一種腈水解酶基因及其原核表達和固定化技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腈水解酶基因及其原核表達和固定化技術(shù)，屬于化工酶的原核表達及固定化【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用PCR技術(shù)，以熱纖梭菌的基因組為模板克隆到腈水解酶基因，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)對該酶進行原核表達，得到含有該腈水解酶基因的重組質(zhì)粒pET-28a-nit，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21獲得重組菌BL21(pET-28a-nit)，誘導(dǎo)重組菌表達獲得重組腈水解酶；該腈水解酶基因與連接有孢子外衣殼蛋白基因cotG的高拷貝穿梭質(zhì)粒連接，構(gòu)建成用于表面展示的重組質(zhì)粒pHS-cotG-nit，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌菌株DB403獲得重組菌DB403(pHS-cotG-nit)，誘導(dǎo)重組菌產(chǎn)生的重組芽孢表面展示有該腈水解酶。本發(fā)明首次通過孢子表面展示技術(shù)對腈水解酶進行固定化，該方法不僅可以使酶的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，而且利于酶在催化后的回收再利用，只需要離心就可以把展示有腈水解酶的孢子回收再利用。
【專利說明】一種腈水解酶基因及其原核表達和固定化技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種腈水解酶基因及其原核表達和固定化技術(shù)，屬于化工酶的原核表達及固定化【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]腈水解酶是一類可以把腈物質(zhì)水解為相應(yīng)的羧酸和氨的酶。腈物質(zhì)(R-CN)是指含有有機基團-CN的有機物。
[0003]腈物質(zhì)是一類重要的化合物，在化工生產(chǎn)中常常作為中間體被廣泛應(yīng)用。自然界中的許多高等植物和微生物體內(nèi)含有腈物質(zhì)，現(xiàn)在已經(jīng)報道的腈物質(zhì)超過2000種，其中大部分是人工合成的(徐建妙，鄭裕國，沈寅初。腈水解酶的來源、結(jié)構(gòu)、作用機制及其應(yīng)用。微生物學(xué)通報，2005，32 (5):141-146)。常用的腈合成方法為，在水或者與水化學(xué)性質(zhì)類似的溶液中，通過氰化鉀和鹵代烷發(fā)生親和取代反應(yīng)合成。在有機合成中，常常需要引入羧基或其衍生基團，由于腈基相對于這些基團更易引入分子中，常常先引入腈基，在進一步的轉(zhuǎn)化成羧基或其衍生基團，因此腈物質(zhì)是有機合成中一類重要的中間體。腈基轉(zhuǎn)化為羧基的傳統(tǒng)方法為化學(xué)法，但反應(yīng)條件苛刻，常常需要高溫、高壓、強酸、強堿等條件，而且反應(yīng)伴隨著大量的鹽類副產(chǎn)物，給后續(xù)的提純帶來了困難，且該種方法會造成環(huán)境污染，因此，該種方法在工業(yè)上 的應(yīng)用受到了大大的限制(Mylerovd V, Martinkova L.Syntheticapplications of nitriIe-converting enzymes[J].Current Organic Chemistry,2003，7(13): 1279-1295)。而用腈水解酶催化腈物質(zhì)轉(zhuǎn)化為羧酸的生物方法，相對于傳統(tǒng)的化學(xué)法不僅具有高效性、專一性、反應(yīng)條件溫和，環(huán)境代價小，最重要的是具有立體選擇性、區(qū)域選擇性、化學(xué)選擇性這些化學(xué)方法無法比擬的優(yōu)點(王寧，許銦，陸大軍.生物酶在腈綸及滌綸改性中的應(yīng)用[J].合成纖維工業(yè)，2003，26(4): 35-37.;張金文，熊春蓉，李靜雯，等.臭鼻桿菌腈水解酶基因(bxn)的克隆及其在原核生物中的表達[J].草業(yè)學(xué)報，2006，15(6): 87-92.)。
[0004]腈水解酶在降解腈類農(nóng)藥方面也具有廣泛的應(yīng)用。有一類普遍應(yīng)用的除草劑的主要成分為溴苯腈、碘苯腈或氯苯經(jīng)，它們被噴灑到植物的葉片后被迅速吸收，然后通過抑制植物的光合作用使植物枯萎壞死。但是這些腈類物質(zhì)是有毒的，而且在自然界被降解的周期比較長，所以能不能找到一個有效的降解殘留的除草劑的方法，成為其能不能被推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。把腈水解酶基因?qū)虢?jīng)濟植物內(nèi)，培育具有降解腈類物質(zhì)的抗除草劑作物成了一個理性的解決方法。Striker等從土壤里篩選到一株可以把溴苯腈降解成3，5_ 二溴-4-羥基苯甲腈的細菌K.0zaenae,從該細菌基因組里獲得了腈水解酶基因，該基因被導(dǎo)入棉花獲得了抗溴苯腈的轉(zhuǎn)基因棉花。
