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蚊媒病毒常溫收集、保存和檢測(cè)方法

文檔序號(hào):474980閱讀:429來(lái)源:國(guó)知局
蚊媒病毒常溫收集、保存和檢測(cè)方法
【專利摘要】蚊媒病毒常溫收集、保存和檢測(cè)方法,屬于病毒的收集、保存及檢測(cè)。本發(fā)明利用蚊蟲(chóng)吮吸糖液過(guò)程中唾液反吐同時(shí)排出病毒的生物學(xué)特性,把捕捉的蚊蟲(chóng)放入青霉素瓶中,并設(shè)計(jì)與蚊蟲(chóng)數(shù)量適應(yīng)的紗籠和一定濃度的糖液飽和滴加RNA保存液的濾紙,在常溫下以濾紙為病毒RNA載體收集病毒,于常溫保存載體7天內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),分析準(zhǔn)確,改變了冷鏈技術(shù)野外運(yùn)輸、攜帶和保存的麻煩,提高了病毒收集、保存效率,節(jié)省了人力物力。
【專利說(shuō)明】蚊媒病毒常溫收集、保存和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒的收集、保存及檢測(cè),特別是蚊媒病毒收集、保存及檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]媒介蚊蟲(chóng)攜帶的病原微生物中,病毒是引起嚴(yán)重疾病的主要的致病因而廣受關(guān)注,如乙腦病毒、登革熱病毒等。蚊蟲(chóng)監(jiān)測(cè)只是蚊媒病監(jiān)測(cè)的一個(gè)方面,要準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蚊媒病流行風(fēng)險(xiǎn),其中重要的是掌握媒介蚊蟲(chóng)攜帶病原微生物的種類和數(shù)量。目前對(duì)蚊媒病毒監(jiān)測(cè)的主要手段是對(duì)媒介蚊蟲(chóng)體內(nèi)的病毒進(jìn)行檢測(cè),該方法需要大量搜集蚊蟲(chóng),并要求有冷鏈技術(shù)來(lái)保存蚊蟲(chóng)體內(nèi)病毒的完整性,以帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒提取分離、血清學(xué)及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)等,或者進(jìn)行病毒RNA分析[Ritchie SA, et al.,2007]。在野外運(yùn)輸和攜帶上,冷鏈技術(shù)采用的液氮罐重量大,具有危險(xiǎn)且使用不方便;在檢測(cè)分析上,由于病毒RNA分析容易受蚊蟲(chóng)自身RNA干擾,病毒分離效率低,血清學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)靈敏度不高;同時(shí),搜集大量蚊蟲(chóng)進(jìn)行病毒分析是一 項(xiàng)費(fèi)力、費(fèi)錢的工作,因而,需要有新的技術(shù)來(lái)替代目前的蚊媒病毒監(jiān)測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明利用蚊蟲(chóng)取食過(guò)程中唾液反吐同時(shí)排出病毒的生物學(xué)特性,收集病毒,并將病毒RNA在常溫下保存于載體7天以上,完成實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),以提高病毒分離效率,節(jié)省人力和物力。
[0004]本發(fā)明的方法通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn),其步驟為:
(1)在疑似蚊媒致病病毒區(qū)域,捕捉30-200只同一種類或不同種類的蚊蟲(chóng)并逐一地放入青霉素小瓶中,過(guò)夜,饑餓后,待進(jìn)入步驟(2);
(2)按以下兩種方法之一收集病毒:
(a)室溫24~27°C下,把定性濾紙剪成3cm2若干份作為收集病毒的載體,每份濾紙中央標(biāo)記滴加RNA保存液的位置,取若干個(gè)干凈培養(yǎng)皿加10%蔗糖水,把醫(yī)用棉球浸泡在培養(yǎng)皿中,將濾紙放在棉球上,再在濾紙標(biāo)記位置滴加0.25ml RNA保存液,按每份濾紙30-70只蚊蟲(chóng)將步驟I)存活的蚊蟲(chóng)驅(qū)入放有培養(yǎng)皿的15~30cm3紗籠內(nèi),讓蚊蟲(chóng)取食,每天換一次濾紙,共5~7天;
或者,(b)把步驟I)蚊蟲(chóng)按48小時(shí)間隔分批收集于青霉素小管中,-85°C凍存,用空斑試驗(yàn)檢測(cè)蚊蟲(chóng)的感染病毒滴度,收集病毒液;之后,把定性濾紙剪成3cm2若干份作為收集病毒的載體,每份濾紙中央標(biāo)記滴加RNA保存液和病毒液的位置,取若干個(gè)干凈培養(yǎng)皿,放置醫(yī)用棉球,將濾紙放在棉球上,在濾紙標(biāo)記位置滴加0.25ml RNA保存液,再取病毒液于同一位置滴加0.25ml ;
