一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案要點為：一株連香樹紅球菌Rhodococcuscercidiphylli，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCCNo.9067。本發(fā)明還公開了該連香樹紅球菌的篩選方法及其在降解亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明中連香樹紅球菌菌株的篩選方法操作簡單、快速，可用于被亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中，降解去除亞硝胺類物質(zhì)，對亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水進行生物處理，降低其健康安全風(fēng)險水平。
【專利說明】一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于飲用水中亞硝胺類物質(zhì)的微生物降解【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]飲用水消毒在保證生物安全性的同時，也產(chǎn)生一系列對人體危害的消毒副產(chǎn)物。在該過程中產(chǎn)生的亞硝胺類物質(zhì)(NitiOsamines)消毒副產(chǎn)物，由于具有致癌、致畸和致突變的作用，而且毒性遠遠高于常見的的鹵代消毒副產(chǎn)物(三鹵甲烷和鹵乙酸等)，因此引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注，已經(jīng)成為環(huán)境和健康研究領(lǐng)域的熱點問題。根據(jù)美國環(huán)保局(USEPA)的污染物風(fēng)險信息數(shù)據(jù)庫(Integrated Risk Information System, IRIS))和標準風(fēng)險評估方法外推得到10_6致癌風(fēng)險水平上飲用水中多種亞硝胺類物質(zhì)的閾值濃度低于20ng/L，美國EPA將其中6種物質(zhì)列入非控制性污染物檢測名單2 (UCMR 2)，并作為2008-2010年監(jiān)測的重點。
[0003]在飲用水生產(chǎn)過 程中，國內(nèi)外普遍采用預(yù)氧化技術(shù)降低后續(xù)處理單元的負荷，導(dǎo)致亞硝胺類物質(zhì)提前產(chǎn)生。由于此類物質(zhì)屬于高極性小分子有機物，因而水處理普遍采用的沙濾及活性炭過濾對其處理效果并不明顯。目前針對亞硝胺類物質(zhì)(主要是NDMA)有效的消減控制方面的研究主要有紫外及高級氧化技術(shù)(UV/H202，03/H202等)。但不同的處理方法存在處理水量相對較小、在后續(xù)的消毒單元中容易重新生成亞硝胺類物質(zhì)、經(jīng)濟成本過高及產(chǎn)生二次污染等問題。
[0004]與化學(xué)氧化及其它常規(guī)水處理方法相比，微生物處理法可以實現(xiàn)對特定污染物的定向去除，具有效果好、處理成本低、操作簡便、不添加任何外來化學(xué)物質(zhì)和避免化學(xué)處理引起的二次污染等特點，因此往往是污染物去除的首選技術(shù)。研究表明，大部分亞硝胺類物質(zhì)是可以生物降解的，可通過二次基質(zhì)代謝的途徑實現(xiàn)降解。到目前為止，針對亞硝胺類物質(zhì)的生物處理研究，國內(nèi)外未見在地下水或飲用水過濾單元中篩選出有效的降解菌株。因此，篩選針對亞硝胺類物質(zhì)的有效降解菌株并進行降解效果評價是生物處理技術(shù)的首要任務(wù)。為此，從自然界中篩選出對亞硝胺類物質(zhì)有高效降解能力的菌株，應(yīng)用于飲用水中亞硝胺類物質(zhì)的去除將具有實際的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用，該連香樹紅球菌菌株是從實際運行的飲用水處理工藝中篩選得到的，其能夠有效地降解多種亞硝胺類物質(zhì)，并且該菌株能夠有效降解飲用水氯胺消毒過程中出現(xiàn)的亞硝胺消毒副產(chǎn)物和被亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)，在飲用水凈化處理方面具有良好的應(yīng)用前
旦
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[0006]本發(fā)明提供的連香樹紅球菌iRhodococcus cercidiphylli )，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為:CGMCC N0.9067，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期:2014年04月16日。