[0005]腈水解酶在腈綸類織物性狀改良方面有廣泛的應(yīng)用。腈綸主要是由丙烯腈單體聚合而成的高分子化合物，由于其末端為疏水基團，造成手感不好且不易染色，通過腈水解酶處理腈綸，在其的外部引入親水基團，同時不破壞其內(nèi)部分子鍵從而不影響其機械強度。東華大學(xué)王平等，通過培養(yǎng)紅球菌產(chǎn)生腈水解酶和腈水合酶，以酶液處理腈綸織物，能夠部分的轉(zhuǎn)化腈綸纖維中的-CN為-COOH和-C0NH2，酶改性后，織物的回潮率、陽離子染料和酸性染料的可染性都得到了提高，靜電半衰期減小。
[0006]最早發(fā)現(xiàn)腈水解酶的為哈佛大學(xué)的Thimann和Mahadevan,他們1964年從大麥葉片中分離出一種能把吲哚乙腈水解為吲哚乙酸的酶，并命名為吲哚乙腈水解酶。深入的研究發(fā)現(xiàn)該酶可以把另外26種腈物質(zhì)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的羧酸，而且在水解各種腈物質(zhì)時表現(xiàn)出不同的活性，因此，Thimann和Mahadevan命名該種酶為腈水解酶。
[0007]現(xiàn)在已經(jīng)有很多腈水解酶被發(fā)現(xiàn)，但是總體來說酶活都不是太高，穩(wěn)定性不是太高，而且很難回收再利用，這就大大的限制了其工業(yè)化的應(yīng)用。所以從自然界篩選高活性的腈水解酶成為當(dāng)務(wù)之急。經(jīng)檢索，國內(nèi)外還沒有關(guān)于熱纖梭菌基因組上腈水解酶原核表達的報道。
[0008]枯草芽孢桿菌孢子表面展示技術(shù)為解決游離酶和營養(yǎng)細胞催化中存在的問題提供了一種新的解決思路。[0009]枯草芽孢桿菌的孢子展示外源蛋白是最近十幾年新興起的一門技術(shù)，孢子為內(nèi)生，不需要要穿過細胞膜，而且胞內(nèi)有一套完整的分子伴侶體系，在芽孢形成的時候可以幫助連接在衣殼蛋白上的外源蛋白正確的折疊。而且孢子具有獨特的抗逆性，它可以抵抗高溫、強酸、強堿、輻射等不良環(huán)境的影響而長時間存活。已經(jīng)報道的常用來作為孢子表面展示的載體蛋白有CotB，CotC和CotG。
[0010]枯草芽孢桿菌孢子表面展示技術(shù)已經(jīng)在很多方面被廣泛應(yīng)用。
[0011]該技術(shù)最先被應(yīng)用來制作口服疫苗，Rachele isticato等最先以CotB為載體蛋白把破傷風(fēng)毒素碳末端(TTFC)的459個氨基酸片段展示在枯草芽孢桿菌孢子表面。以CotB-TTFC重組芽孢喂食小鼠或鼻腔注射后，可在小鼠血清內(nèi)檢驗到抗TTFC IgG。
[0012]最近幾年把酶展示在孢子表面，從而對酶進行固定化成為研究的熱點。對于一些化工酶，如何在催化反應(yīng)后進行回收再利用成為一個難題，而把酶固定在孢子表面后，不僅可以增加酶的穩(wěn)定性，還可以通過離心回收孢子而對酶進行回收再利用，國內(nèi)迄今為止還沒有關(guān)于從孢子表面展示技術(shù)固定化工酶的報道，倒是有幾例通過該技術(shù)隊酶進行固定化的報道。Kwon S J等以CotG為蛋白載體把具有活性的大腸桿菌β-半乳糖苷酶展示在孢子表面，大腸桿菌半乳糖苷酶為大分子量的酶，每個亞基的分子量為116kDa，而且只有在四聚體的時候才具有活性。從而證明該孢子表面展示系統(tǒng)也適用于多亞基的大分子量酶。王楠等證明CotC也可以用來展示具有活性的酶，家蠶乙醇脫氫酶連接在CotC碳端，獲得展示在孢子上的融合蛋白CotC-BmADH，且具有很高的活性。(Due L
H,Hong H A, Fairweather N, et al.Bacterial spores as vaccine vehicles[J].1nfection and immunity, 2003, 71(5): 2810-2818.；Kwon S J, Jung H C, Pan JG.；TransgalactosyIation in a water-solvent biphasic reaction system withβ-galactosidase displayed on the surfaces of Bacillus subtiIis spores[J].Applied and environmental microbiology, 2007, 73(7): 2251-2256.；ffang N,Chang C, Yao Q, et al.Display of Bombyx mori alcohol dehydrogenases on theBacillus subtiIis spore surface to enhance enzymatic activity under adverseconditions [J].PloS one, 2011, 6(6): e21454.)