(3)病毒保存
將步驟2) (a)蚊蟲(chóng)取食過(guò)的濾紙或步驟2) (b)滴加了蚊蟲(chóng)病毒液的濾紙作為病毒載體在室溫24~27°C下分別放置,并在7天內(nèi)進(jìn)行檢測(cè);(4) 對(duì)被蚊蟲(chóng)取食過(guò)的載體提取病毒RNA
用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒規(guī)定方式提取病毒RNA ;
(5)PCR擴(kuò)增及檢測(cè)
設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系的病毒菌的5’,3’端保守序列引物及該引物的PCR反應(yīng)條件;以PCR
反應(yīng)產(chǎn)物凝膠成像及測(cè)序鑒定。
[0005]所述的方法的步驟I)進(jìn)一步是捕捉的蚊蟲(chóng)置于青霉素瓶中過(guò)夜,使其饑餓;翌日,將存活的蚊蟲(chóng)驅(qū)入紗籠內(nèi),供8%蔗糖水,紗籠內(nèi)溫度24~27°C,晝夜溫差<2°C,相對(duì)濕度70%~80%,光照時(shí)間12~14h,使其存活。
[0006]作為上述方法一種應(yīng)用是乙腦病毒收集、保存及檢測(cè):步驟2)之(b)當(dāng)感染的乙腦病毒液的病毒滴度為7.85 log PFU / ml時(shí),收集病毒液。
[0007]所述的應(yīng)用,其特征是所述步驟4) PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(單位:微升)為=MgCl25 微升,Buffer 2.5 微升,dNTP 2.5 微升,Pl 0.5 微升,P2 0.5 微升,P3 0.5 微升,R I 微升,F(xiàn) I微升,模板RNA 4微升,H2O 7.5微升;該P(yáng)CR反應(yīng)體系以JE-251F和JE-925R為基因擴(kuò)增引物,其中:
F: CGT TCT TCA AGT TTA CAg CAT TAG C ;
R: CCY RTG TTY CTG CCA AGC ATC CAM CC ;
PCR反應(yīng)條件:①50°C 30分鐘;(D 94°C 5分鐘;(D 95°C解鏈30秒;(D 52°C退火I分鐘;@72°C延伸60秒③~④45個(gè)循環(huán);?72°C延伸15分鐘;鑒定基因擴(kuò)增片段為乙腦病毒條帶700bp。
[0008]本發(fā)明利用蚊蟲(chóng)吮吸糖水過(guò)程中唾液反吐的同時(shí)也排出病毒的生物學(xué)特性,收集病毒,并將其病毒RNA保存于載體上,在常溫保存7天之內(nèi)供實(shí)驗(yàn)室分析檢測(cè)。
[0009]本發(fā)明具有以下進(jìn)步和意義:
以下圖1飛隨機(jī)抽樣保存天數(shù)的誘導(dǎo)表達(dá)1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明:本發(fā)明利用蚊蟲(chóng)吮吸糖液過(guò)程中唾液反吐同時(shí)排出病毒的生物學(xué)特性,設(shè)計(jì)與蚊蟲(chóng)數(shù)量適應(yīng)的紗籠和一定濃度的糖液飽和濾紙以在常溫下收集病毒,并于常溫中保存蚊蟲(chóng)病毒RNA載體在7天內(nèi)隨機(jī)地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),改變了冷鏈技術(shù)野外運(yùn)輸、攜帶和保存的麻煩,提高了病毒收集、保存效率,結(jié)果準(zhǔn)確,節(jié)省了人力物力。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是本發(fā)明三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊經(jīng)口感染乙腦病毒常溫保存第7天的PCR的凝膠照片。圖中1:標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì),2:誘導(dǎo)表達(dá)第7天的提取物。
[0011]圖2是本發(fā)明減少三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊數(shù)量經(jīng)口感染乙腦病毒常溫保存第3、4與5天PCR的凝膠照片。圖中I為標(biāo)準(zhǔn)分子量病毒核酸,2、3、4為誘導(dǎo)表達(dá)第3、4與5天的提取物。
[0012]圖3是本發(fā)明按方法(b)收集、保存及檢測(cè)三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊經(jīng)口感染乙腦病毒常溫保存后第6天和7天PCR的凝膠照片。圖中I為標(biāo)準(zhǔn)分子量病毒核酸,2、3分別為誘導(dǎo)表達(dá)第6、7天的提取物。
