分析細胞增殖性病癥的方法和核酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于檢測，或用于檢測和區(qū)分肝細胞增殖性病癥或用于檢測和區(qū)分結(jié)腸直腸細胞增殖性疾病的方法、核酸和試劑盒。具體方面公開和提供基因組序列，其甲基化模式對于所述病癥種類的改進的檢測和區(qū)分有重要的用途，由此使得對患者的改進的診斷和治療成為可能。
【專利說明】分析細胞增殖性病癥的方法和核酸
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?00680012490. 0、發(fā)明名稱為"分析細胞增殖性病癥的方法和 核酸"的中國專利申請的分案申請，該母案申請是2006年4月17日提交的PCT國際專利申 請TPC / US2006 / 014131進入中國國家階段的申請。

【技術(shù)領域】
[0002] 本發(fā)明涉及在相對于正常狀態(tài)的疾病狀態(tài)中表現(xiàn)出改變的表達模式的基因組序 列。具體的實施方案提供了檢測或者檢測和區(qū)別細胞增殖性病癥的方法、核酸、核酸陣列和 試劑盒等。優(yōu)選地，用于檢測和診斷細胞增殖性病癥的方法、核酸、核酸陣列和試劑盒可用 于診斷癌癥，尤其是結(jié)腸直腸和/或肝癌。
[0003] 相關申請的參考
[0004] 本申請要求2005年4月15日遞交的美國臨時專利申請60 / 672,242 ;2005年5 月2日遞交的60 / 676, 997 ;2005年7月8日遞交的60 / 697, 521 ;2005年8月1日遞交 的60 / 704,860 ;2005年8月17日遞交的60 / 709,318 ;2005年10月4日遞交的60 / 723, 602 ;以及2006年3月30日遞交的60 / 787, 402的優(yōu)先權(quán)，將它們的整體都以參考方 式并入本文。
[0005] 序列表
[0006] 按照37C. F. R. § 1. 52 (e) (5)要求的序列表已作為1. 82MB文本文件在以光盤（一 張）提供，標題為"47675_187Sequence Listing, txt"，將其整體通過參考方式并入本文。

【背景技術(shù)】
[0007] 癌癥的發(fā)病率和診斷。癌癥在美國是第二位的主要死因。如果當前的篩選方法在 患者順應性、敏感性和易于篩選方面有所改進，則死亡率會有明顯改善?，F(xiàn)有的建議用來診 斷癌癥的方法一般是昂貴的，并且不適于用作人群廣泛篩選測試。
[0008] 肝細胞癌（HCC)是世界上第四常見的癌癥，其發(fā)生率從北美的每100, 000人中2. 1 個至中國每100, 〇〇〇人中80個。在美國，據(jù)估計在2005年會有17, 550新診斷病例并且 15, 420人因此死亡。肝臟超聲、α甲胎蛋白水平和常規(guī)CT掃描通常用于HCC(肝細胞或原 發(fā)肝癌）的診斷評估，但是它們通常太不靈敏而不能用來檢測多病灶的小損傷和用于作出 治療計劃。
[0009] 在美國，結(jié)腸直腸癌的年發(fā)病率大約為150, 000,每年有56, 600個體死于結(jié)腸直 腸癌。在普通群體中結(jié)腸直腸癌的終生風險（lifetime risk)是約5至6%。盡管最近幾 年在篩選和早期檢測結(jié)腸癌方面有不少努力，但至今很多病例仍是在具有局部或遠處轉(zhuǎn)移 的晚期被診斷出來。盡管治療選擇包括手術(shù)和輔助或姑息性化學治療，但很多患者還是在 幾個月內(nèi)死于它們癌癥的進展。鑒定結(jié)腸癌發(fā)展中的分子變化可以幫助開發(fā)新的監(jiān)測、篩 選、診斷和治療手段，它們會改善這些患者總的不良預后。
[0010] 依照美國癌癥協(xié)會，用于結(jié)腸直腸篩選的現(xiàn)有指導是使用五種不同手段之一在50 歲或更大年齡平均風險個體中篩選。這些手段包括1)每年大便潛血測試（F0BT)，2)每五 年進行可曲性乙狀結(jié)腸鏡檢查，3)每年的FPBT加上每五年的可曲性乙狀結(jié)腸鏡檢查，4)每 五年的雙重對比鋇劑灌腸法或5)每10年的結(jié)腸鏡檢查。盡管這些測試程序被醫(yī)學界廣泛 接受，實施對結(jié)腸直腸癌的廣泛篩選還沒有實現(xiàn)。由于與這些操作相關的不適或不便，患者 依從性是限制使用的主要因素。盡管FOBT測試是非侵入性操作，但是需要測試前3-5天的 飲食和其它限制。這些測試的敏感性水平對于結(jié)腸直腸腺癌來說也非常低，依賴于試驗而 有較大波動。由于大多數(shù)腺瘤并不出血，對于檢測腺瘤的敏感性測量來說則更差。相反，因 為直接觀察到結(jié)腸的內(nèi)腔，更侵入性的操作如乙狀結(jié)腸鏡檢查和結(jié)腸鏡檢查的敏感性則相 當高。非隨機的試驗已評估了這些技術(shù)的有效性，但是使用病例對照研究的數(shù)據(jù)和來自國 家息肉研究（National Polyp Study)(美國）的數(shù)據(jù)已顯示除去腺瘤性息肉將導致CRC發(fā) 病率76-90%的降低。乙狀結(jié)腸鏡檢查的局限性在于僅觀察結(jié)腸的左例，右側(cè)結(jié)腸的損傷不 被檢測到。兩種鏡檢操作都是昂貴的，要求使用瀉藥制劑，并具有增加的發(fā)病率和死亡率風 險。顯然，在結(jié)腸直腸癌的通用廣泛篩選變得普通之前，需要具有增加的敏感性、特異性、易 于使用和降低的費用的改進測試。
[0011] 早期結(jié)腸直腸檢測通常是基于在無癥狀個體上每年進行的大便潛血測試（F0BT)。 由包括美國癌癥協(xié)會在內(nèi)的幾個醫(yī)療組織改編的當前建議要求大便潛血測試在年齡50開 始，每年重復，直至患者不再能從篩查受益。陽性F0BT導致對腸的結(jié)腸鏡檢查；這是昂貴和 侵入生的操作，具有每5, 000檢查中1個的嚴重并發(fā)癥發(fā)病率。只有12%的具有血紅素陽 性大便的患者在結(jié)腸鏡檢時被診斷為癌癥或大息肉。許多研究顯示F0BT篩查不改善癌癥 相關的死亡率或整體存活率。對大便潛血測試的依從性很差，少于20%的群體按建議提供 或完成F0BT。如果F0BT恰當?shù)赝瓿?，則患者從三個順序的腸運動收集糞樣品。在患者遵從 飲食指導并避免已知引起隱蔽胃腸道出血的藥物時獲得樣品。實際上，醫(yī)師常常沒有恰當 地指導患者，患者常常不按試驗計劃進行，并且一些患者發(fā)現(xiàn)收集大便樣品的任務很困難 或令人不快，從而與大便潛血測試有關的依從性很差。如果能相對于當前方法改進測試敏 感性和特異性，則可降低測試的頻率，消除連續(xù)收集樣品、消除飲食和藥物計劃變動并改善 患者依從性。伴隨依從性問題的還有，F(xiàn)0BT檢測結(jié)腸癌的敏感性和特異性很差。差的特異 性導致不必要的結(jié)腸鏡檢，使結(jié)腸癌篩查增加了相當?shù)馁M用。
[0012] F0BT的特異性已被計算為至多96 %，而敏感性為43% (腺瘤）和50% (結(jié)腸直 腸癌）。采用免疫測定F0BT可改進敏感性，如商標為"InSure?"的產(chǎn)品，具有改進的敏感 性77% (腺瘤）和88. 9% (結(jié)腸直腸癌）。
[0013] 分子疾病標志物。分子疾病標志物比其它類型的標志物具有幾個優(yōu)勢，一個優(yōu)勢 是即使樣品量很小的樣品和/或組織結(jié)構(gòu)沒有被維持的樣品也能夠相當有效地分析。在最 近10年中，很多基因已顯示在正常和結(jié)腸癌之間差異表達。但是，沒有單一標志物或標志 物組合被證實足以診斷結(jié)腸癌?；诖蟪叽鏼RNA (High-dimensional mRNA)的方法最近被 證實能夠提供更好的手段來區(qū)分不同的腫瘤類型以及良性和惡性病變。但是，其作為常規(guī) 診斷工具在臨床環(huán)境中的應用被以下原因所阻礙：mRNA的極度不穩(wěn)定、在某些觸發(fā)物作用 下快速出現(xiàn)的表達變化（例如樣品收集）以及，更重要地，分析需要大量的mRNA(Lipshutz， R. J.等人，Nature Genetics21 :20_24,1999 ;Bowtell，D. D. L Nature genetics suppl. 21 : 25-32,1999)，其通常不能從常規(guī)活檢獲得。
[0014] 已建議使用生物標志物來進一步改善F0BT的敏感性和特異性，這類測試的實例 包括可從EXACT Sciences獲得的PreGen-Plus?大便分析測試，其具有20% (腺癌）和52% (結(jié)腸直腸癌）的敏感性，兩種情況下特異性均為95%。這種測試測定與結(jié)腸瘤的發(fā)生有關 的23種DNA突變的存在。將DNA甲基化用作結(jié)腸癌標志物是已知的。例如，Sabbioni等人 (Molecular Diagnosis7 :201-207,2003)在 98%結(jié)腸癌患者外周血中檢測由 TPEF、HIC1、 DAPK和MGMT組成的一組基因的超甲基化。但是，這并沒有為商業(yè)上可市場化的測試提供適 合的基礎，由于這種測試的特異性也必須足夠高。
[0015] 結(jié)腸直腸癌的現(xiàn)有病理發(fā)生傾向于腺瘤的逐步進展，其包括異常發(fā)育的發(fā)生和最 終的侵入性癌癥跡象。以這種腺瘤-癌順序發(fā)生的分子變化包括腫瘤抑制基因（APC、p53、 DCC)的遺傳和表觀遺傳變化，癌基因（K-ras)的活化以及DNA錯配修復基因的失活。最近， 又揭示了其它的分子變化和遺傳缺陷。因而，fct信號通路的活化不僅包括APC基因的突 變，也可由β_連環(huán)蛋白（catenin)突變引起。此外，TGF-β信號通路連同其信號轉(zhuǎn)導蛋 白SMAD4和SMAD2的改變已與結(jié)腸癌的發(fā)生相關。
[0016] 盡管有在理解結(jié)腸腺瘤和癌的病理學以及它們的遺傳和分子變化方面的進步，但 是在轉(zhuǎn)移發(fā)生中的遺傳和表觀遺傳變化方面了解不夠。然而，被廣泛接受的是，侵入過程和 細胞外基質(zhì)的蛋白水解以及滲透血管基底膜涉及粘附蛋白例如整合素受體家族的成員，鈣 粘素，免疫球蛋白超家族、層粘聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白以及CD44受體。除了粘附之外，轉(zhuǎn)移形成的 過程還包括誘導和調(diào)節(jié)血管發(fā)生（VEGF、bFGF)、誘導細胞增殖（EGF、HGF、IGF)以及活化蛋 白水解酶（MMPs，HMPs，uPAR)和抑制凋亡（Bcl-2、Bcl-X)。最近，其它的研究小組已將轉(zhuǎn) 移損傷中的遺傳和分子變化與原發(fā)性結(jié)腸直腸癌中發(fā)現(xiàn)的變化進行了比較。這樣，Kleeff 等人報道了在原發(fā)和轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌中候選腫瘤抑制基因 D0C-2的缺失。此外，Zauber等 人報道在他們一系列的42結(jié)腸直腸癌中，原發(fā)癌癥中Ki-ras突變在全部42對原發(fā)和同時 的轉(zhuǎn)移性損傷中相同。類似地，在39對癌和同時的轉(zhuǎn)移灶中APC位點的雜合性丟失是相同 的。這些作者得出結(jié)論，對于Ki-ras和APC基因來說，在轉(zhuǎn)移灶中的遺傳變化與原發(fā)性結(jié) 腸直腸癌中是相同的。但是，其它小組發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中的遺傳和分子變化，但它們不 存在于原發(fā)癌中。這樣，已報道了結(jié)腸直腸轉(zhuǎn)移灶中染色體3p的L0H的出現(xiàn)。此外，使用 比較基因組雜交，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶中的幾種變化是轉(zhuǎn)移損傷所獨有的（_9q、_llq和_17q)。
[0017] CpG島甲基化。除了突變，CpG島的異常甲基化已被證實導致某些以前與多種癌癥 的病理發(fā)生有關的基因的轉(zhuǎn)錄沉默。CpG島為富含CpG二核苷酸的短序列，通常在大約50% 的全部人類基因的5'區(qū)域被發(fā)現(xiàn)。在這些島中胞嘧啶的甲基化導致基因表達喪失，并在X 染色體的失活和基因組印跡中有報道。
[0018] 最近，幾個研究小組也分析了多種基因在結(jié)腸直腸癌中的甲基化，并報道通過啟 動子甲基化轉(zhuǎn)錄沉默 P 16INK4、P 14ARF、pl5INK4b、MGMT、hMLHl、GSTPl、DAPK、CDHl、HMP-3、 APC等等。因此，除了突變失活某些基因之外，這些基因的高甲基化也顯著促進了這些疾病 的病理發(fā)生。
[0019] 近些年來，在結(jié)腸癌中甲基化的幾個基因已通過MS-APPCR被鑒別。除了其它以 夕卜，這些基因中還包括TPEF / HPP1，其常常在結(jié)腸癌中被甲基化，并且被兩個不同的小組 米用 MS-APPCR 方法鑒定（參見，例如 Young J，Biden KG，Simms LA, Huggard P，Karamatic R， Eyre HJ, Sutherland GR, Herath N, Barker M, Anderson GJ, Fitzpatrick DR, Ramm GA, Jass JR, Leggett BA. HPP1 ：a transmembrane protein-encoding gene commonly methylated in colorectal polyps and cancers (在結(jié)腸直腸息肉和癌癥中跨膜蛋白編碼基因通常被甲基 化）· Proc NatlAcad Sci USA98 :265-270, 2001)。
[0020] 多因子途徑。傳統(tǒng)上，癌癥診斷依賴于檢測單一分子標志物（例如基因突變，升高 的PSA水平）。遺憾的是，癌癥是這樣的一種疾病狀態(tài)，其中單一標志物通常不能檢測或區(qū) 分多種形式的疾病。因此，僅識別單一標志物的測定已被證實僅具有限的預測價值。本發(fā) 明的主要方面是，通過多種標志物的選擇使用，基于甲基化的癌癥診斷學以及篩查、診斷和 治療性監(jiān)測這類疾會相對于使用單一標志物分析的現(xiàn)有技術(shù)提供顯著的進步。這種多路的 分析途徑尤其適合于癌癥診斷，因為癌癥不是簡單的疾病，這種多因子的"團組（panel) "途 徑在細胞學和臨床上都與癌癥的異質(zhì)性一致。
[0021] 成功地將該團組方法用于基于甲基化的診斷測試的關鍵在于設計和開發(fā)可表征 并區(qū)分疾病狀態(tài)的優(yōu)化的標志物團組。本發(fā)明描述了多種尤其有效和獨特的基因團組，對 該團組的一個或多個成員組合的甲基化分析使得能以特別高的敏感性、特異性和/或預測 價值檢測結(jié)腸細胞增殖性病癥。
[0022] 醫(yī)學測試的開發(fā)。任何醫(yī)學篩查或診斷測試的兩個關鍵性的可評估的衡量是其敏 感性和特異性，其衡量該測試沒有遺漏地精確檢測所有受影響個體以及不錯誤地將沒有目 標疾病的個體包括在內(nèi)（預測價值）進行得有多好。歷史上，任何診斷檢測受到非難都是 由于較差的敏感性和特異性。
[0023] 真陽性（TP)結(jié)果是測試為陽性且該疾病狀態(tài)存在的情況。假陽性（FP)結(jié)果是測 試為陽性但該疾病狀態(tài)不存在的情況。真陰性（TN)結(jié)果是測試為陰性且該疾病狀態(tài)不存 在的情況。假陰性（FN)結(jié)果是測試為陰性但該疾病狀態(tài)不存在的情況。在這一點上：敏感 性=TP / (TP+FN);特異性=TN / (FP+TN)以及預測價值=TP / (TP+FP)。