為了克服熱纖梭菌腈水解酶在游離狀態(tài)下催化底物時活性不穩(wěn)定、不易回收再利用等問題。把其展示在孢子的表面，對其進行固定化，再以孢子催化底物，反應(yīng)結(jié)束后可以通過離心把孢子和反應(yīng)物分離開，回收的孢子還可以再次利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的主要內(nèi)容是提供一種克隆自熱纖梭菌的腈水解酶基因、含有該基因的重組質(zhì)粒、含有該重組質(zhì)粒的可以表達腈水解酶的重組大腸桿菌、原核表達獲得的重組酶在催化腈類物質(zhì)中的應(yīng)用、還提供一種通過把腈水解酶展示在枯草芽孢桿菌孢子表面從而對其進行固定化的方法。
[0014]本發(fā)明的具體的技術(shù)方案為:
(1)一種腈水解酶基因，具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0015]該腈水解酶基因由如下方法得到:利用PCR技術(shù)，在以下引物對的作用下，引物Pnit-upl:(CGCGGATCCATGAGAGCTGCATTATACCA)下劃線部分為限制性酶切位點 Bam HI，下游引物Pnit-down2: (CCGCTCGAGTTAAAATAAAGTTTTATAAAGC)下劃線部分為限制性酶切位點Xho I，以NCBI檢索到的熱纖梭菌基因組DNA為模板克隆到長約770 bp的腈水解酶基因片段。具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。其翻譯生成的氨基酸序列跟十種已經(jīng)被證明具有酶活的腈水解酶的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)具有很大的相似性，與來自Rhodococcusrhodochrous的腈水解酶的氨基酸相似度達到56%,與來自Nicotiana tabacum的腈水解酶的氨基酸相似度達到62%。在遺傳學(xué)上進一步確定其為腈水解酶基因，而且具有活性的可能性很大。該腈水解酶基因核苷酸序列為:
【權(quán)利要求】
1.一種腈水解酶基因，具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于，所述腈水解酶基因編碼SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于，所述腈水解酶基因源自熱纖梭菌{Clostridium thermoceUum)。
4.一種含有權(quán)利要求1所述腈水解酶基因的重組質(zhì)粒pET-28a-/?ii。
5.一種含有權(quán)利要求4所述重組質(zhì)粒pET-28a-/?ii轉(zhuǎn)化得到的重組菌BL21(pET_28a-/?ii )。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腈水解酶在制備重組腈水解酶中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腈水解酶基因在制備重組腈水解酶中的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用為:構(gòu)建含有所述腈水解酶基因的重組質(zhì)粒，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得重組菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲破碎誘導(dǎo)表達后的重組菌，離心分離沉淀和上清，通過SDS-PAGE檢驗上清和沉淀，發(fā)現(xiàn)過表達的重組腈水解酶全部在上清里，通過N1-NTA對上清內(nèi)的腈水解酶進行純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的腈水解酶基因在制備重組腈水解酶中的應(yīng)用，其特征在于，純化后的腈水解酶用于催化3-氰基吡啶生成煙酸，該腈水解酶在pH 7.4,45 1:時催化活性最聞O
9.一種通過把腈水解酶展示在枯草芽孢桿菌孢子表面從而對其進行固定化的方法，其特征在于，按照以下步驟進行: A.用于孢子表面展示的重組質(zhì)粒的構(gòu)建: 以pLJ為模板進行PCR擴增獲得一條不含有乳糖誘導(dǎo)調(diào)控序列Pglv-1nframe的質(zhì)粒骨架片段，且在擴增時在片段的兩端同時引入&0 RI酶切位點，對片段進行酶切后會在兩端產(chǎn)生兩個相同的粘性末端，在T4 DNA連接酶的作用下進行自環(huán)化，該質(zhì)粒即為pHS ;再在PHS的多克隆位點Zffl3 I和分e I之間插入芽孢外衣殼蛋白Co招基因，在分e 1和油<3 I之間插入腈水解酶基因，得到孢子表面展示載體pHS-coz^-flit ； B.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DB403構(gòu)建重組菌DB403^WS-cotG-nit): 把重組質(zhì)粒pHSWdii轉(zhuǎn)化進入菌株DB403，經(jīng)過篩選獲得重組枯草芽孢桿菌DB403 (.v^-cotG-nit)； C.重組芽孢的形成:把重組菌在DSM培養(yǎng)基里耗竭法培養(yǎng)48小時，誘導(dǎo)芽孢形成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種通過把腈水解酶展示在枯草芽孢桿菌孢子表面從而對其進行固定化的方法，其特征在于，所得表面展示有腈水解酶的孢子懸液作為孢子催化劑催化3-氰基吡啶，該重組孢子懸液在pH 7.4、45 1:時其活性最高。
【文檔編號】C12N15/70GK103937821SQ201410162214
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】陳華友, 孫騰云, 田瑞, 倪忠, 陳洪章, 陳志 , 張?zhí)煜? 郭齊 申請人:江蘇大學(xué)