[0013]圖4是本發(fā)明感染乙腦病毒的三帶喙庫(kù)蚊以濾紙為載體在常溫下保存I天的PCR檢測(cè)的凝膠照片。圖中I為標(biāo)準(zhǔn)分子量病毒核酸,2為誘導(dǎo)表達(dá)第I天的提取物。[0014]圖5是本發(fā)明感染乙腦病毒的三帶喙庫(kù)蚊以濾紙為載體在常溫下分別保存2天和7天的PCR檢測(cè)的凝膠照片。圖中I為標(biāo)準(zhǔn)分子量病毒核酸,2、3分別為誘導(dǎo)表達(dá)第2天和7天的提取物。
[0015]圖1飛隨機(jī)抽樣保存天數(shù)的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明:以載體提取病毒RNA擴(kuò)增出的目的條帶均為674bp左右,與預(yù)計(jì)的乙腦病毒引物擴(kuò)增的cDNA片斷大小相符,故使用該載體和方法能完成對(duì)蚊媒病毒的收集、保存和檢測(cè)。
[0016]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明,實(shí)施例包括但不限制本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的內(nèi)容。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1:
按方法(a)收集、保存及檢測(cè)三 帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊經(jīng)口感染乙腦病毒。
[0018]( I)用乙腦野毒株病毒的蚊蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)?zāi)M疑似蚊媒致病病毒區(qū)域捕捉的蚊蟲(chóng)。
[0019]在30cm3紗籠中放入若干個(gè)米粒大的飽吸乙腦病毒液的棉花球,該病毒液的乙腦毒株為乙腦野毒株中山(Nak)株,病毒滴度7.85 log PFU/ml,將羽化后I天、經(jīng)24h饑餓的三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊雌蚊228只驅(qū)入紗籠內(nèi),讓蚊蟲(chóng)吮吸(經(jīng)口感染),過(guò)夜,翌日,將存活的蚊蟲(chóng)驅(qū)入青霉素瓶?jī)?nèi)過(guò)夜,青霉素瓶置于溫度24~27°C,晝夜溫差<2°C,相對(duì)濕度70%~80%屋內(nèi),給予光照12~14h,并提供8%蔗糖水,感染3天。
[0020]以存活的庫(kù)蚊作為在疑似蚊媒致病病毒區(qū)域捕捉的蚊蟲(chóng)逐一地放入青霉素小瓶中,過(guò)夜,饑餓后,待進(jìn)入步驟(2)。
[0021](2)收集病毒:
室溫24~27°C下,把定性濾紙剪成3cm2共3份作為收集病毒的載體,每份濾紙中央標(biāo)記滴加RNA保存液的位置,取3個(gè)干凈培養(yǎng)皿加10%蔗糖水,把醫(yī)用棉球浸泡在培養(yǎng)皿中,將濾紙放在棉球上,再在濾紙標(biāo)記位置滴加0.25ml RNA保存液,按每份濾紙70只蚊蟲(chóng)將步驟
I)存活的蚊蟲(chóng)驅(qū)入放有培養(yǎng)皿的15~30cm3紗籠內(nèi),讓蚊蟲(chóng)取食,每天換一次濾紙,共5天。
[0022](3)病毒保存:
將步驟2) (a)蚊蟲(chóng)取食過(guò)的濾紙作為病毒載體在室溫24~27°C下分別放置,在第7天進(jìn)行檢測(cè)。
[0023](4)對(duì)被蚊蟲(chóng)取食過(guò)的載體提取病毒RNA:
使用AxyPr印體液病毒DNA/RNA小量試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)杭州有限公司)包括:①用滅菌手術(shù)剪將濾紙剪碎,放入1.5ml離心管中。取500ul MEM液進(jìn)行洗脫,漩渦振蕩5min, 12,000*g離心5 min,取上清作為樣品。②收集300ul步驟I中樣品,轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中,12,000*g離心5 min,取上清作為樣品。③加入200ul Buffer V_L,鏇潤(rùn)振蕩混合均勻,靜置5 min。④加75ul Buffer V-N,鏇潤(rùn)振蕩混合均勻,12,000*g離心5 min。⑤將上清轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管中,加入300ul異丙醇(1%冰乙酸),上下倒置6_8次,混合均勻。⑥將制備管置于2ml離心管中,取步驟4中的混合液移入制備管中,6,000*g離心I min。⑦棄濾液,將制備管置回到2ml離心管中,加500ul Buffer W1A,室溫靜置I分鐘,12,000*g離心I min。⑧棄濾液,將制備管置回到2ml離心管中,加800ul Buffer W2,12,000*g離心I min。⑨將制備管置回到2ml離心管中,12,000*g離心I min。⑩將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中,在制備膜中央加40_60ul Bufffer TE nuclease-free),室溫靜置I min,12,000*g 離心 I min,洗脫 DNA/RNA。