[0024] 敏感性是對在所測試的個體中測試正確檢測靶疾病的測試能力的衡量。具有較差 敏感性的測試產(chǎn)生高比例的假陰性，即個體具有該疾病，但被錯誤的鑒定為沒有該特定疾 病。假陰性的潛在危險是該患病個體仍保持為不能診斷和不治療一段時間，在這段時間該 疾病可能進展至晚期，這時即使有治療方法，效果也可能不太有效。具有低敏感性的測試的 實例為基于蛋白的HIV血液測試。這種類型的測試顯示出較差的敏感性，因為其在疾病完 全確立和病毒以相當數(shù)量侵入血流之前不能檢測到病毒的存在。相反，具有高敏感性的測 試的實例為采用聚合酶鏈式反應（PCR)的病毒載量檢測。因為這種類型的測試可檢測非常 少量的病毒，所以得到高的敏感性。當遺漏診斷的后果重大時，高敏感性就尤其重要。
[0025] 另一方面，特異性是對測試準確鑒別患者沒有該疾病狀態(tài)的能力的衡量。具有較 差特異性的測試產(chǎn)生高比例的假陽性，即個體被錯誤地診斷為具有該疾病。假陽性的缺陷 是它們迫使患者接受不必要的醫(yī)學程序治療，連同它們的伴隨性風險、精神和經(jīng)濟壓力，并 且其會對患者健康帶來不良影響。導致難以開發(fā)具有高特異性的診斷測試的疾病的特征在 于該疾病機制（尤其是癌癥中）通常涉及多種基因和蛋白。此外，某些蛋白可因為與疾病 狀態(tài)不相干的原因而升高。具有高特異性的測試的實例為可檢測Ρ53突變的基于基因的測 試。當與進一步的診斷操作或進一步的醫(yī)學介入有關的費用或風險很高時，特異性就很重 要。
[0026] 現(xiàn)有技術(shù)中的明確需求。公認的是現(xiàn)有技術(shù)中亟需改善癌癥的篩查和早期檢測。 舉例而言，如果可增加結(jié)腸癌篩查特異性，就會減少導致不必要結(jié)腸鏡檢查的假陽性測試 結(jié)果的問題，產(chǎn)生成本的節(jié)約和改善的安全性。鑒于癌癥的總體發(fā)病率，尤其是與現(xiàn)有的結(jié) 腸直腸和肝細胞增殖性病癥篩查方法相關的缺點，現(xiàn)有技術(shù)中很需要早期檢測癌癥，尤其 是結(jié)腸癌的方法，以補充或替代現(xiàn)有的測試。
[0027] 本發(fā)明基因背景。人類Septin9基因（也稱為MLL septin樣融合蛋白、MLL septin 樣融合蛋白 MSF_A、Slpa、Eseptin、Msf、septin樣蛋白卵巢 / 乳腺 septin(0v / Br septin) 以及S印tin Dl)位于染色體17q25位于疊連群AC068594. 15. 1. 168501內(nèi)，為S印tin基因 家族的成員。圖1提供了 Septin9基因的Ensembl注解，并顯示了 4個轉(zhuǎn)錄本變體，Septin9 變體和Q9HC74變體（其為S印tin9轉(zhuǎn)錄本的截短形式）。SEQ ID NO :1提供了所述基因的 序列，包括S印tin9和Q9HC74轉(zhuǎn)錄本的區(qū)域和啟動子區(qū)域。SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3為 其亞區(qū)域，分別提供了 S印tin9和Q9HC74轉(zhuǎn)錄本富含CpG的啟動子區(qū)域的序列。
[0028] 據(jù)推測，S印tin基因家族的成員與從膜泡運輸?shù)桨|(zhì)分裂的多種細胞功能相 關。破壞S印tin9的作用將導致不完全的細胞分裂，參見Surka，M. C，Tsang，CW，and Trimble，W.S. Mol Biol Cell，13 :3532-45 (2002)。S印tin9 和其它的蛋白已顯示為原癌基 因 MLL的融合伴侶分子（fusion partner)，這表明了在腫瘤發(fā)生中的作用，參見Osaka, M， Rowley，J. D.和 Zeleznik-Le，Ν· J. PNAS，96 :6428-6433(1999)。Burrows 等人報道了對卵 巢癌中Septin9基因的多種亞型表達的深入研究，顯示了多種轉(zhuǎn)錄本的組織特異性，參見 Burrows，J. F. , Chanduloy 等人，S. Ε· H. Journal of Pathology，201 :581-588 (2003)。
[0029] 近期對超過7000正常和腫瘤組織的研究（ 優(yōu)先權(quán)日:后發(fā)表的現(xiàn)有技術(shù)）表明 Septin9亞型在數(shù)種腫瘤組織中始終過表達，參見Scott，M.，Hyland，P. L.等人，Oncogene, 24 :4688-4700(2005)。這些作者考慮該基因很可能是II型癌基因，其中RNA轉(zhuǎn)錄本加工的 變化控制了不同蛋白產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，并且這些改變的蛋白亞型的水平可以為惡性腫瘤中基因 的作用提供答案。
[0030] 從FN1基因轉(zhuǎn)錄的MSF(遷移刺激因子）蛋白也已參與了致癌作用（參見W099 / 31233)，但是應注意的是，這種蛋白不是本申請的主題，目前未知其與S印tin9 / MSF基因 及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有關。
[0031] 從以上引用的參考文獻可以看出，連接所述基因和腫瘤發(fā)生的生物機制仍不清 楚。在W0200407441中，聲稱該基因的增加的拷貝數(shù)和過表達是癌癥標志物，并根據(jù)該觀 察結(jié)果進一步提供了診斷和治療該癌癥的手段。相應地，W0200407441是最接近的現(xiàn)有 技術(shù)，因為其與本發(fā)明的方法和核酸有最多數(shù)目的共同特征，并且其涉及相同領域（癌癥 診斷）。本發(fā)明和W0200407441的主要區(qū)別在于本發(fā)明首次顯示基因 Septin9的欠表達 (under-expression)與癌癥相關。更具體地，這是通過甲基化分析來闡明的。表達和DNA 甲基化的相關性，以及用于確定DNA甲基化的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的（參見W099 / 28498)。但是，該欠表達與癌癥的發(fā)生相關對于本領域技術(shù)人員并非顯而易見，尤其是 W0200407441描述了將所述表達調(diào)節(jié)至低水平作為對癌癥的潛在治療。
[0032] SEQ ID N0 :28 提供了位于染色體 17q 上的在 Vitronectin(VTN，0MIM193190,登 錄號 NM000638)和 SARM 基因 （StenlAlphaAndHeat / ArmnadilloMotifs-Containing Protein，0MM607732)的重疊啟動子區(qū)域中的富含CpG的序列。
[0033] VTN基因編碼75-kD的糖蛋白（也稱為血清擴散因子或補體S蛋白），該糖蛋白促 進動物細胞在體外的粘附和擴展，抑制通過補體C5b_9復合物的細胞溶解，并在血液凝集 中調(diào)節(jié)抗凝血酶ΠΙ-凝血酶作用。在結(jié)腸癌細胞中觀察到較高的Vitronectin表達（Exp Cell Res. 1994S?。?14(1) :303-12.)。此外，該基因的表達與癌細胞的進展和侵入性有關。 表明VTN在腫瘤中被活化，通過特異性肽阻斷vitronectin能夠減小腫瘤大小（Bloemendal HJ, de Boer HC, Koop EA, van Dongen AJ, Goldschmeding R, Landman WJ, Logtenberg T, Gebbink MF, Voest EE. Cancer ImmunolImmunother. 2004Sep ；53 (9) :799-808. ；Haier J, Goldmann U, Hotz B, Runkel N, Keilholz U. Clin Exp Metastasis. 2002 ; 19 (8) :665-72.)。
[0034] SARM蛋白由690氨基酸組成并含有被短的HEAT / armadillo重復序列包圍的65 氨基酸不育a (SAM)結(jié)構(gòu)域。Northern印跡分析顯示SARM反義RNA在癌細胞系中可以升 高的水平被檢測，與組織起源或轉(zhuǎn)移潛力無關（Mink, M. ;Fogelgren, B. ;01szewski, K.; Maroy，P. ;Csiszar，K. Genomics74 :234_244, 2001.)。所述研究進一步證實，編碼蛋白的 SARM轉(zhuǎn)錄本僅在所研究的那些中的一個前列腺癌細胞系中表達。
[0035] SEQ IDN0 :24提供了位于染色體3q23上基因叉頭轉(zhuǎn)錄因子L2(F0XL2,腦垂體叉頭 因子，0MM605597)下游的富含CpG序列。迄今為止，SEQ ID N0 :1還不與任何種類的癌癥 相關。F0XL2編碼區(qū)在哺乳動物中是高度保守的，免疫組織化學證據(jù)表明F0XL2是特異地在 眼瞼和胎兒以及成人卵巢濾泡細胞中表達的核蛋白。這表明F0XL2可能在卵巢體細胞分化 和進一步的濾泡發(fā)育和/或維持中起作用（J. Med. Genet. 39 :916-922, 2002.)。
[0036] 此外，F(xiàn)0XL2基因中的突變與瞼裂狹小/上瞼下垂/內(nèi)眥贅皮/倒向性內(nèi)眥贅皮 綜合征（BPES)有關，該綜合征影響到眼瞼和卵巢（Am. J. Hum. Genet. 72:478-487,2003.; Hum. Mutat. 24:189-193,2004)。因此，到目前為止，F(xiàn)0XL2并沒有與癌癥相關，但是其它的 F0X家族成員已參與了癌癥發(fā)生。F0XA1基因在食管和肺癌中被擴增和過表達，F(xiàn)0XM1基因 在胰腺癌和基底細胞癌中上調(diào)，這是由于通過Sonic Hedgehog(SHH)途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
[0037] SEQ ID N0 :27代表Six6(同源異形盒蛋白SIX6)基因的一部分，位于染色體14q 上，別名包括同源結(jié)構(gòu)域蛋白0PTX2、視力同源異形盒2、0PTX2、Sine眼同源異型盒同源物 6、sine眼同源異型盒同源物6 (果蠅）、Six9、SIX9。Six6基因與發(fā)育途徑相關，其異常表 達已與T細胞急性成淋巴細胞白血病癌癥發(fā)生相關。
[0038] SEQ ID N0:25位于染色體17q21.31上，包含NGFR基因的啟動子區(qū)以及NGFR基 因自身（神經(jīng)生長因子受體，也稱為p75,0MM162010)的一部分。NGFR單獨或與其它受體 組合后結(jié)合到神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)突向外生長抑制因子。已證實NGFR在凋亡、外周神經(jīng) 的髓鞘化以及抑制軸突損傷后中樞神經(jīng)細胞的再生中起作用（DobroWSky，R.T. ;Werner， Μ. H. ；Castellino, A. Μ. ；Chao,M.V. ；Hannun, Y. A. Science265 ： 1596-1599,1994 ；Cosgaya, J. M. ；Chan, J. R. ；Shooter, E. M. Science298 ： 1245-1248,2002 ；ffang, K. C ；Kim, J. A.； Sivasankaran，R. ;Segal，R. ;He，Z.Nature420 :74-78, 2002·)。NGFR 基因的甲基化之前已 與結(jié)腸癌的發(fā)生相關（PCT / US04 / 020336)。
[0039] SEQ ID NO :26位于染色體17q2131上，包括基因 TMEFF2的啟動子區(qū)域。TMEFF2的 甲基化已與結(jié)腸癌相關聯(lián)031?^11^8.20005印1;60(17) :4907-12。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0040] 本發(fā)明提供了檢測和/或分類個體中細胞增殖性病癥的方法，包括確定分離自所 述個體的生物樣品中至少一種選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、 VTN、PRDM6、NR2E1、FAT以及SEQ ID NOS :160至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列的表達 水平，其中欠表達（underexpression)和/或CpG甲基化表明所述病癥存在或其種類。本 發(fā)明的多個方面提供了有效和獨特的遺傳標志物，由此對所述標志物的表達分析使得能以 特別高的敏感性、特異性和/或預測價值檢測細胞增殖性病癥。此外，所述標志物使得能區(qū) 分癌性細胞增殖性病癥（包括癌前狀況）和良性細胞增殖性病癥。本發(fā)明的標志物尤其適 合于檢測結(jié)腸直腸癌和肝細胞癌。在結(jié)腸直腸癌方面，本發(fā)明測試方法尤其適用于風險人 群的篩查。本發(fā)明的方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的方法（包括行業(yè)中標準的F0BT)，因為其改善的敏 感性、特異性和可能的患者依從性。
[0041] 本發(fā)明的方法和核酸最優(yōu)選地用于檢測肝癌或?qū)⑵渑c其它肝細胞增殖性病癥區(qū) 分開，或者用于檢測結(jié)腸直腸癌或癌前結(jié)腸直腸細胞增殖性病癥。
[0042] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測和/或分類個體中細胞增殖性病癥的方 法，包括確定分離自所述個體的生物樣品中至少一種選自Septin9 (包括其所有的轉(zhuǎn)錄本 變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NO :160 至 SEQ ID NO :165 的基 因或基因組序列的表達水平，其中欠表達和/或CpG甲基化是所述病癥存在或其種類的指 示。在一個實施方案中，所述表達水平通過檢測轉(zhuǎn)錄自所述基因的mRNA存在與否或水平來 確定。在另一實施方案中，所述表達水平通過檢測所述基因或其序列編碼的多肽的存在與 否或水平來確定。
[0043] 在另一優(yōu)選的實施方案中，所述表達通過檢測所述基因內(nèi)CpG甲基化存在與否來 確定，其中存在甲基化表明存在細胞增殖性病癥。所述方法包括以下步驟：i)使從得自所 述個體的生物樣品（優(yōu)選地選自血漿、血清、全血、分離的血細胞、分離自血液的細胞）中分 離的基因組DNA與至少一種試劑或成組試劑接觸，所述至少一種試劑或成組試劑區(qū)分所述 基因組DNA至少一個靶區(qū)域內(nèi)甲基化和未甲基化CpG二核苷酸，其中所述靶區(qū)域的核苷酸 序列包含至少一種選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、 NR2E1、FAT以及SEQ ID NOS :160至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列的至少一個CpG二 核苷酸序列；及ii)至少部分地檢測和/或分類細胞增殖性病癥。優(yōu)選地，所述靶區(qū)域包 括或在嚴緊條件下雜交至少一種選自SEQ ID N0 :1至SEQ ID N03、SEQ ID NO :24、SEQ ID N0 : 28、SEQ ID NO :159至SEQ ID NO :167的序列的至少16連續(xù)核苷酸的序列。