[0007]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于包括以下步驟:(1)馴化富集培養(yǎng)，在生物活性炭流動馴化處理裝置的馴化柱中填充活性炭，該活性炭為飲用水處理廠連續(xù)運營三年以上的生物活性炭，飲用水處理廠的工藝依次為預(yù)氯化、混凝沉淀、生物活性炭濾池和氯消毒，生物活性炭流動馴化處理裝置的進水為飲用水處理廠生物活性炭濾池出水，并在生物活性炭濾池出水中加入亞硝胺類物質(zhì)調(diào)節(jié)進水的亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為10μ g/L，COD含量為1.0mg/L，用蠕動泵使進水在生物活性炭流動馴化處理裝置中循環(huán)流動，保持水力停留時間為20min，進水經(jīng)過活性炭吸附柱進行吸附和微生物降解處理，其中活性炭吸附柱的流速為10mL/min,活性炭吸附柱的總?cè)莘e為500mL,該生物活性炭流動馴化處理裝置于25°C連續(xù)運行2個月；(2)分離純化培養(yǎng)，采集生物活性炭流動馴化處理裝置中的活性炭與磷酸鹽緩沖液混合，制得菌懸液接種到液體富集培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，其中磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉的混合溶液，pH=7.3，液體富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)是避光條件，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下傳代培養(yǎng)3次，傳代培養(yǎng)時間為15天/次，所述液體富集培養(yǎng)基的成分以g/L計為:蛋白胨30，其余成分為超純水，液體富集培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min，將富集培養(yǎng)物接種于固體富集培養(yǎng)基上進行分離純化培養(yǎng)，其中固體富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)是避光條件，溫度為25°C，培養(yǎng)時間為2-3天/次，所述固體富集培養(yǎng)基的成分以g/L計為:蛋白胨30，瓊脂20，其成分為超純水，固體富集培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min ;(3)選擇性培養(yǎng)，將步驟(2)分離純化得到的純培養(yǎng)物接種到選擇性培養(yǎng)基中進行篩選，直到得到具有對亞硝胺類物質(zhì)具有降解能力的連香樹紅球菌，其中選擇性培養(yǎng)基為礦物鹽培養(yǎng)基，其成分以g/L計為:K2HPO4.3H20 4.25，NaH2PO4.H2O 1.00，MgSO4.7H20 0.20，F(xiàn)eSO4.7H20 0.012，MnSO4.H2O
0.003，ZnSO4.7H20 0.003，CoSO4.7H20 0.001, NH4Cl 2.0，其余成分為超純水，pH=7.3，培養(yǎng)溫度為20-30°C，該礦 物鹽培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min。
[0008]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌的篩選方法中，所述的步驟(1)中磷酸鹽緩沖液的配置方法為:在800mL超純水中加入8g NaCl, 0.2g KC1，1.44g磷酸氫二鈉和0.24g磷酸二氫鉀，用鹽酸調(diào)節(jié)pH=7.3，加水定容至lOOOmL，在121°C溫度下恒溫滅菌20min后于室溫保存，備用。
[0009]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌的篩選方法中，所述的步驟(3)中選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為25°C。
[0010]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌在降解亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用，主要通過以下方式實現(xiàn):(I)連香樹紅球菌濕細胞的制備，用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，25°c培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細胞；(2)取連香樹紅球菌濕細胞接種于含有亞硝胺類物質(zhì)的礦物鹽培養(yǎng)基中，在避光條件下于25°C對礦物鹽培養(yǎng)基中的亞硝胺類物質(zhì)進行降解，其中每IOOmL礦物鹽培養(yǎng)基中接種0.6g連香樹紅球菌濕細胞。
[0011]本發(fā)明所述的亞硝胺類物質(zhì)為亞硝基二甲胺(NDMA)、亞硝基二乙胺(NDEA)、亞硝基二丙胺(NDPA)、亞硝基吡咯烷(Npyr)和亞硝基二丁胺(NDBA)中的一種或多種。