[0024](5) PCR 擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(單位:微升)包括=MgCl2 5微升,Buffer 2.5微升,dNTP 2.5微升,Pl 0.5微升,P2 0.5微升,P3 0.5微升,R I微升,F(xiàn) I微升,模板RNA 4微升,H2O
7.5微升;該P(yáng)CR反應(yīng)體系以JE-251F和JE-925R為基因擴(kuò)增引物,其中:
F: CGT TCT TCA AGT TTA CAg CAT TAG C ;
R: CCY RTG TTY CTG CCA AGC ATC CAM CC。
[0025]PCR反應(yīng)條件:①50°C 30分鐘;(D 94°C 5分鐘;(D 95°C解鏈30秒;(D 52°C退火I分鐘72°C延伸60秒③~④45個(gè)循環(huán);? 72°C延伸15分鐘;鑒定基因擴(kuò)增片段如圖1,為乙腦病毒條帶約674bp。
[0026]實(shí)施例2:
減少蚊蟲(chóng)數(shù)量,縮小紗籠至15cm3,按方法(a)收集、保存及檢測(cè)三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊經(jīng)口感染乙腦病毒。
[0027]( I)用乙腦野毒株病毒的蚊蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)?zāi)M疑似蚊媒致病病毒區(qū)域捕捉的蚊蟲(chóng)。
[0028]將羽化后I天的30只三帶喙庫(kù)蚊雌蚊經(jīng)24h的饑餓,每只庫(kù)蚊驅(qū)入一只放有米粒大的飽吸乙腦病毒液的棉花球的青霉素小瓶中,其病毒毒株為乙腦野毒株中山(Nak)株,病毒滴度為7.85 log PFU/ml,讓蚊蟲(chóng)吮吸(經(jīng)口感染),過(guò)夜。翌日,將存活的庫(kù)蚊24只收集在15cm3紗籠內(nèi),室溫24~27°C,晝夜溫差<2°C,相對(duì)濕度70%~80%,人工光照12~14h條件下養(yǎng)殖,并提供8%蔗糖水,感染3天。
[0029]以存活的庫(kù)蚊作為在疑似蚊媒致病病毒區(qū)域捕捉的蚊蟲(chóng)放入青霉素小瓶中,過(guò)夜饑餓后,把蚊蟲(chóng)驅(qū)入3cm2濾紙,放在8%蔗糖水浸泡的醫(yī)用棉球上,滴加0.25ml RNA保存液病毒收集載體,讓蚊蟲(chóng)取食,每天換一次載體,直到感染后第11天。被蚊蟲(chóng)取食過(guò)的載體進(jìn)行乙腦病毒PCR檢測(cè)。
[0030](2)病毒RNA提取與實(shí)施例1相同。
[0031 ] (3) PCR擴(kuò)增和檢測(cè)同實(shí)施例1。
[0032]結(jié)果:取經(jīng)感染乙腦病毒24只庫(kù)蚊保存3、4與5天的RNA載體,擴(kuò)增目的條帶約為 674 bp (圖 2)。
[0033]實(shí)施例3:
按方法(b)收集、保存及檢測(cè)三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊經(jīng)口感染乙腦病毒。
[0034](I)用乙腦野毒株病毒的蚊蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)?zāi)M疑似蚊媒致病病毒區(qū)域捕捉的蚊蟲(chóng)(與實(shí)施例1相同)。
[0035](2)收集病毒。
[0036]把步驟I)逐一收集于青霉素小管中的蚊蟲(chóng)_85°C凍存,按48小時(shí)間隔分5批共13組計(jì)211只蚊蟲(chóng)用空斑試驗(yàn)檢測(cè)蚊蟲(chóng)的感染病毒滴度,收集病毒液。具體是:取出凍存的經(jīng)口感染的三帶喙庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊,按感染日期進(jìn)行分組,放入研磨器,用含3%雙抗的Hanks液洗漆3次,研磨,每個(gè)研磨器加入1ml Hanks液,制成懸液,接種已長(zhǎng)成單層的BHK21細(xì)胞。空斑實(shí)驗(yàn)采用6孔板,直徑35 _,每孔接種蚊懸液0.2 ml,37°C吸附Ih后加甲基纖維素營(yíng)養(yǎng)覆蓋物覆蓋,CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),第5天用結(jié)晶紫溶液染色,計(jì)算空斑數(shù)及空斑形成單位。結(jié)果:13組計(jì)211只蚊蟲(chóng)中有11組出現(xiàn)病毒,陽(yáng)性率為84.62%,陽(yáng)性組的病毒滴度較高,多數(shù)結(jié)果在4個(gè)對(duì)數(shù)左右(見(jiàn)下表)。