[0044] 優(yōu)選地，所述檢測的敏感性為約75 %至約96 %，或約80 %至約90 %，或約80 %至 約85 %。優(yōu)選地，所述特異性為約75 %至約96 %，或約80 %至約90 %，或約80 %至約85 %。
[0045] 所述方法是新穎的，因為目前沒有方法能通過分析體液來檢測癌癥，并且具有足 夠高的敏感性和特異性以用在商業(yè)上可行的和管理機構(gòu)許可的測定中。例如，現(xiàn)有的用于 檢測并診斷結(jié)腸直腸癌的方法包括結(jié)腸鏡檢、乙狀結(jié)腸鏡檢和大便潛血結(jié)腸癌。與這些技 術(shù)相比，所公開的發(fā)明比結(jié)腸鏡檢的侵入性更小，并且如同（如果不高于）乙狀結(jié)腸鏡檢和 F0BT的特異性。體液測定的開發(fā)代表了比現(xiàn)有技術(shù)中已知的現(xiàn)有方法有明顯的技術(shù)優(yōu)勢， 其在于至少對于結(jié)腸直腸癌篩選來說，患者對單一的基于體液的測試的依從性會高于目前 所推薦的用于F0BT的三次大便分析。
[0046] 作為進一步的說明，用于檢測和診斷肝癌的現(xiàn)有方法包括PET和MRI成像以及抽 吸物或活檢組織的細胞學篩查。放射學篩查方法通常不在早期檢測癌癥，并且實施起來昂 貴和耗時。細胞學篩查存在與活檢（內(nèi)出血）和抽吸（針跡散播和出血、膽汁性腹膜炎以 及氣胸）有關的風險。因而，在早期階段檢測癌癥目前還是不可能的，并且由于早期檢測大 大改善患者預后，所以現(xiàn)有技術(shù)中亟需這樣的篩查測試。
[0047] 在具體的實施方案中，所述方法包括使用至少一種選自Septin9(包括其所有的 轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NO :160 至 SEQ ID NO :165 的基因或基因組序列作為標志物來檢測并區(qū)分細胞增殖性病癥。本發(fā)明尤其適合于檢測癌 性細胞增殖性病癥（包括在癌前階段）。此外，本發(fā)明的方法和核酸使得能區(qū)分惡性細胞增 殖性病癥和良性細胞增殖性病癥。本發(fā)明的方法和核酸在檢測結(jié)腸直腸或肝癌性病癥和癌 前病癥中尤其有效。此外，它們在區(qū)分癌性和良性細胞增殖性結(jié)腸直腸和肝細胞病癥中有 用。
[0048] 所述基因的用途可通過對基因表達的任何分析、通過mRNA表達分析或蛋白表 達分析來實現(xiàn)。但是，在大多數(shù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，是通過分析至少一種選自 S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NO :160至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列及其啟動子或調(diào)節(jié)元件的甲基化狀態(tài)來實現(xiàn) 區(qū)別和區(qū)分結(jié)腸直腸或肝細胞增殖性病癥的。
[0049] 本發(fā)明提供了分析生物樣品與細胞增殖性病癥的產(chǎn)生相關的特征的方法，所述方 法特征在于使至少一種選自 SEQ ID NO : 1 至 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :24、SEQ ID N0 :28、SEQ ID NO : 159至SEQ ID NO : 167的核酸或其片段與能夠區(qū)分所述基因組序列或目的序列內(nèi)甲 基化和未甲基化CpG二核苷酸的試劑或成組試劑接觸。
[0050] 本發(fā)明提供了確定基因組DNA的與瘤性細胞增殖性病癥（例如癌癥）有關的表觀 遺傳參數(shù)的方法。所述方法在改善診斷、治療和監(jiān)測所述疾病方面有實用性。
[0051] 優(yōu)選地，測試樣品的來源選自細胞或細胞系、組織學切片、組織活檢、石蠟包埋的 組織、體液、精液、糞便、尿、血及其組合。更優(yōu)選地，所述來源選自糞便、血漿、血清、全血、分 離的血細胞、從得自所述個體的血中分離的細胞。
[0052] 具體地，本發(fā)明提供了用于檢測包括早期癌前階段在內(nèi)的瘤性細胞增殖性病癥 (優(yōu)選結(jié)腸直腸和/或肝細胞）以及用于區(qū)分癌性和良性細胞增殖性病癥的方法，包括：獲 得包含基因組核酸的生物樣品；使所述核酸或其片段與一種試劑或多種試劑接觸，所述一 種試劑或多種試劑足以區(qū)分所述個體核酸的至少一種靶序列內(nèi)的甲基化和未甲基化的CpG 二核苷酸序列，其中所述靶序列包含或在嚴緊條件下雜交包含特定序列的至少16連續(xù)核 苷酸的序列，該特定序列選自 SEQ ID N0 :1 至 SEQ ID N03、SEQ ID N0 :24、SEQ ID N0 :28、SEQ ID NO. 159至SEQ ID NO : 167,包含至少一個CpG二核苷酸序列的所述連續(xù)核苷酸；以及至少 部分地基于所述區(qū)分，確定至少一個靶CpG二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)，或反映多個靶CpG 二核苷酸序列的平均甲基化狀態(tài)的均值或值。
[0053] 優(yōu)選地，對靶序列內(nèi)甲基化和未甲基化CpG二核苷酸序列的區(qū)分包括使至少一個 這類CpG二核苷酸序列甲基化狀態(tài)依賴地轉(zhuǎn)變或不轉(zhuǎn)變?yōu)閷霓D(zhuǎn)變的或未轉(zhuǎn)變的二核 苷酸序列，所述至少一個這類CpG二核苷酸序列位于選自SEQ ID N0 :10至SEQ ID N0 :15， SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39, SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :168 至 SEQ ID NO :203的序列及對應于該靶序列的其連續(xù)區(qū)域內(nèi)。
[0054] 其它的實施方案提供了檢測癌性細胞增殖性病癥（或?qū)⑺鼈兣c良性細胞增殖性 病癥區(qū)分開）的方法，尤其是結(jié)腸直腸或肝細胞的癌性細胞增殖性病癥，包括：獲得具有個 體基因組DNA的生物樣品；提取該基因組DNA ;以一種或多種試劑處理基因組DNA或其片 段，以將5位的未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶或其它在雜交性質(zhì)上可檢測地不同于 胞嘧啶的堿基；使經(jīng)處理的基因組DNA或其經(jīng)處理的片段與擴增酶和至少兩種引物接觸， 所述引物在各種情況下都包含互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交選自SEQ ID NO :10 至 SEQ ID NO :15, SEQ ID NO. 28 至 SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO :31，SEQ ID NO : 42 至 SEQ ID NO :43, SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39, SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :168至SEQ ID NO :203序列及其互補序列的至少9核苷酸長連續(xù)序列，其中經(jīng)處理的DNA 或其片段被擴增以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物或未被擴增；以及基于所述擴增產(chǎn)物的存在與否或性質(zhì)， 確定選自 SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159 至 SEQ ID NO :167的序列的至少一個、更優(yōu)選多個CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)或均值，或反映其甲 基化水平的均值的值。
[0055] 優(yōu)選地，確定包括使用至少一種以下方法：1)使至少一種包含至少9核苷酸長度 的連續(xù)序列的核酸分子雜交，該連續(xù)序列互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交選自SEQ ID N0 :10 至 SEQ ID N0 :15、SEQ ID N0 :28 至 SEQ ID N0 :33、SEQ ID N0 :30 至 SEQ ID N0 :31、 SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO : 51、SEQ ID NO :168至SEQ ID NO :203及其互補序列的序列；ii)使至少一種結(jié)合到固相的核 酸分子雜交，該核酸分子包含至少9核苷酸長度連續(xù)序列，其互補于或在中等嚴緊或嚴緊 條件下雜交選自 SEQ ID N0 :10 至 SEQ ID N0 :15、SEQ ID N0 :28 至 SEQ ID N0 :33、SEQ ID N0 : 30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :168 至 SEQ ID NO :203 的序列；iii)使至少一種核酸分 子雜交，該核酸分子包含互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交選自SEQ ID NOS :10至SEQ ID NO : 15、SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NOS :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168至SEQ ID NO :203及其互補序列的序列的至少9核苷酸長度連續(xù)序列，并且延伸至 少一種這種雜交的核酸分子至少一個核苷酸；以及iv)對擴增產(chǎn)物測序。
[0056] 其它的實施方案提供了分析（例如檢測和/或分類）細胞增殖性病癥的方法，包 括：獲得具有個體基因組DNA的生物樣品；提取該基因組DNA ;使包含一種或多種選自SEQ ID N0 :1 至 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :24、SEQ ID N0 :28、SEQ ID NO :159 至 SEQ ID NO :167 的 序列或在嚴緊條件下與其雜交的序列的該基因組DNA或其片段與一種或多種甲基化敏感 的限制酶接觸，其中該基因組DNA被消化以產(chǎn)生消化片段或沒有因此而被消化；以及基于 至少一種這樣的片段的存在與否或其性質(zhì)，確定至少一種選自SEQ ID NO : 1至SEQ ID N0 :3、 SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159至 SEQ ID NO :167 的基因組序列的至少一個CpG 二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)，或者反映其多個CpG二核苷酸序列的平均甲基化狀態(tài)的均值 或值。優(yōu)選地，在所述確定之前擴增被消化的或未被消化的基因組DNA。
[0057] 其它的實施方案提供了新的基因組和化學修飾的核酸序列以及寡核苷酸和/或 PNA寡聚體，用于分析選自 SEQ IDN0 :1 至 SEQ IDN0 :3、SEQ IDN0 :24、SEQ IDN0 :28、SEQ ID NO :159至SEQ ID NO :167的序列內(nèi)胞嘧啶甲基化模式。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0058] 圖1顯示了 S印tin9和Q9HC74基因轉(zhuǎn)錄本的Ensembl人基因組注解。也顯示了 SEQ ID N0 :2 和 SEQ ID N0 :3 的相對位置。
[0059] 圖2提供了三個圖。左邊的兩個圖顯示了實施例2中結(jié)腸直腸癌和血液樣品中測 定SEQ ID N0 :1(測定2)的敏感性。右邊的圖提供了結(jié)腸直腸癌檢測的R0C。
[0060] 圖3顯示了實施例4的其它癌癥中測定的甲基化水平。
[0061] 圖4顯示實施例4的其它非癌性疾病中測定的甲基化水平。
[0062] 圖5至圖29提供了實施例5的酸式亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)的矩陣。該矩陣的每列代 表一個樣品的重復測序數(shù)據(jù)，每個樣品的所有重復被分在一個塊中。矩陣的每行代表片段 內(nèi)的單一 CpG位點。擴增產(chǎn)物的CpG數(shù)顯示在矩陣的左側(cè)。在每個CpG位置測量的甲基化 的量由從淺灰色（〇%甲基化）、至中灰（50%甲基化），至黑灰（100%甲基化）表示。一些 擴增產(chǎn)物、樣品或CpG位置未被成功測序，它們顯示為白色。
[0063] 圖5至圖12提供了在4個以前被定量（通過他3￥7|/[61:1171分析）具有10%至 20%甲基化的樣品中，根據(jù)表21的基因組序列的酸式亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化擴增產(chǎn)物的測序概況。
[0064] 圖13至圖20提供了在2個以前被定量（通過!1冊^〇^的1^1111分析）具有高于20 (% 甲基化的樣品中，根據(jù)表21的基因組序列的酸式亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化擴增產(chǎn)物的測序概況。
[0065] 圖21至圖22提供了在3個健康個體血液樣品中根據(jù)表21的基因組序列的酸式 亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化擴增產(chǎn)物的測序概況。
[0066] 圖23至圖29提供了在6個以前被定量（通過HeavyMethyl分析）具有低于10% 甲基化（但高于〇% )的樣品中，根據(jù)表21的基因組序列的酸式亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化擴增產(chǎn)物的 測序概況。
[0067] 圖30至圖37每一個提供了 3個圖。左側(cè)的兩個圖顯示了實施例2中結(jié)腸直腸癌 和血液樣品中根據(jù)表12的測定的敏感性。上方的圖顯示了兩種樣品的二元分布，而下方的 圖提供了多類分布。所述圖的Y軸顯示具有大于顯示在X軸上的定量值的甲基化水平的經(jīng) 分析樣品的比例。

【具體實施方式】
[0068] 定義：
[0069] 術(shù)語"觀測/預期比"（"0 / E比"）指CpG二核苷酸在特定DNA序列中的頻率， 對應于[CpG位點數(shù)/ (C堿基數(shù)X G堿基數(shù)）]/每一片段的帶長（band length).