[0012]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌在降解飲用水中亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用，主要通過以下方式實現(xiàn):(I)連香樹紅球菌濕細胞的制備，用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，25°c培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細胞；(2)取連香樹紅球菌濕細胞接種于飲用水中，在避光條件下于25°C對飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)進行降解，其中每IOOmL飲用水中接種0.6g連香樹紅球菌濕細胞，并且飲用水在接種連香樹紅球菌濕細胞之前用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)飲用水的pH=7.3。
[0013]將篩選的連香樹紅球菌進行遺傳學(xué)鑒定，所述遺傳學(xué)鑒定為提取菌株的DNA，進行序列測定，將測序結(jié)果提交NCBI基因文庫進行比對。
[0014]本發(fā)明涉及的連香樹紅球菌菌株具有以下特征:
1、連香樹紅球菌菌株適宜在中性偏堿性(PH7-8)的培養(yǎng)介質(zhì)中生長，適合的生長溫度為25°C左右，其細菌學(xué)形態(tài)特征為細胞呈扁平橢圓狀，大小為2.5-5.0ymX0.5-2.0ym,屬革蘭氏陽性，不生芽孢，無鞭毛；
2、連香樹紅球菌菌株在固體富集培養(yǎng)基的瓊脂平板上的菌落形態(tài)一致，培養(yǎng)3天的菌落中間呈淡紅黃色，濕潤，圓形，凸起，不透明，邊緣較為整齊；
3、16SrRNA基因序列特征為:連香樹紅球菌菌株的16S rRNA序列長度為1201bp。
[0015]本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明中連香樹紅球菌菌株的篩選方法操作簡單、快速；
2、本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌對亞硝胺類物質(zhì)具有較好的降解效果，特別是對于飲用水中痕量濃度(濃度為200ng/L)的亞硝胺類物質(zhì)在短時間內(nèi)的降解去除率范圍為38-80% ；
3、本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌用于處理飲用水中經(jīng)預(yù)氯化提前生成的亞硝胺類物質(zhì)，能有效降解NDMA，Npyr, NDEA, NDPA和NDBA 5種亞硝胺類物質(zhì)，提高飲用水的安全性；
4、本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌可用于被亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中，降解去除亞硝胺類物質(zhì)，對亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水進行生物處理，降低其健康安全風(fēng)險水平；
5、本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌菌株可投加于生物活性炭工藝單元，作為對亞硝胺類物質(zhì)進行生物降解的深度強化處理手段，方法簡單，運行及維護成本較低，在規(guī)?；幚韥喯醢奉愇镔|(zhì)中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌在培養(yǎng)基上的菌落圖，圖2是本發(fā)明連香樹紅球菌菌株的細胞形態(tài)圖，圖3是本發(fā)明實施例3中連香樹紅球菌對礦物鹽培養(yǎng)基中5種亞硝胺類物質(zhì)降解的質(zhì)量濃度變化曲線，圖4是本發(fā)明實施例3中連香樹紅球菌對被亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中5種亞硝胺類物質(zhì)降解的質(zhì)量濃度變化曲線。
【具體實施方式】
[0017]以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步詳細說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0018]實施例1菌株的分離與純化 1、培養(yǎng)基的制備(I)礦物鹽培養(yǎng)基
K2HPO4.3Η20:4.25.00g，NaH2PO4.H2O:1.00g，MgSO4.7H20:0.20g，F(xiàn)eSO4.7H20:0.012g,MnSO4.H2O:0.003g，ZnSO4.7H20:0.003g，CoSO4.7H20:0.0OlgjNH4Cl 2.0g，超純水 lOOOmL,
pH=7.3，礦物鹽培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘。
[0019](2)固體富集培養(yǎng)基
Tryptonye Soya Broth (Oxoid LTD, England) 30g,瓊脂 20g,超純水 1000mL,固體富集培養(yǎng)基使用前在121°C下恒溫滅菌20分鐘。
[0020]2、馴化富集培養(yǎng)