[0037]表乙型腦炎野毒株(中山株)感染三帶喙庫(kù)蚊空測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.蚊媒病毒常溫收集和保存、及檢測(cè)方法,包括以下步驟: (1)在疑似蚊媒致病病毒區(qū)域,捕捉30-200只同一種類或不同種類的蚊蟲(chóng)逐一地放入青霉素小瓶中,過(guò)夜,饑餓后,待進(jìn)入步驟(2); (2)按以下兩種方法之一收集病毒: (a)室溫24~27°C下,把定性濾紙剪成3cm2若干份作為收集病毒的載體,每份濾紙中央標(biāo)記滴加RNA保存液的位置,取若干個(gè)干凈培養(yǎng)皿加10%蔗糖水,把醫(yī)用棉球浸泡在培養(yǎng)皿中,將濾紙放在棉球上,再在濾紙標(biāo)記位置滴加0.25ml RNA保存液,按每份濾紙20-70只蚊蟲(chóng)將步驟I)存活的蚊蟲(chóng)驅(qū)入放有培養(yǎng)皿的15~30cm3紗籠內(nèi),讓蚊蟲(chóng)取食,每天換一次濾紙,共5~7天; 或者,(b)把步驟I)收集于青霉素小管中的蚊蟲(chóng)_85°C凍存,按48小時(shí)間隔分批用空斑試驗(yàn)檢測(cè)蚊蟲(chóng)的感染病毒滴度,收集病毒液;之后,把定性濾紙剪成3cm2若干份作為收集病毒的載體,每份濾紙中央標(biāo)記滴加RNA保存液和病毒液的位置,取若干個(gè)干凈培養(yǎng)皿,放置醫(yī)用棉球,將濾紙放在棉球上,在濾紙標(biāo)記位置滴加0.25ml RNA保存液,再取病毒液于同一位置滴加0.25ml ; (3)病毒保存 將步驟2) (a)蚊蟲(chóng)取食過(guò)的濾紙或步驟2) (b)滴加了蚊蟲(chóng)病毒液的濾紙作為病毒載體在室溫24~27°C下分別放置,并在7天內(nèi)進(jìn)行檢測(cè); (4)對(duì)被蚊蟲(chóng)取食 過(guò)的載體提取病毒RNA 用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒規(guī)定方式提取病毒RNA ; (5)PCR擴(kuò)增及檢測(cè) 設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系的病毒菌的5’,3’端保守序列引物及該引物的PCR反應(yīng)條件;以PCR反應(yīng)產(chǎn)物凝膠成像及測(cè)序鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征是步驟I)進(jìn)一步是把捕捉的蚊蟲(chóng)置于青霉素瓶中過(guò)夜,使其饑餓;翌日,將存活的蚊蟲(chóng)驅(qū)入步驟2)紗籠內(nèi),紗籠內(nèi)溫度24~27°C,晝夜溫差<2°C,相對(duì)濕度70%~80%,光照時(shí)間12~14h,使其存活。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法在乙腦病毒收集、保存及檢測(cè)中的應(yīng)用,其特征是所述步驟2)之(b)當(dāng)感染的乙腦病毒液的病毒滴度為7.85 log PFU / ml時(shí),收集病毒液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征是所述步驟4)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(單位:微升)為=MgCl2 5 微升,Buffer 2.5 微升,dNTP 2.5 微升,Pl 0.5 微升,P2 0.5 微升,P3.0.5微升,R I微升,F(xiàn) I微升,模板RNA 4微升,H2O 7.5微升;該P(yáng)CR反應(yīng)體系以JE-25IF和JE-925R為基因擴(kuò)增引物,其中: F: CGT TCT TCA AGT TTA CAg CAT TAG C ; R: CCY RTG TTY CTG CCA AGC ATC CAM CC ; PCR反應(yīng)條件:①50°C 30分鐘?’②940C 5分鐘;(D 95°C解鏈30秒;(D 52°C退火I分鐘;@72°C延伸60秒③~④45個(gè)循環(huán);?72°C延伸15分鐘;鑒定基因擴(kuò)增片段為乙腦病毒條帶700bp。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103981282SQ201410167943
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】余靜, 范泉水, 張富強(qiáng), 葉鋒平, 郭平, 袁貴紅 申請(qǐng)人:成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心軍事醫(yī)學(xué)研究所
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