[0070] 術(shù)語"CpG島"指滿足以下標準的基因組DNA的連續(xù)區(qū)域：（1)對應于"觀測/預期 t匕"的CpG二核苷酸頻率>0.6,以及（2) "GC含量">0.5。CpG島的長度通常但并非總是在 約0. 2至約1KB，或至2kb之間。
[0071] 術(shù)語"甲基化狀態(tài)"或"甲基化狀況"指DNA序列內(nèi)一個或多個CpG二核苷酸處存 在或不存在5-甲基胞嘧啶（"5-mCyt")。DNA序列內(nèi)一個或多個特定CpG甲基化位點（每 處具有兩個CpG二核苷酸序列）處的甲基化狀態(tài)包括"未甲基化的"、"全甲基化的"和"半 甲基化的"。
[0072] 術(shù)語"半-甲基化"或"半甲基化"指雙鏈DNA的甲基化狀態(tài)，其中只有一條鏈被 甲基化。
[0073] 用在本文時，術(shù)語"AUC"為area under a curve (曲線下面積）的縮寫。具體地， 它指受試者工作特征（R0C)曲線下的面積。R0C曲線為真陽性率相對假陽性率的曲線，用 于診斷測試的不同可能性臨界值。其顯示取決于所選臨界值的敏感性和特異性之間的折中 (敏感性的任何提高都會伴隨有特異性的下降）。R0C曲線下的面積（AUC)是對診斷測試 精確性的衡量（面積越大越好，最佳值是1，隨機測試的R0C曲線位于對角線，面積為0. 5 ; 參見 J. P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis (信號檢測理論和 R0C 分析）， Academic Press, New York, 1975)。
[0074] 術(shù)語"超甲基化"指相對于正常對照DNA樣品內(nèi)對應CpG二核苷酸處發(fā)現(xiàn)的5-mCyt 的量來說，對應于測試DNA樣品的DNA序列內(nèi)一個或多個CpG二核苷酸處5-mCyt的出現(xiàn)率 增加的平均甲基化狀態(tài)。
[0075] 術(shù)語"低甲基化"指相對于正常對照DNA樣品內(nèi)對應CpG二核苷酸處發(fā)現(xiàn)的5-mCyt 的量來說，對應于測試DNA樣品的DNA序列內(nèi)一個或多個CpG二核苷酸處5-mCyt的出現(xiàn)率 減少的平均甲基化狀態(tài)。
[0076] 術(shù)語"微陣列"在廣義上，如本領域所接受地，指"DNA微陣列"和"DNA芯片"，包 括所有已認可的固體支持物，并包括用于將核酸分子附于其上或在其上合成核酸的所有方 法。
[0077] "遺傳參數(shù)"為基因和序列的突變和多態(tài)性，為它們的調(diào)節(jié)進一步所需。被認為是 突變的尤其是插入、刪除、點突變、倒位以及多態(tài)性，并且尤其優(yōu)選SNP (單核苷酸多態(tài)性）。
[0078] "表觀遺傳參數(shù)（epigenetic parameter) "尤其是指胞啼陡甲基化。其它的表觀遺 傳參數(shù)例如包括組蛋白的乙?；?，但是其不能采用所述的方法直接分析，但是其與DNA甲 基化相關。
[0079] 術(shù)語"亞硫酸氫鹽試劑"指包括亞硫酸氫鹽（bisulfite)、disulfite、酸式亞硫酸鹽 (hydrogen sulfite)或其組合，如本文所公開的，用于區(qū)分甲基化的和未甲基化的CpG二核 苷酸序列。
[0080] 術(shù)語"甲基化測定"指確定DNA序列內(nèi)一個或多個CpG二核苷酸序列的甲基化狀 態(tài)的任何測定。
[0081] 術(shù)語"MS. AP-PCR"（甲基化敏感的隨機引物聚合酶鏈式反應）指采用富含CG的 引物全面掃描基因組以便能集中于最可能含有CpG二核苷酸的區(qū)域的本領域已知技術(shù)，如 Gonzalgo 等人，Cancer Research57 :594_599,1997 所描述的。
[0082] 術(shù)語 "MethyLight?" 指本領域已知的由 Eads 等人，Cancer Res. 59 :2302-2306, 1999描述的基于熒光的實時PCR技術(shù)。
[0083] 在本文使用的其實施方案中，術(shù)語"HeavyMethyl?"測定法指這樣的測定，其中覆 蓋位于擴增引物之間或被擴增引物覆蓋的CpG位置的甲基化特異的阻斷探針（本文也稱為 阻斷劑）使得甲基化特異的選擇性擴增核酸樣品成為可能。
[0084] 在本文使用的其實施方案中，術(shù)語"HeavyMethyl? MethyLight?"測定法指 HeavyMethyl? MethyLight? 測定，其是 MethyLight? 測定的變體，其中 MethyLight? 測定 與覆蓋擴增引物之間CpG位置的甲基化特異阻斷探針聯(lián)合。
[0085] 術(shù)語"Ms-SNuPE"（甲基化敏感單核苷酸引物延伸）指已知的由Gonzalgo & Jones，Nucleic Acids Res. 25 :2529-2531,1997 描述的測定。
[0086] 術(shù)語"MSP"（甲基化特異PCR)指已知的由Herman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :9821-9826,1996以及由美國專利5, 786,146描述的甲基化測定。
[0087] 術(shù)語"COBRA"（聯(lián)合的亞硫酸氫鹽限制性分析）指已知的由Xiong & Laird， Nucleic Acids Res. 25 :2532-2534,1997 描述的甲基化測定。
[0088] 術(shù)語"MCA"（甲基化的 CpG 島擴增）指由 Toyota 等人，Cancer Res. 59 :23〇7_12, 1999以及W000 / 26401A1中描述的甲基化測定。
[0089] 術(shù)語"雜交作用"應被理解為寡核苷酸與互補序列沿樣品DNA中Watson-Crick堿 基配對線的鍵合，形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。
[0090] 本文中定義的"嚴緊雜交條件"包括在68°C下在5x SSC / 5x Denhardt溶液/ 1.0%SDS中雜交，并在室溫下在0. 2xSSC / 0. 1%SDS中洗滌，或者包括其已知的等同條件 (例如這樣的條件：雜交在60°C下在2. 5x SSC緩沖液中進行，隨后是在37°C下在低緩沖濃度 下的幾個洗滌步驟，并保持穩(wěn)定）。本文中定義的中等嚴緊條件包括在42°C下在在3x SSC 中洗滌，或其已知的等同條件?？筛淖凔}濃度和溫度參數(shù)以獲得探針和靶核酸之間最佳水 平的同一'I"生。在現(xiàn)有技術(shù)中可獲得對這些條件的指導，例如Sambrook等人，1989, Molecular Cloning，A Laboratory Manual (分子克隆實驗指南），Cold Spring Harbor Press，Ν· Υ·以 及 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學實驗），（John Wiley & Sons，Ν· Υ·)單元 2· 10。
[0091] 術(shù)語"甲基化特異限制酶"或"甲基化敏感限制酶"應被理解為根據(jù)其識別位點的 甲基化狀態(tài)而選擇性消化核酸的酶。對于當識別位點未被甲基化或半甲基化時才特異剪切 的限制酶來說，當識別位點被甲基化時，不會發(fā)生剪切，或以顯著降低的效率剪切。對于當 識別位點被甲基化時才特異剪切的限制酶來說，當識別位點未被甲基化時，不會發(fā)生剪切， 或以顯著降低的效率剪切。優(yōu)選的是甲基化特異的限制酶，其識別序列含有CG二核苷酸 (例如Cgcg或cccggg)。對一些實施方案來說，進一步優(yōu)選的為當該二核苷酸中的胞啼陡 在C5碳原子被甲基化時不切割的限制酶。
[0092] "非甲基化特異的限制酶"或"非甲基化敏感的限制酶"為與甲基化狀態(tài)無關而以 基本相同的效率切割核酸序列的限制酶。它們也被稱為"甲基化非特異性限制酶"。
[0093] 術(shù)語"基因"應被認為是包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體（例如，術(shù)語"S印tin9"應包括 例如其截短的轉(zhuǎn)錄本Q9HC74)以及其所有的啟動子和調(diào)節(jié)元件。此外，由于已知在所述基 因內(nèi)有多個SNP，所以該術(shù)語應被認為包括其所有的序列變體。
[0094] 術(shù)語"癌變前的"或"瘤變前的"或其等同用語應被認為是指正經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)變的任 何細胞增殖病癥。就結(jié)腸直腸細胞增殖性病癥來說，這類狀況的實例包括高度發(fā)育異常的 細胞增殖性疾病，包括以下類別的腺瘤：
[0095] 等級1 :惡性腺體從肌粘膜滲透入息肉頭部（polyp head)內(nèi)的粘膜下層：
[0096] 等級2 :相同的粘膜下層侵入，但存在于頭部至莖部的接合處；
[0097] 等級3:侵入莖部；以及
[0098] 等級4 :在連接至結(jié)腸壁的連接處侵入莖的基部（該等級對應于Dukes A期）。
[0099] 概沭
[0100] 本發(fā)明提供檢測和/或分類個體中細胞增殖性疾病的方法，包括確定分離自所述 個體的生物樣品中至少一個選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、 PRDM6、NR2E1、FAT以及SEQ1D NOS :160至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列的表達水平， 其中欠表達和/或CpG甲基化表明所述病癥的存在或類別。所述標志物可以用于診斷瘤性 細胞增殖性病癥（癌癥），包括疾病的癌變前期期間的早期檢測，以及還用于區(qū)分瘤性和良 性細胞增殖病癥。本發(fā)明公開方法，其中瘤性細胞增殖性疾病和良性細胞增殖性疾病被區(qū) 分開，所述方法的特征在于欠表達和/或存在CpG甲基化表明存在瘤性細胞增殖疾病或瘤 前病癥，其不存在則表明存在良性細胞增殖性疾病。
[0101] 本發(fā)明的標志物在檢測或區(qū)分肝細胞增殖性病癥或者檢測或區(qū)分結(jié)腸直腸細胞 增殖性病癥方面尤其有效，由此提供了早期檢測、分類和治療所述病癥的改良的手段。
[0102] 除了以上分析至少一個選自選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、 SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID NO :165 的基因或基因組序列 的甲基化的實施方案之外，本發(fā)明還提供具有新的應用的用于檢測癌癥尤其是肝癌和/或 結(jié)腸直腸癌的成組的基因，包括選自至少一個選自Septin9 (包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、 F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ IDN0S :160 至 SEQ ID NO :165 的基因或基因 組序列。
[0103] 在第一其它實施方案中，本發(fā)明是基于對至少一個選自S印tin9(包括其所有的 轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID NO :165 的基因或基因組序列的CpG甲基化狀態(tài)的分析。進一步優(yōu)選所述基因的序列如表1所示。
[0104] DNA的亞硫酸氫鹽修飾為已知的用于評估CpG甲基化狀態(tài)的工具。在真核細胞的 DNA中，5-甲基胞嘧啶是最常見的共價堿基修飾。其例如在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、遺傳印跡以及腫瘤發(fā) 生中起作用。因此確認5-甲基胞嘧啶作為遺傳信息組分有相當大的意義。但是，5-甲基胞 嘧啶不能通過測序來鑒定，因為5-甲基胞嘧啶與胞嘧啶有相同的堿基配對行為。此外，例 如在PCR擴增過程中，5-甲基胞嘧啶攜帶的表觀遺傳信息則完全丟失。
[0105] 最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亞硫酸氫鹽與胞嘧啶的特 異反應，由此在隨后的堿性水解后，胞嘧啶被轉(zhuǎn)變?yōu)樵谂鋵π袨樯蠈叵汆奏さ哪蜞奏ぁ?但重要的是，在這些條件下5-甲基胞嘧啶保持不被修飾。結(jié)果，原始的DNA以此方式被轉(zhuǎn) 變，使得原來在其雜交行為上不能與胞嘧啶區(qū)分開的甲基胞嘧啶現(xiàn)在可作為僅剩的胞嘧啶 被常規(guī)的已知分子生物學技術(shù)檢測到，例如通過擴增和雜交。所有這些技術(shù)都基于不同的 堿基配對特性，現(xiàn)在可被充分利用了。
[0106] 就敏感性而言，現(xiàn)有技術(shù)由方法確定，該方法包括將待分析的DNA包封在瓊脂糖 基質(zhì)中，由此防止DNA擴散和復性（亞硫酸氫鹽僅與單鏈DNA反應），并且用快速透析替代 所有的沉淀和純化步驟（〇lek A 等人，A modified and improved methodfor bisulfite based cytosine methylation analysis (用于基于亞硫酸氫鹽的胞啼陡分析的改變和改進的方 法），NucleicAcids Res. 24 :5064-6,1996))。因而有可能分析單個細胞的甲基化狀態(tài)，說明 該方法的實用性和敏感性。Rein，T等人，Nucleic Acids Res.，26 :2255,1998提供了對檢 測5-甲基胞嘧啶的已知方法的綜述。
[0107] 除了極個別例子外（例如，Zeschnigk Μ 等人，Eur J Hum Genet. 5 :94_98,1997), 該亞硫酸鹽技術(shù)目前僅用于研究。在所有情況下，在亞硫酸氫鹽處理后擴增已知基因的短 的特異性片段，并且或者完全測序（〇lek & Walter，Nat Genet. 199717 :275-6,1997)，或 者進行一個或多個引物延伸反應（Gonzalgo & Jones，NucleicAcids Res.，25 :2529_31， 1997 ;W095 / 00669;美國專利6, 251,594)以分析各個胞嘧啶位置，或者通過酶消化處理 (Xiong&Laird，Nucleic Acids Res.，25 :2532-4,1997)。通過雜交作用的檢測在現(xiàn)有技術(shù) 中也有描述（Olek等人，《099 / 28498)。此外，也描述了使用亞硫酸氫鹽技術(shù)針對單個基 因的甲基化檢測（Grigg & Clark，Bioessays，16 :431_6,1994 ;Zeschnigk Μ 等人，Hum Mol Genet.，6 :387-95,1997 ;Feil R 等人，NucleicAcids Res.，22 :695-，1994 ;Martin V 等人， Gene，157 :261-4,1995 ;w09746705 以及 W09515373)。