在生物活性炭流動馴化處理裝置進行微生物馴化富集培養(yǎng)，該馴化處理裝置中用水取自飲用水處理廠生物活性炭濾池出水，在水中加入NDMA，Npyr, NDEA, NDPA和NDBA5種亞硝胺物質(zhì)，活性炭為飲用水處理廠運營三年以上的生物活性炭。在馴化柱中填充活性炭，用蠕動泵使進水在馴化處理裝置中循環(huán)流動，保持水力停留時間20min，水流經(jīng)活性炭吸附柱，進行吸附和生物降解處理，其中馴化處理裝置在常溫(25°C)條件下連續(xù)運行2個月，活性炭吸附柱的流速為10mL/min，生物活性碳吸附柱的總?cè)莘e為500mL，進水的亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為10 μ g/L, COD含量為1.0mg/L。
[0021]稱取采集于生物活性炭流動馴化處理裝置中的生物活性炭10g，放入250mL三角瓶中，加入50mL磷酸鹽緩沖液，并加適量玻璃珠，置于振蕩器快速震蕩4-5h。所得到的生物膜懸液為附著生物膜懸液，取5mL所得生物膜懸液，接種于事先滅菌的250mL亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為1.0 μ g/L的礦物鹽培養(yǎng)基中，25°C避光培養(yǎng)7天，獲得第一代培養(yǎng)液，共傳代3次。
[0022]3、分離純化培養(yǎng)
將第三代培養(yǎng)液稀釋IO6倍后接種于固體富集培養(yǎng)基平板，放入恒溫培養(yǎng)箱中于25°C下培養(yǎng)3天。挑取平板上形成的單個菌落，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，進行分離培養(yǎng)，于25°C下培養(yǎng)3天后對平板培養(yǎng)物進行顯微鏡檢查，如果獲得的培養(yǎng)物菌種不純，則按上述方法挑取平板培養(yǎng)物劃線接種于平板分離、純化培養(yǎng)基中繼續(xù)純化，直到顯微鏡檢查結(jié)果表明為純菌為止，經(jīng)純化得到純連香樹紅球菌菌株。
[0023]實施例2連香樹紅球菌菌株的微生物學(xué)特性研究 1、菌落形態(tài)觀察
將分離純化培養(yǎng)得到的連香樹紅球菌單胞菌株劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，于25°C下培養(yǎng)至長出菌落，觀察菌落形態(tài)，結(jié)果如下表明菌株的菌落特征為:在固體富集培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3天的菌落直徑大小約為l_2mm，菌落呈圓形，凸起，不透明，中心呈淡紅黃色，邊緣整齊，如圖1所示。
[0024]2、細胞形態(tài)觀察
挑取在固體富集培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3天的菌株菌落，依次用戊二醛固定、磷酸鹽緩沖液(PH7.3)漂洗、梯度乙醇脫水、醋酸異戊酯處理以及二氧化碳臨界點干燥、噴金、將樣品放入觀察室后進行電鏡掃描，電鏡掃描結(jié)果如圖2，表明連香樹紅球菌呈扁橢圓狀，不生芽孢，無鞭毛，大小為 2.5-5.0umX0.5-2.0 μ m。
[0025]3、16S rRNA基因序列測定
將接種于液體富集培養(yǎng)基中的單胞菌株于25°C，ISOrpm培養(yǎng)3天后的單胞菌細胞收集后米用 DNA 提取試劑盒(FastDNA SPIN kit, Takara Biotechnology C0., Ltd.,Japanese)，提取單胞菌的DNA，送測序公司，進行測序，將測序結(jié)果在NCBI基因文庫(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/)上進行比對。其中，菌株的 16S rRNA (SEQ IDN0.1)序列長度為1210bp。
[0026]根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征，細胞形態(tài)特征以及其16S rRNA基因序列的比對結(jié)果，鑒定菌株屬于連香樹紅球菌Rhodococcus cercidiphylli。
[0027]實施例3連香樹紅球菌的應(yīng)用
1、制備連香樹紅球菌單胞菌單胞菌株的濕細胞
用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基上，25°C溫度下，培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮連香樹紅球菌濕細胞。
[0028]2、去除5種亞硝胺物質(zhì)試驗
挑取菌種連香樹紅球菌的濕細胞接種于礦物鹽培養(yǎng)基中，在避光條件下，于25°C進行培養(yǎng)，其中，每IOOmL礦物鹽培養(yǎng)基中接種0.6g濕細胞；礦物鹽培養(yǎng)基中的5種亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為200ng/L，檢測方法根據(jù)前期研究，采用超高液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS/MS)測定，測定接種前培養(yǎng)基和接種后第I天、3天、5天、7天、10天的礦物鹽培養(yǎng)基中5種亞硝胺類物 質(zhì)的質(zhì)量濃度值，測定結(jié)果如圖3所示。
