M^cm^)處吸光度的變化監(jiān)測NADH的減少，從而根據(jù)NADH量的變化計算得到酶的活力。ImL酶活反應體系為:3.0mM苯乙酮，0.27mM NADH溶于50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，加入適量的酶后于25°C反應lmin。單位酶活(U)定義:lmin內(nèi)消耗I μ M NADH生成NAD+所需要的酶量。蛋白質(zhì)濃度采用BCA法測定。實驗結(jié)果如表1所示。
[0039]表1苯乙醛還原酶及其突變體催化苯乙酮還原的活力 _
【權(quán)利要求】
1.一種催化活性提高的苯乙醛還原酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0:4、6或8所示。
2.如權(quán)利要求1所述的苯乙醛還原酶突變體作為催化劑在手性化合物合成中的應用。
3.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述手性化合物為(R)-C1-氯代苯乙醇或(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
4.編碼權(quán)利要求1所述的苯乙醛還原酶突變體的基因，其特征在于，其核苷酸序列序列如SEQ ID N0:3、5或7所示。
5.攜帶權(quán)利要求4所述基因的重組表達載體。
6.含有如權(quán)利要求5所述重組表達載體的工程菌。
7.構(gòu)建權(quán)利要求6所述基因工程菌的方法，其特征在于，具體包括如下步驟 采用化學全合成或PCR方法克隆編碼如權(quán)利要求4所述苯乙醛還原酶突變體的基因； 將步驟(1)獲得的突變體基因連接到原核表達載體，獲得重組表達載體； 將步驟(2)獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)得到基因工程菌。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表達載體為pET-22b(+)。
9.應用權(quán)利要求6所述的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)苯乙醛還原酶突變體的方法，其特征在于，將基因工程菌經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37°C、220rpm條件下培養(yǎng)至OD600值為0.6~1.0時，加入IPTG誘導苯乙醛還原酶突變體的表達。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，誘導過程中IPTG濃度維持在0.05~.0.5mM范圍內(nèi)。
【文檔編號】C12N9/02GK103923889SQ201410185390
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】陳依軍, 劉楠, 易登歡 申請人:中國藥科大學