[0108] 本發(fā)明還提供該亞硫酸氫鹽技術(shù)與一種或多種甲基化測定的聯(lián)合使用，用于確定 至少一種選自 SEQ ID N0S :1 至 SEQ ID NO :3、SEQID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167的序列內(nèi)的CpG二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)?；蚪MCpG二核苷酸可被甲 基化或未被甲基化（或者分別稱為上和下甲基化（up-and down-methylated))。但是，本發(fā) 明的方法適于分析異質(zhì)的生物樣品，例如血液或糞便中的低濃度腫瘤細胞。因此，當分析這 種樣品中CpG位置的甲基化狀態(tài)時，本領域技術(shù)人員可以使用定量測定法來確定特定CpG 位置處的甲基化水平（例如百分比、份數(shù)、比率、比例或程度），而不是甲基化狀態(tài)。相應地， 術(shù)語甲基化狀況或甲基化狀態(tài)還應被認為是指反映 CpG位置處甲基化程度的值。除非有明 確說明，術(shù)語"超甲基化"或"上甲基化"應被認為是指甲基化水平超過特定的臨界值，其中 所述的臨界值可以是代表給定群體的平均或中值甲基化水平的值，或優(yōu)選為優(yōu)化的臨界水 平。在本文中"臨界"也可指"閾值"。在本發(fā)明的上下文中，對于在選自以下序列的基因或 基因組序列內(nèi)的或與其有關的（例如在啟動子或調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)）所有CpG位置來說，術(shù)語"甲基 化的"、"超甲基化的"或"上甲基化的"應被認為是包括甲基化水平高于臨界值零（0) % (或 其等同值）甲基化，所述序列為S印tin9 (包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、 PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID N0 :165。
[0109] 根據(jù)本發(fā)明，確定 SEQ ID N0S :1 至 SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :28, SEQ ID NOS :159至SEQ ID NO :167內(nèi)CpG二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)在診斷和表征細胞增殖性 疾病方面均有用處。甲基化測定方法?，F(xiàn)有技術(shù)中已知多種甲基化測定方法，并且可與本發(fā) 明聯(lián)合使用。這些測定使得能夠確定DNA序列內(nèi)一個或多個CpG二核苷酸（例如CpG島） 的甲基化狀態(tài)。其中，這類測定包括經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA的DNA測序、PCR(用于序列 特異性擴增）、Southern印跡分析、使用甲基化敏感的限制酶以及其它技術(shù)。
[0110] 例如，通過使用亞硫酸氫鹽處理，基因組測序被簡化用來分析DNA甲基化模 式和 5-甲基胞啼陡的分布（Fro_er 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :1827-1831, 1992)。此外，使用限制酶消化從經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變的DNA擴增的PCR產(chǎn)物，例如Sadri & Hornsby (Nucl.Acids Res. 24 :5058-5059,1996),或 COBRA(Combined Bisulfite Restriction Analysis (聯(lián)合的亞硫酸氫鹽分析））（Xiong & Laird，Nucleic Acids Res. 25 : 2532-2534,1997)所描述的方法。
[0111] COBRA. COBRA?是可用于確定小量基因組DNA中特定基因座處的DNA甲基化水平 的定量甲基化測定（Xiong&Laird，Nucleic Acids Res. 25 :2532-2534,1997)。簡言之，將 限制酶消化用于揭示經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA的PCR產(chǎn)物中甲基化依賴的序列差異。根據(jù) Frommer 等人描述的方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :1827-1831，1992)首先通過標準亞 硫酸氫鹽處理將甲基化依賴的序列差異引入基因組DNA。隨后采用對目的CpG島特異的引 物進行經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變的DNA的PCR擴增，接著是限制性內(nèi)切酶消化、凝膠電泳以及采用 特異的被標記的雜交探針檢測。在原始DNA樣品中的甲基化水平由被消化的和未被消化的 PCR產(chǎn)物的相對量表示，其在大范圍的DNA甲基化水平范圍內(nèi)為線性定量的。此外，這種技 術(shù)可可靠地用于從顯微解剖的石蠟包埋的組織樣品獲得的DNA。
[0112] 用于COBRA?分析的典型試劑（例如，可以在典型的基于COBRA?的試劑盒中找到） 可以包括，但不限于：用于特定基因（或經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列或CpG島）的PCR引 物；限制性酶和適合的緩沖液；基因雜交寡核苷酸；對照雜交寡核苷酸；用于寡核苷酸探針 的激酶標記試劑盒；以及標記的核苷酸。另外，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變試劑可包括：DNA變性緩沖 液；磺化緩沖液；DNA回收試劑或試劑盒（例如，沉淀、超濾、親和柱）；脫磺酸基緩沖液；以 及DNA回收組分。
[0113] 優(yōu)選地，諸如"MethyLight?"（基于熒光的實時PCR技術(shù)）（Eads等人，Cancer Res. 59 :2302-2306,1999)、Ms-SNuPE?(甲基化敏感的單核苷酸引物延伸）反應（Gonzalgo & Jones，NucleicAcidsRes. 25 :2529-2531,1997)、甲基化特異性 PCR("MSP";Herman 等人， Proc. Natl. Acad Sci. USA93 :9821-9826,1996 ;美國專利 5, 786,146)以及甲基化的 CpG 島 擴增（"MCA" ;Toyota等人，Cancer Res. 59:2307-12,1999)的測定被單獨或與這些方法中 的其它方法聯(lián)合使用。
[0114] "HeavyMethyl?"測定技術(shù)是用于評估甲基化差異的定量方法，其基于對經(jīng)亞硫酸 氫鹽處理的DNA的甲基化特異擴增。覆蓋位于擴增引物之間或被擴增引物覆蓋的CpG位 置的甲基化特異阻斷探針（在本文中也被稱為阻斷劑）使得甲基化特異選擇性擴增核酸 樣品稱為可能。在本文應用的其實施方案中，術(shù)語"HeavyMethyl? MethyLight?"測定指 HeavyMethyl? MethyLight?測定，其中MethyLight?測定與覆蓋擴增引物之間CpG位置的 甲基化特異阻斷探針聯(lián)合。HeavyMethyl?測定也可與甲基化特異的擴增引物聯(lián)合使用。
[0115] 通常用于HeavyMethyl?分析的典型試劑（例如，可在典型的基于MethyLight?的 試劑盒中找到）可以包括，但不限于：用于特定基因（或經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列或 CpG島）的PCR引物；阻斷寡核苷酸；優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
[0116] MSP. MSP (甲基化特異的PCR)使得能評估CpG島內(nèi)基本上任何CpG位點組的甲基 化狀態(tài)，而與甲基化敏感的限制酶的使用無關（Herman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 : 9821-9826,1996 :美國專利5, 786,146)。簡言之，用亞硫酸氫鈉修飾DNA，將所有未甲基化 的而不是甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，接著用相對于未甲基化DNA而特異于甲基化DNA 的引物擴增。MSP僅需要小量的DNA，對給定CpG島部位的0. 1%的甲基化等位基因敏感， 并且可在從石蠟包埋的樣品中提取的DNA上進行。用于MSP分析的典型試劑（例如，可能 在典型的基于MSP的試劑盒中找到）包括，但不限于：用于特定基因（或經(jīng)亞硫酸氫鹽處理 的DNA序列或CpG島）的甲基化的和未甲基化的PCR引物、優(yōu)化的PCR緩沖液以及脫氧核 苷酸和特異探針。
[0117] MethyLight?. MethyLight?測定為高通量定量甲基化測定，其使用基于熒光的實 時PCR(TaqMan? )技術(shù)，在PCR步驟后不需要進一步的操作（Eads等人,Cancer Res. 59 : 2302-2306,1999)。簡言之，MethyLight?方法以基因組DNA的混合樣品開始，該混合樣品 根據(jù)標準操作（亞硫酸氫鹽過程將未甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶）在亞硫酸氫鈉反 應中被轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆蕾嚨男蛄胁町惖幕旌铣?。隨后在"偏移的（biased)"反應（采用重 疊已知CpG二核苷酸的PCR引物）中進行基于熒光的PCR。可在擴增過程水平以及在熒光 檢測過程水平上產(chǎn)生序列差別。
[0118] MethyLight?測定可以用作基因組DNA樣品中甲基化模式的定量測試，其中序列 區(qū)分發(fā)生在探針雜交水平上。在該定量方式中，在重疊特定的推定甲基化位點的熒光探針 存在下，PCR反應提供了甲基化特異的擴增。用于輸入DNA量的無偏移對照由以下反應提 供：其中引物和探針都不覆蓋任何CpG二核苷酸。或者，通過以不"覆蓋"已知甲基化位點 的對照寡核苷酸（HeavyMethyl?和MSP技術(shù)的基于熒光的方式），或者以覆蓋潛在甲基化 位點的寡核苷酸探測偏移的PCR池來實現(xiàn)對基因組甲基化的定量測試。
[0119] MethyLight?方法可與任何適合的探針一起使用，如"TaqMan?"、 "Lightcycler?"等等。例如，用亞硫酸氫鈉處理雙鏈基因組DNA,并對其進行采用 TaqMan⑧探針的兩套PCR反應之一；例如，采用MSP引物和/或HeavyMethyl阻斷劑寡 核苷酸和TaqMarr?探針。該TaqMan?探針為熒光"報道物"和"淬滅"分子雙標記的， 并被設計為特異于相對高GC含量區(qū)，以至于其在PCR循環(huán)中以比正向或反向引物高約10°C 的溫度熔解。這使得TaqMan?探針在PCR退火/延伸步驟中保持充分雜交。當Taq聚合 酶在PCR中酶合成新鏈時,其最終會遇到退火的TaqMan?探針。Taq聚合酶5'至3'內(nèi) 切酶活性隨后將通過消化TaqMan?探針而頂替它，從而釋放熒光報道物分子用于采用實 時熒光檢測系統(tǒng)定量檢測其現(xiàn)在未被淬滅的信號。
[0120] 用于MethyLight?分析的典型試劑（例如，可以在基于MethyLight?的試劑盒中 找到的）可以包括，但不限于：用于特定基因（或亞硫酸氫鹽處理的DNA序列或CpG島） 的pcr引物；TaqMan?或Lightcycler?探針；優(yōu)化的pcr緩沖液以及脫氧核苷酸；以及 Taq聚合酶。
[0121] QM?(定量甲基化）測定為基因組DNA樣品中甲基化模式的另一種定量測試，其中 序列區(qū)分出現(xiàn)在探針雜交水平上。在這種定量方式中，PCR反應在熒光探針的存在下提供 無偏移的擴增，其中該熒光探針重疊特定的推定甲基化位點。由這樣的反應來提供輸入DNA 量的無偏移的對照：即其中引物或探針都不重疊任何CpG二核苷酸?；蛘撸ㄟ^以不"覆蓋" 已知甲基化位點的對照寡核苷酸（HeavyMethyl?和MSP技術(shù)的基于熒光的方式），或者以 覆蓋潛在甲基化位點的寡核苷酸探測偏移的PCR池來實現(xiàn)對基因組甲基化的定量測試。 [0122] QM ?方法在擴增過程中可與任何適合的探針一起使用，如"TaqMan?" Lightcyc丨er?等等。例如，用亞硫酸氫鈉處理雙鏈基因組DNA,并對其使用無偏移的引物 和TaqMan?:探針。該TaqMan?探針為熒光"報道物"和"淬滅"分子雙標記的，并被設 計為特異于相對高GC含量區(qū)，以至于其在PCR循環(huán)中以比正向或反向引物高約10°C的溫 度熔解。這使得TaqMan?探針在pcr退火/延伸步驟中保持充分雜交。當Taq聚合酶在 PCR中酶合成新鏈時，其最終會遇到退火的TaqMan?探針。Taq聚合酶5'至3'內(nèi)切酶活 性隨后將通過消化TaqMan?探針而頂替它，從而釋放熒光報道物分子用于采用實時熒光 檢測系統(tǒng)定量檢測其現(xiàn)在未被淬滅的信號。用于QM?分析的典型試劑（例如，可以在基于 QM?的試劑盒中找到的）可以包括，但不限于：用于特定基因（或亞硫酸氫鹽處理的DNA序 列或CpG島）的pcr引物；TaqMan?或Lighteyckr?探針；優(yōu)化的pcr緩沖液以及脫氧 核苷酸；以及Taq聚合酶。
[0123] Ms-SNuPE. Ms-SNuPE?技術(shù)是用于評估特定CpG位點的甲基化差異的定量方法， 其基于亞硫酸氫鹽處理DNA，接著是單核苷酸引物延伸（Gonzalgo & Jones, NucleicAcids Res. 25 :2529-2531,1997)。簡言之，使基因組DNA與亞硫酸氫鈉反應以將未甲基化的胞嘧 啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ３?-甲基胞嘧啶不變。隨后采用特異于經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變的DNA的 PCR引物擴增所需的靶序列，分離所得到的產(chǎn)物并用作分析目的CpG位點處甲基化的模板。 可分析小量的DNA(例如顯微解剖的病理切片），其避免了使用限制酶確定CpG位點處的甲 基化狀態(tài)。
[0124] 用于Ms-SNuPE?分析的典型試劑（例如，可以在典型的基于COBRA?的試劑盒中 找到）可以包括，但不限于：用于特定基因（或經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列或CpG島）的 PCR引物；優(yōu)化的PCR緩沖液和脫氧核苷酸；凝膠提取試劑盒、陽性對照引物；用于特定基 因的Ms-SNuPE?引物；反應緩沖液（用于Ms-SNuPE反應）；以及標記的核苷酸。另外，亞 硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變試劑可包括：DNA變性緩沖液；磺化緩沖液；DNA回收試劑或試劑盒（例如，沉 淀、超濾、親和柱）；脫磺酸基緩沖液；以及DNA回收組分。
[0125] SEQ ID N0S :1 至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ IDNO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167的某閔鉬序列，以及其非天然發(fā)牛的經(jīng)處理的奪體SEQ ID NOS :10至SEQ ID NO : 15、SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NOS :30 至 SEQ IDNO :31、SEQIDN0S :42 至 SEO ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :203被確定在細朐增葙件病癥尤其是結(jié)腸官腸和/或肝細朐增葙件病癥的早期 檢測、分類和/或治療方面具有新的應用。