[0029]連香樹紅球菌除了將接種的濕細胞后立即進行高壓蒸汽滅菌，即在121°C高壓下蒸汽滅菌20分鐘，使接種的連香樹紅球菌立即滅活之外，得到無生物活性的對照組，其余條件相同，測定接種前培養(yǎng)基和接種后第I天、3天、5天、7天、10天的相應(yīng)礦物鹽培養(yǎng)基中亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度。
[0030]測定結(jié)果表明:扣除空白對照，本發(fā)明中篩選的連香樹紅球菌對5種亞硝胺類物質(zhì)具有很好的降解效果，去除效率高，在接種量為0.6g連香樹紅球菌濕細胞/IOOmL礦物鹽培養(yǎng)基時，接種10天后飲用水中NDMA，NDEA, NDPA, Npyr和NDBA濃度分別降低至14.6%，52.3%，21.2%，51.5%和62%，說明連香樹紅球菌對5種亞硝胺類物質(zhì)的去除率分別為85.4%，47.7%, 78.8%, 48.5%和38%，進而表明礦物鹽培養(yǎng)基中亞硝胺類物質(zhì)的變化是由連香樹紅球菌引起的，且降解亞硝胺類物質(zhì)效率高，因此，連香樹紅球菌能夠有效地去除亞硝胺類物質(zhì)，可用于亞硝胺類物質(zhì)的降解。
[0031]3、去除亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)試驗
1)用接種環(huán)取連香樹紅球菌菌株的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基上，于25°C溫度下，培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細胞，備用；
2)將加入磷酸鹽緩沖液的飲用水高壓滅菌處理，飲用水的pH=7.3 ；
3)向飲用水中加入5種亞硝胺類物質(zhì)，使飲用水中每種亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為200ng/L ；
4)取滅菌后的飲用水500mL置于500mL棕色瓶中，接種連香樹紅球菌濕細胞，密封后在避光條件下，于25°C溫度下培養(yǎng)，每隔Ih震蕩lmin，降解飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)，接種量為每IOOmL的飲用水中加入0.6 g連香樹紅球菌濕細胞；
5)檢測方法根據(jù)前期研究，采用超高液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS/MS)測定接種后第I天、3天、5天、7天、10天的飲用水中亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，測定結(jié)果如圖4所示。[0032]測定結(jié)果顯示:在接種連香樹紅球菌之后，連香樹紅球菌從第三天開始顯著降解5種亞硝胺類物質(zhì)，飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度迅速下降，接種10天后飲用水中NDMA, NDEA, NDPA, Npyr和NDBA等5種亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別降低至25.6%，65.4%，
32.9%, 64.5%和69.3%，說明連香樹紅球菌對5種亞硝胺類物質(zhì)的降解率分別為74.4%，34.6%, 67.1%, 35.5%和30.7%，進而表明連香樹紅球菌對飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)具有較高的降解率。
[0033] 以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一株連香樹紅球菌Rhodococcus cercidiphylli,保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC N0.9067。
2.—種權(quán)利要求1所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于包括以下步驟:(1)馴化富集培養(yǎng)，在生物活性炭流動馴化處理裝置的馴化柱中填充活性炭，該活性炭為飲用水處理廠連續(xù)運營三年以上的生物活性炭，飲用水處理廠的工藝依次為預(yù)氯化、混凝沉淀、生物活性炭濾池和氯消毒，生物活性炭流動馴化處理裝置的進水為飲用水處理廠生物活性炭濾池出水,并在生物活性炭濾池出水中加入亞硝胺類物質(zhì)調(diào)節(jié)進水的亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為lOyg/L，COD含量為1.0mg/L，用蠕動泵使進水在生物活性炭流動馴化處理裝置中循環(huán)流動，保持水力停留時間為20min，進水經(jīng)過活性炭吸附柱進行吸附和微生物降解處理，其中活性炭吸附柱的流速為10mL/min，活性炭吸附柱的總?cè)莘e為500mL，該生物活性炭流動馴化處理裝置于25°C連續(xù)運行2個月；(2)分離純化培養(yǎng)，采集生物活性炭流動馴化處理裝