[0126] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：i)使從個體獲得的基因組 DNA(優(yōu)選從體液分離的）與至少一種試劑或一組試劑接觸，所述試劑區(qū)分至少一種選自 S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID N0S : 160至SEQ ID NO : 165 (包括其啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)域）的基因或基因組序列內(nèi)的甲基化和 未甲基化的CpG二核苷酸；以及ii)以大于或等于80 %的敏感性和大于或等于80 %的特異 性檢測、或檢測并區(qū)分結(jié)腸或肝細胞增殖性病癥。
[0127] 優(yōu)選地，所述敏感性為約75 %至約96 %、或約80 %至約90 %、或約80 %至約 85%。優(yōu)選地，所述特異性為約75%至約96%、或約80%至約90%、或約80%至約85%。
[0128] 可通過任何的現(xiàn)有技術(shù)中的標準方法分離基因組DNA，包括使用可商購的試劑盒。 簡言之，當目的DNA在生物樣品中被包裹在細胞膜中時，該生物樣品必須被破碎并通過酶、 化學或機械手段被裂解。隨后例如通過蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接 著從溶液中回收基因組DNA。這可以通過各種方法來實現(xiàn)，包括鹽析、有機提取或?qū)NA結(jié) 合到固相支持物。對方法的選擇會受到多種因素的影響，包括時間、費用和所需的DNA的 量。所有的臨床樣品種類，包括瘤性物質(zhì)或瘤前物質(zhì)，都適合用在本發(fā)明方法中，優(yōu)選的為 細胞系、組織學切片、組織活檢、石蠟包埋的組織、體液、糞便、結(jié)腸流出物、尿、血漿、血清、 全血、分離的血細胞、從血液中分離的細胞，或其組合。體液為優(yōu)選的DNA源；尤其優(yōu)選的為 血漿、血清、全血、分離的血細胞和從血液分離的細胞。
[0129] 隨后，用區(qū)分基因組DNA至少一個靶區(qū)域內(nèi)甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至 少一種或成組試劑處理基因組DNA樣品，其中所述靶區(qū)域包括或在嚴緊條件下雜交至至少 一個序列的長度為至少16個連續(xù)核苷酸的序列，所述至少一個序列選自分別選自SEQ ID NOS :1 至 SEQ TD NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167,其 中所述連續(xù)核苷酸包括至少一個CpG二核苷酸序列。
[0130] 尤其優(yōu)選的是，所述試劑將未在5'位甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?、胸腺?啶或其它在雜交行為上不同于胞嘧啶的的另一堿基。但是，在另一實施方案中，所述試劑可 以為甲基化敏感的限制酶。
[0131] 當基因組DNA被這種方式處理，以便使在5'位未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟?嘧啶、胸腺嘧啶或其它在雜交行為上不同于胞嘧啶的的其它堿基時，優(yōu)選這種處理用亞硫 酸氫鹽進行（酸式亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽（disulfite))并且隨后堿性水解。這種處理導致 SEQ ID N0S :1 至 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :24、SEQ ID N0 :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ IDN0 : 167(分別）被轉(zhuǎn)變?yōu)?SEQ ID NOs :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NOS :30 至 SEQ IDNO :31、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :185，其中所述 CpG 二核苷酸為甲 基化的，或 SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NOs :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :50 至SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :186至SEQ ID NO :203,其中所述CpG二核苷酸為未甲基化的。
[0132] 隨后分析經(jīng)處理的DNA，以便確定靶基因序列（處理前至少一個基因或基因組序列 選自S印tin9 (包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT以及SEQ ID N0S : 160至SEQ ID N0 :165)的甲基化狀態(tài)。尤其優(yōu)選的是，該靶區(qū)域包括或在嚴緊條件 下雜交至至少一個基因或基因組序列的至少16連續(xù)核苷酸，所述至少一個基因或基因組 序列選自S印tin9 (包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID N0 :165。優(yōu)選分析 SEQ ID N0S :1 至 SEQ ID NO :3、SEQ ID N0 :24、 SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159至SEQ ID NO :167的基因序列。所述分析方法可以選自現(xiàn)有 技術(shù)中已知的那些，包括那些列在本文中的。尤其優(yōu)選的是MethyLight?、MSP以及使用本 文描述的阻斷寡核苷酸（HeavyMethyl?)。進一步優(yōu)選的是，用在這種分析中的任何寡核苷 酸（包括引物、阻斷寡核苷酸以及檢測探針）應該反向互補于、等同于或在嚴緊或高度嚴緊 條件下雜交 SEQ ID N0S :10 至 SEQ ID N0 :15、SEQ ID N0S :28 至 SEQ ID N0 :33、SEQ ID N0S : 30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :203 及其互補序列中的一種或多 種堿基序列的至少16個堿基對長的片段。
[0133] 異常甲基化，更具體地是選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、 SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID NO :165(包括它們的啟動子 和/或調(diào)節(jié)區(qū)）的基因或基因組序列的超甲基化與瘤性細胞增殖性病癥的存在有關，在結(jié) 腸直腸和肝細胞瘤中尤其普遍。因此，當生物樣品表現(xiàn)出任何程度的甲基化時，所述樣品應 被確定為瘤性的。
[0134] 對選自S印tin9 (包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、 FAT以及SEQ ID N0S : 160至SEQ ID N0 :165的基因或基因組序列之一的分析首次使得能夠 以高于或等于80%的敏感性以及高于或等于80%的特異性檢測或檢測并區(qū)分結(jié)腸或肝細 胞增殖性病癥。敏感性的計算為：（檢測到的瘤/所有的瘤）；例如（檢測到的結(jié)腸瘤/所 有的結(jié)腸瘤）；特異性的計算為（未檢測到的陰性/總的陰性）。
[0135] 優(yōu)選地，所述敏感性為約75 %至約96 %、或約80 %至約90 %、或約80 %至約 85%。優(yōu)選地，所述特異性為約75%至約96%、或約80%至約90%、或約80%至約85%。
[0136] 本文所定義的瘤為所有的大于1cm結(jié)腸惡性腫瘤以及腺瘤，或其亞型。陰性可被 定義為健康個體。
[0137] 在一個實施方案中，所述方法公開了選自Septin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、 F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID NO :165(或其啟動子 和/或調(diào)節(jié)區(qū)）的至少一個基因或基因組序列用作區(qū)別、檢測和區(qū)分細胞增殖性病癥（尤 其是瘤性的結(jié)腸或肝臟病癥）的標志物。
[0138] 所述方法可以通過任何分析從它們轉(zhuǎn)錄的RNA的表達或從所述RNA翻譯的多肽或 蛋白的表達來實現(xiàn)，優(yōu)選通過mRNA表達分析或多肽表達分析。因此，本發(fā)明還提供診斷測 定和方法，定量和定性地檢測個體中至少一個選自Septin9 (包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、 F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID NO :165 的基因或基因 組序列的表達，并由此確定在所述個體中是否存在癌癥。
[0139] 自選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、 FAT以及SEQ ID N0S : 160至SEQ ID N0 :165的基因或基因組序列轉(zhuǎn)錄的mRNA的異常表達與 個體中癌癥的存在相關。根據(jù)本發(fā)明，欠表達（和/或存在甲基化）與癌癥的存在相關，反 之過表達（和/或不存在甲基化）與不存在癌癥相關。尤其優(yōu)選地，確定至少一個如SEQ ID N0S :16至SEQ ID N0 :19中公開的基因 S印tin9的轉(zhuǎn)錄變體的表達。
[0140] 為了檢測編碼基因或基因組序列的mRNA的存在，從患者去得樣品。該樣品可以是 任何適合的包含腫瘤的細胞物質(zhì)的樣品。適合的樣品種類包括細胞系、組織學切片、組織活 檢、石蠟包埋的組織、體液、糞便、結(jié)腸流出物、尿、血漿、血清、全血、分離的血細胞、從血液 中分離的細胞，及其所有可能的組合。優(yōu)選地，所述樣品種類為糞便或體液，選自結(jié)腸流出 物、尿、血漿、血清、全血、分離的血細胞、從血液中分離的細胞。
[0141] 所述樣品可以被處理以提取其中所含的RNA。隨后分析從該樣品所得的核酸。現(xiàn) 有技術(shù)中已知很多用于確定基因表達的絕對和相對水平的技術(shù)，適合用在本發(fā)明中的常用 技術(shù)包括原位雜交（例如FISH)、Northern分析、RNA酶保護測定（RPA)、微陣列和基于PCR 的技術(shù)，例如定量PCR和差異顯示PCR或任何其它的核酸檢測方法。
[0142] 尤其優(yōu)選的是使用逆轉(zhuǎn)錄/聚合鏈式反應技術(shù)（RT-PCR)。RT-PCR方法在現(xiàn)有技 術(shù)中是公知的（例如，參見上文Watson and Fleming)。
[0143] RT-PCR方法可如下進行。通過例如標準的異硫氰酸胍方法分離細胞總RNA，并且 逆轉(zhuǎn)錄該總RNA。該逆轉(zhuǎn)錄方法包括采用逆轉(zhuǎn)錄酶和3'端寡核苷酸dT引物和/或隨機六 聚體引物在RNA模板上合成DNA。由此產(chǎn)生的cDNA隨后被PCR擴增（Belyavsky等人，Nucl Acid Resl7 :2919_2932，1989 ;Krug and Berger，Methods in Enzymology(酶學中的方法）， Academic Press，Ν· Y.，Vol. 152, ρρ· 316-325,1987,通過參考將它們引入）。進一步優(yōu)選的 是RT-PCR的"實時"變體，其中所述PCR產(chǎn)物通過雜交探針（例如TaqMan、Lightcycler、 Molecular Beacons&Scorpion)或SYBR綠來檢測。然后，參照標準曲線或通過將Ct值與校 準標準的Ct值比較而將從探針或SYBR綠檢測到的信號定量。對看家基因的分析經(jīng)常用來 標準化結(jié)果。
[0144] 在Northern印跡分析中，在變性瓊脂糖凝膠上分離總mRNA或poly (A)+mRNA，并 在該干燥的凝膠自身中或膜上雜交至標記的探針。所得的信號與RNA群中靶RNA的量成比 例。
[0145] 對來自兩個或多個細胞群或組織的信號的比較揭示基因表達水平的相對差異?？?通過將信號與采用已知量的對應于靶RNA的體外轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的標準曲線進行比較來進行 絕對定量。對看家基因的分析經(jīng)常用于標準化結(jié)果，排除了由于轉(zhuǎn)移至膜上的RNA的不同 或上樣到凝膠上的RNA的不同所引起的任何明顯差異，所述看家基因是表達水平與條件無 關而預期保持相對恒定的基因。
[0146] Northern分析中的第一步是從目的細胞或組織分離純的、完整的RNA。因為 Northern印跡通過大小來區(qū)分RNA，樣品的完整性影響信號在單條帶中的集中度。部分降 解的RNA樣品將導致信號模糊或分布在幾個條帶，導致敏感性的總體上的降低并可能導致 對數(shù)據(jù)的錯誤解釋。在Northern印跡分析中，可使用DNA、RNA以及寡核苷酸探針，這些探 針優(yōu)選被標記（例如，放射性標記物、質(zhì)譜標記物（masslabel)或熒光標記物）。靶RNA，而 不是探針的大小將決定檢測到的條帶的大小，所以諸如產(chǎn)生不同長度探針的隨機引物標記 的方法適用于探針分析。探針的特異活性將決定敏感性的水平，所以優(yōu)選使用具有高特異 活性的探針。
[0147] 在RNA酶保護測定中，RNA靶和具有確定長度的RNA探針在溶液中雜交。雜交后， 用特異于單鏈核酸的RNA酶（RNase)消化RNA以除去任何未雜交的單鏈靶RNA和探針。使 RNA酶失活，并且例如通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離RNA。完整RNA探針的量與RNA 群中的靶RNA的量成比例。RPA可用于基因表達的相對和絕對定量，并且也用于繪制RNA結(jié) 構(gòu)，例如內(nèi)含子/外顯子邊界和轉(zhuǎn)錄起始位點。RNA酶保護測定優(yōu)于Northern印跡分析，因 為其具有較低的檢測限。
[0148] 用于RPA中的反義RNA探針通過體外轉(zhuǎn)錄具有明確端點的DNA模板而生成，通常 在50-600核苷酸的范圍內(nèi)。使用包括額外的不與靶RNA同源的序列的RNA探針使得被保 護的片段與全長探針區(qū)分開。RNA探針通常替代DNA探針使用，這是因為易于產(chǎn)生單鏈RNA 探針以及用RNase消化RNA :RNA雙鏈體的重現(xiàn)性和可靠性（AuSubel等人，2003)，尤其優(yōu)選 的是具有高特異活性的探針。
[0149] 尤其優(yōu)選的是使用微陣列。微陣列方法可被劃分為兩個主要部分。第一個是將已 知的基因序列固定到載玻片或其它固體支持物上，隨后是熒光標記的cDNA(包含待研究的 序列）與該固定到載玻片（或其它固相）上的已知基因的雜交。雜交后，采用熒光微陣列 掃描儀掃描陣列。對不同基因相對熒光強度的分析提供了對基因表達差異的衡量。
[0150] 可通過將預先合成的寡核苷酸固定到制備的載玻片或其它固體表面來產(chǎn)生DNA 陣列。這種情況下，采用標準寡核苷酸合成和純化方法來加工和制備代表性的基因序列。 這些合成的基因序列互補于目的基因的RNA轉(zhuǎn)錄本（這種情況下，基因或基因組序列選自 S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160至SEQ ID NO :165)，并且傾向于25-70核苷酸范圍內(nèi)的短序列。在優(yōu)選的實施方 案中，所述寡核苷酸或多核苷酸包括與選自SEQ ID N0S : 16至SEQ ID N0 :19以及其互補序 列的至少一個序列互補或雜交的序列的至少9、18或25個堿基?；蛘撸潭ǖ墓丫垠w可在 載玻片表面上原位化學合成。原位寡核苷酸合成涉及將合適的核苷酸連續(xù)地添加至微陣列 上的點；未接受核苷酸的點在該方法的每個階段采用物理或?qū)嶋H掩蔽物來保護。優(yōu)選地，所 述合成的核酸為鎖定的核酸。
[0151] 在分析表達的微陣列實驗中，所用的RNA模板代表所研究的細胞或組織的轉(zhuǎn)錄 譜。首先從待比較的細胞群或組織中分離RNA。然后將每一 RNA樣品用作模板通過逆轉(zhuǎn)錄 反應來產(chǎn)生熒光標記的cDNA。該cDNA的熒光標記可通過直接標記或間接標記方法來實現(xiàn)。 在直接標記中，熒光修飾的核苷酸（例如，Cye3_或Cyt|55-dCTP)在逆轉(zhuǎn)錄反應中被直接 摻入到cDNA中?；蛘撸赏ㄟ^在cDNA合成期間摻入氨基烯丙基修飾的核苷酸，接著在逆轉(zhuǎn) 錄反應結(jié)束后將N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)-脂染料偶聯(lián)到該氨基烯丙基修飾cDNA來完成 間接標記?；蛘?，該探針可為未標記的，但可以通過與直接或間接標記的配體特異結(jié)合而被 檢測。用于標記配體（和探針）的標記物和方法在本領域是已知的，包括例如可通過已知 方法（例如缺口平移或激酶磷酸化（kinasing))摻入的放射性標記物。其它合適的標記物 包括但不限于生物素、熒光團、化學發(fā)光團（例如二氧雜環(huán)己烷，尤其是引發(fā)的二氧雜環(huán)己 燒、酶、抗體等。
[0152] 為了進行差別基因表達分析,從不同RNA樣品產(chǎn)生的cDNA被Cy?3標記。所得 到的標記的cDNA被純化以除去未摻入的核苷酸、游離染料和殘留RNA。純化之后，標記的 cDNA樣品被雜交至微陣列。該雜交的嚴緊性由雜交過程中和洗滌過程中的多種因素決定， 包括溫度、離子強度、時長和甲酰胺的濃度。例如在Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual (分子克?。簩嶒炇沂謨裕?，2nd ed.，1989)中概述了這些因素。雜交后 使用突光微陣列掃描儀掃描微陣列。每個點的突光強度表不所分析基因的表達水平；亮點 對應于強表達的基因，而暗點表示弱表達。
[0153] -旦獲得了圖像，需要分析原始數(shù)據(jù)。首先，必須從每個點的熒光中減去背景熒 光。然后將數(shù)據(jù)相對對照序列標準化，對照序列例如外源添加的核酸（優(yōu)選RNA或DNA)，或 看家基因組，以彌補任何非特異的雜交、陣列缺陷或測定裝置、cDNA標記、雜交或洗滌的差 異。數(shù)據(jù)標準化使得可對多個測定的結(jié)果進行比較。
[0154] 本發(fā)明的另一方面涉及用于根據(jù)本發(fā)明的方法診斷個體中癌癥中的試劑盒，所述 試劑盒包括：測量選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、 NR2E1、FAT以及SEQ ID NOS :160至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列轉(zhuǎn)錄水平的組件。 在優(yōu)選的實施方案中，用于測量轉(zhuǎn)錄水平的組件包含能夠在嚴緊或中等嚴緊條件下與選自 S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160至SEQID NO :165的基因或基因組序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的寡核苷酸或多核苷酸。優(yōu) 選地，所述寡核苷酸或多核苷酸能夠在嚴緊或中等嚴緊條件下與選自Septin9 (包括其所 有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID N0 : 165的基因或基因組序列的至少一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交，如SEQ ID NOS :16至SEQ ID NO :19中所 提供的。在一個實施方案中，所述寡核苷酸或多核苷酸包含與選自SEQ ID NOS :16至SEQ ID NO :19及其互補序列的至少一個序列互補或雜交的序列的至少9、18或25個堿基。
[0155] 在最優(yōu)選的實施方案中，通過選自Northern印跡分析、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、實時PCR、 RNA酶保護、以及微陣列的技術(shù)來確定轉(zhuǎn)錄水平。在本發(fā)明的另一實施方案中，該試劑盒還 包含用于從患者獲得生物樣品的裝置。優(yōu)選地，試劑盒還包括容器，其最優(yōu)選適合于盛裝用 于測定轉(zhuǎn)錄水平的組件和患者的生物樣品，最優(yōu)選地，還包括使用以及解釋試劑盒結(jié)果的 說明書。
[0156] 在優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒包括（a)能夠在嚴緊或中等嚴緊條件下與選自 S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160至SEQ ID NO :165的至少一種基因或基因組序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的多種寡核苷酸 或多核苷酸；(b)容器，優(yōu)選適于盛裝所述寡核苷酸或多核苷酸以及包含轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的患者 生物樣品，其中所述寡核苷酸或多核苷酸能夠在嚴緊或中等嚴緊條件下與所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜 交；（c)用于檢測（b)的雜交的組件，以及任選地，（d)使用和解釋試劑盒結(jié)果的說明書。進 一步優(yōu)選地，所述（a)的寡核苷酸或多核苷酸的每一種都包含與選自SEQ ID N0S : 16至SEQ ID NO : 19及其互補序列的至少一個序列互補或雜交的序列的至少9、18或25個堿基。
[0157] 所述試劑盒也可含有其它的組分，諸如包裝在分開容器中的雜交緩沖液（其中寡 核苷酸將被用作探針）。或者，當所述寡核苷酸將被用于擴增靶區(qū)域時，所述試劑盒可以含 有包裝在分開容器中的聚合酶和優(yōu)化的用于聚合酶介導的引物延伸的反應緩沖液，如PCR。 優(yōu)選地，所述聚合酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。進一步優(yōu)選的是所述試劑盒還含有RNA酶試劑。
[0158] 本發(fā)明還提供用于檢測從患者獲得的樣品中是否存在由所述基因序列編碼的多 肽的方法。
[0159] 由選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、 FAT以及SEQ ID N0S : 160至SEQ ID N0 :165的基因或基因組序列編碼的多肽的多肽表達水 平異常與癌癥的存在相關。
[0160] 根據(jù)本發(fā)明，所述多肽的欠表達與癌癥的存在相關。尤其優(yōu)選地，所述多肽為轉(zhuǎn)錄 自S印tin9基因的SEQ ID N0S :20至SEQ ID N0 :23多肽提供的至少一種氨基酸序列。
[0161] 可以使用任何現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于檢測多肽的方法。這類方法包括，但不限于 質(zhì)譜法、免疫擴散法、免疫電泳法、免疫化學方法、結(jié)合物-配體測定法、免疫組化技術(shù)、凝 集和補體測定法（例如，參見Basic and Clinical Immunology (基礎和臨床免疫學），Sites and Terr，eds.，Appleton & Lange，Norwalk，Conn，pp217_262,1991，將其通過參考并入本 文）。優(yōu)選的是結(jié)合物-配體免疫測定方法，包括使抗體與一個或多個表位反應，并競爭性 地置換標記的多肽或其衍生物。
[0162] 本發(fā)明的某些實施方案包括使用特異于由選自Septin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變 體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID NO :165 的基因 或基因組序列編碼的多肽的抗體。尤其優(yōu)選的是，所述多肽為SEQ ID N0S :20至SEQ ID N0 : 23提供的至少一種氨基酸序列。
[0163] 這類抗體可用于癌癥診斷。在某些實施方案中，單克隆或多克隆抗體的產(chǎn)生可通 過用由SEQ ID N0S :20至SEQ ID N0 :23的多肽編碼的表位作為抗原來誘導。這類抗體叉可 用于檢測作為癌癥診斷標記物的表達的多肽?？赏ㄟ^常規(guī)方法定量這些多肽的存在水平。 可以通過多種現(xiàn)有技術(shù)中已知的手段來檢測和定量抗體-多肽結(jié)合，諸如用熒光或放射性 配體標記。本發(fā)明還包括用于進行上述方法的試劑盒，其中這些試劑盒含有特異于所研究 多肽的抗體。
[0164] 本領域公知多種競爭性和非競爭性多肽結(jié)合免疫測定法。在這些測定中使用的 抗體可以是未被標記的，例如用在凝集測試中，或被標記的，用于多種測定方法?？墒褂玫?標記物包括放射性核素、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑、酶底物或輔因子、酶抑制劑、顆粒、染料等 等。優(yōu)選的測定包括但不限于放射免疫測定（RIA)，酶免疫測定，例如酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、熒光免疫測定等?？赏ㄟ^本領域已知的多種方法中的任何方法來制備用于免疫測 定的多克隆或單克隆抗體或其表位。
[0165] 在所述方法的其它實施方案中，所述蛋白可以用western印跡分析來檢測。所述 分析在本領域中是標準的。簡言之，通過電泳如SDS-PAGE將蛋白分開。隨后將分開的蛋白 轉(zhuǎn)移至適合的膜（或紙）上，如硝酸纖維素，同時保持通過電泳獲得的空間分離。接著將膜 與結(jié)合膜上剩余的有結(jié)合性位置的封閉試劑一起孵育，通常使用的試劑包括一般蛋白（例 如乳蛋白）。然后，加入特異于目的蛋白的抗體，所述抗體被可檢測地標記，例如通過染料或 酶學方法（例如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶）。隨后檢測所述抗體在膜上的位置。
[0166] 在該方法的其它實施方案中，所述蛋白可以通過免疫組化方法來檢測（使用抗體 來探測樣品中的特異抗原）。所述分析在現(xiàn)有技術(shù)中是標準的，其中對組織中抗原的檢測被 稱為免疫組織化學，而在培養(yǎng)細胞中的檢測通常稱為免疫細胞化學。簡言之，初級抗體通過 結(jié)合到其特異抗原而被檢測。隨后，該抗體-抗原復合物被次級酶偶聯(lián)的抗體結(jié)合。在必 要的底物和發(fā)色團存在下，根據(jù)在抗體-抗原結(jié)合位點處的有色沉積來檢測結(jié)合的酶。適 合的樣品種類、抗原-抗體親和性、抗體種類以及檢測增強方法都有多種。因此，用于免疫 組織化學或免疫細胞化學檢測的最優(yōu)條件必須由本領域技術(shù)人員為每個個例單獨確定。
[0167] 一種制備針對多肽的抗體的方法為：選擇并制備該多肽的全部或部分氨基酸 序列，化學合成該氨基酸序列并將其注射進適合的動物，通常是兔或小鼠 （Milstein and Kohler Nature256 :495-497,1975 ；Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology ： Immunochemical Techniques (酶學中的方法：免疫化學技術(shù)）73 :1_46，Langone and Banatis eds.，Academic Press, 1981，將其整體通過參考并入本文）。制備多肽或其表位的 方法包括，但不限于化學合成、重組DNA技術(shù)或從生物樣品分離。
[0168] 在該方法的最后步驟中，確定患者的診斷結(jié)果，其中（選自S印tin9(包括其所有 的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160 至 SEQ ID N0 : 165的至少一種基因或基因組序列的）欠表達表明存在癌癥。術(shù)語欠表達應被認為是指檢 測到的水平少于預先確定的臨界值，該臨界值可以從均值、中值或優(yōu)化的閾值中選擇。
[0169] 本發(fā)明的另一方面提供用于根據(jù)本發(fā)明方法診斷個體中癌癥的試劑盒，包括：用 于檢測至少一個選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、 NR2EUFAT以及SEQ ID NOS :160至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列的多肽的組件。優(yōu) 選地，所述多肽的序列如SEQ ID N0S :20至SEQ ID N0 :23所提供的。用于檢測所述多肽的組 件優(yōu)選包括抗體、抗體衍生物或抗體片段。所述多肽最優(yōu)選通過利用標記的抗體的Western 印跡來檢測。在本發(fā)明的另一實施方案中，該試劑盒還包括獲得患者生物樣品的組件。優(yōu) 選地，試劑盒還包括適于盛裝檢測患者生物樣品中多肽的容器，最優(yōu)選還包括使用和解釋 試劑盒結(jié)果的說明書。在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒包括：(a)用于檢測至少一種選自 S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NOS :160至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列多肽的組件；(b)適于盛裝所述組件和包含 所述多肽的患者生物樣品的容器，其中所述組件能夠與所述多肽形成復合物；（c)檢測（b) 的復合物的組件；以及任選地（d)使用和解釋試劑盒結(jié)果的說明書。優(yōu)選地，所述檢測至少 一種選自S印tin9 (包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM 1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT以 及SEQ ID N0S : 160至SEQ ID N0 :165的基因或基因組序列的多肽的組件特異于至少一種選 自SEQ ID N0S :20至SEQ ID N0 :23的多肽序列。所述試劑盒還可以含有包裝在分開容器中 的其它組分，例如用于阻斷、洗滌或包被的緩沖液或溶液。