置中的活性炭與磷酸鹽緩沖液混合，制得菌懸液接種到液體富集培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，其中磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉的混合溶液，pH=7.3，液體富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)是避光條件，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下傳代培養(yǎng)3次，傳代培養(yǎng)時間為15天/次，所述液體富集培養(yǎng)基的成分以g/L計為:蛋白胨30，其余成分為超純水，液體富集培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min，將富集培養(yǎng)物接種于固體富集培養(yǎng)基上進行分離純化培養(yǎng)，其中固體富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)是避光條件，溫度為25°C，培養(yǎng)時間為2-3天/次，所述固體富集培養(yǎng)基的成分以g/L計為:蛋白胨30，瓊脂20，其成分為超純水，固體富集培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min ；(3)選擇性培養(yǎng)，將步驟(2)分離純化得到的純培養(yǎng)物接種到選擇性培養(yǎng)基中進行篩選，直到得到具有對亞硝胺類物質(zhì)具有降解能力的連香樹紅球菌，其中選擇性培養(yǎng)基為礦物鹽培養(yǎng)基，其成分以g/L計為:K2HPO4.3H20 4.25，NaH2PO4.H2O 1.00，MgSO4.7H20 0.20，F(xiàn)eSO4.7H20 0.012，MnSO4.H2O0.003，ZnSO4.7H20 0.003，CoSO4.7H20 0.001, NH4Cl 2.0，其余成分為超純水，pH=7.3，培養(yǎng)溫度為20-30°C，該礦物鹽培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于:所述的步驟(1)中磷酸鹽緩沖液的配置方法為:在800mL超純水中加入8g NaCl, 0.2g KC1，1.44g磷酸氫二鈉和0.24g磷酸二氫鉀，用鹽酸調(diào)節(jié)pH=7.3，加水定容至lOOOmL，在121°C溫度下恒溫滅菌20min后于室溫保存，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于:所述的步驟(3)中選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為25°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于:所述的亞硝胺類物質(zhì)為亞硝基二甲胺、亞硝基二乙胺、亞硝基二丙胺、亞硝基吡咯烷和亞硝基二丁胺中的一種或多種。
6.權(quán)利要求1所述的連香樹紅球菌在降解亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要 求6所述的連香樹紅球菌在降解亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于主要通過以下方式實現(xiàn):(1)連香樹紅球菌濕細胞的制備，用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細胞；(2)取連香樹紅球菌濕細胞接種于含有亞硝胺類物質(zhì)的礦物鹽培養(yǎng)基中，在避光條件下于25°C對礦物鹽培養(yǎng)基中的亞硝胺類物質(zhì)進行降解，其中每IOOmL礦物鹽培養(yǎng)基中接種0.6g連香樹紅球菌濕細胞。
8.權(quán)利要求1所述的連香樹紅球菌在降解飲用水中亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的連香樹紅球菌在降解飲用水中亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于主要通過以下方式實現(xiàn):(I)連香樹紅球菌濕細胞的制備，用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細胞；(2)取連香樹紅球菌濕細胞接種于飲用水中，在避光條件下于25°C對飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)進行降解，其中每IOOmL飲用水中接種0.6g連香樹紅球菌濕細胞，并且飲用水在接種連香樹紅球菌濕細胞之前用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)飲用水的pH =7.3。
【文檔編號】C12N1/20GK103966127SQ201410173419
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】王萬峰, 郭彥玲, 朱春友, 黃耀, 樊靜, 張國慶, 宋琳琳, 潘峰 申請人:河南師范大學(xué)