[0170] 本發(fā)明的具體實施方案提供對所述序列內(nèi)甲基化水平和/或模式的分析的新應 用，其使得精確的檢測、表征和/或治療肝和/或結(jié)腸直腸細胞增殖性病癥成為可能。癌癥 的早期檢測直接與疾病預后相聯(lián)系，因而這里公開的方法使得醫(yī)師和患者能夠做出更好更 合理的治療決定。
[0171] 講一步的改講
[0172] 本發(fā)明提供基因組序列 SEQ ID N0S :1 至 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :24、SEQ ID N0 : 28、SEQ ID NOS :159至SEQ ID NO :167的新用途。其它的實施方案提供了 SEQ ID NOS :1至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167 的經(jīng)修飾的變 體，以及用于分析 SEQ ID NOS :1 至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS : 159至SEQ ID NO :167內(nèi)胞嘧啶甲基化模式的寡核苷酸和/或PNA-寡聚體。
[0173] 本發(fā)明的目的包括分析至少一種選自SEQ ID N0S :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID N0 :24、 SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159至SEQ ID NO :167及其互補序列的序列內(nèi)的一個或多個CpG 二核苷酸的甲基化狀態(tài)。
[0174] 所公開的發(fā)明提供衍生自基因組SEQ ID N0S :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159至SEQ ID NO :167的經(jīng)處理的核酸，其中所述處理適合于將所述基 因組DNA序列的至少一個未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ蚱渌陔s交上可檢測地 不同于胞嘧啶的其它堿基。所討論的基因組可以包括一個或多個連續(xù)的甲基化CpG位置。 所述處理優(yōu)選包括使用選自亞硫酸氫鹽、酸式亞硫酸鹽、disulfite及其組合的試劑。在本發(fā) 明優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供非天然產(chǎn)生的經(jīng)修飾的核酸，其包含選自SEQ ID N0S : 10 至 SEQ ID N0 :15、SEQ ID N0S :28 至 SEQ ID N0 :33、SEQ ID N0S :30 至 SEQ ID N0 :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS. 50 至 SEQ ID NO :51、 SEQ ID NOS :168至SEQ ID NO :203的序列的長度為至少16個連續(xù)核苷酸堿基的序列。在進 一步優(yōu)選的實施方案中，所述核酸是至少50、100、150、200、250或500個堿基對長度的公開 在 SEQ ID N0S :10 至 SEQ ID N0 :15、SEQ ID N0S :28 至 SEQ ID N0 :33、SEQ ID N0S :30 至 SEQ ID N0 :31、SEQ ID N0S :42 至 SEQ ID N0 :43、SEQ ID N0S :38 至 SEQ ID N0 :39、SEQ ID N0S :50 至SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168至SEQ ID NO :203中的核酸序列的片段。尤其優(yōu)選的是不 與 SEQ ID N0S :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID N0 :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID N0S :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :203 而不是 SEQ ID NOS :1 至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167 或其它天然產(chǎn)生的 DNA 的全部 或部分序列相同或互補的核酸分子。
[0175] 優(yōu)選的是，所述序列包含CpG、ΤρΑ或CpA二核苷酸以及與其互補的序列中的至少 一個。SEQ ID N0S :10 至 SEQ ID N0 :15、SEQ ID N0S :28 至 SEQ ID N0 :33、SEQ ID N0S :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID N0S. 42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID N0S :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID N0S : 50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :203 的序列提供了 SEQ ID NOS :1 至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167 的非天然產(chǎn)生的 經(jīng)修飾的形式，其中每一基因組序列的修飾導致合成如下的具有獨特和不同于所述基因組 序列的序列的核酸。對于每一有義鏈基因組DNA如SEQ ID N0 :1來說，公開了 4種被轉(zhuǎn)變的 形式。第一種形式是"C"被轉(zhuǎn)變成"T"，但是"CpG"仍保持"CpG"（即，對應于這樣的情況： 其中對于基因組序列來說，所有的"CpG"二核苷酸序列中的"C"殘基被甲基化，因此不被轉(zhuǎn) 變）；第二種形式公開了所公開的基因組DNA序列的互補序列（即反義鏈），其中"C"被轉(zhuǎn) 變成"T"，但是"CpG"仍保持"CpG"（ S卩，對應于這樣的情況：其中對于基因組序列來說，所 有的"CpG"二核苷酸序列中的"C"殘基被甲基化，因此不被轉(zhuǎn)變）。SEQ ID NOS :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167 的"上甲基化的"轉(zhuǎn)變 的序列對應于 SEQ ID NOS :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NOS :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS : 38至SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :168至SEQ ID NO :185。提供每一基因組序列的第三種化學 轉(zhuǎn)變形式，其中對于所有的"C"殘基"C"都被轉(zhuǎn)變?yōu)?T"，包括"CpG"二核苷酸序列中的那 些（即，對應于這樣的情況：其中對于基因組序列來說，"CpG"二核苷酸序列中的所有"C" 殘基是未被甲基化的）；每一序列的最后一種化學轉(zhuǎn)變形式公開了所公開的基因組DNA序 列的互補序列（即反義鏈），其中對于所有的"C"殘基"C"都被轉(zhuǎn)變?yōu)?T"，包括"CpG"二 核苷酸序列中的那些（即，對應于這樣的情況：其中對于每一基因組序列的互補序列（反義 鏈）來說，"CpG"二核苷酸序列中的所有"C"殘基是未被甲基化的）。SEQ ID N0S :1至SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :24、SEQ IDN0 :28、SEQ IDN0S :159 至 SEQ ID NO :167 的"下甲基化的" 轉(zhuǎn)變的序列對應于 SEQ ID N0S :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID N0S :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :186 至 SEQ ID NO :203 的序列。
[0176] 因此，重要的是，SEQ ID NOS :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、 SEQ ID NOS :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :203 的核酸序列和分 子不涉及或與細胞增殖性病癥的檢測、分類或治療相聯(lián)系。
[0177] 在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還提供適于用在本發(fā)明方法中的寡核苷酸或寡 聚體，用于檢測 SEQ IDN0S :1 至 SEQ IDN0 :3、SEQ IDN0 :24、SEQ IDN0 :28、SEQ IDN0S :159 至 SEQ ID NO : 167、SEQ ID NOS :10 至 SEQ ID NO : 15、SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NOS :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOD :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOD :38 至 SEQ ID NO :39、 SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :203 的基因組或經(jīng)處理的（化 學修飾的）DNA內(nèi)的胞嘧啶甲基化狀態(tài)。所述寡核苷酸或寡聚體核酸提供了新的診斷手段。 所述寡核苷酸或寡聚體包含具有至少九（9)個核苷酸的核酸序列，其相同于或在中等嚴緊 或嚴緊條件下（如上文所定義的）雜交經(jīng)處理的核酸序列SEQ ID N0S : 10至SEQ ID N0 :15、 SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NOS :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :203和/或其互補序列，或者基因組序列SEQ ID NOS :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NOS :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167 和 / 或其互補序列。
[0178] 因此，本發(fā)明包括在中等嚴緊和/或嚴緊雜交條件下雜交選自SEQ ID N0S :1至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO : 167、SEQ ID NOS : 10 至 SEQ ID NO : 15、SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NOS :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO : 51、SEQ ID NOS :168至SEQ ID NO :203或其互補序列的全部或部分序列的核酸分子（例如 寡核苷酸和肽核酸（PNA)分子（PNA-寡聚體））。尤其優(yōu)選的是在中等嚴緊和/或嚴緊雜 交條件下雜交選自 SEQ ID NOS :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NOS :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、 SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至 SEQ ID NO :203 而不是 SEQ ID NOS :1 至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO :167 或其它人基因 組DNA的全部或部分序列的核酸分子。
[0179] 所述雜交核酸的相同或雜交部分通常長為至少9、16、20、25、30或35個核苷酸。但 是，更長的分子具有本發(fā)明的應用，因此也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0180] 優(yōu)選地，本發(fā)明雜交核酸分子的雜交部分與選自SEQ ID N0S :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NOS :159 至 SEQ ID NO : 167、SEQ ID NOS :10 至 SEQ ID NO : 15、SEQ ID NOS :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NOS :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NOS :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NOS :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NOS :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NOS :168 至SEQ ID NO :203或其互補序列的序列或其一部分有至少95%或至少98%或100%的一致 性。
[0181] 本文描述的雜交核酸類型可例如用作引物（例如，PCR引物）、或診斷和/或預后 探針或引物。優(yōu)選地，所述寡核苷酸探針與核酸樣品的雜交在嚴緊條件下進行，并且該探針 與靶序列100 %相同。核酸雙鏈體或雜交穩(wěn)定性被表達為熔解溫度或Tm，其為探針與靶DNA 解離的溫度。此熔解溫度可用于確定所需的嚴緊條件。
[0182] 對于與相應序列 SEQ ID N0S :1 至 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :24、SEQ ID N0 :28、SEQ ID NOS : 159至SEQ ID NO : 167相關或基本相同而不是相同的靶序列（例如等位變體和SNP) 而言，有用的是首先用特定濃度的鹽（例如SSC或SSPE)確定只發(fā)生同源雜交的最低溫度。 然后，假定1 %的錯配導致Tm降低1°C，雜交反應中最后洗滌的溫度也相應降低（例如，如 果檢測與探針有>95%同一性的序列，則最終的洗滌溫度降低5°C )。實際上，Tm的變化可 在每1%錯配0. 5°C至1. 5°C之間。
[0183] 長度為X(以核苷酸計）的本發(fā)明寡核苷酸的實例，如通過參照例如SEQ ID N0 : 1的多核苷酸位置表明的，包括對應于那些長度X的連續(xù)重疊寡核苷酸集（有義集和反義 集），其中每一連續(xù)重疊集內(nèi)的寡核苷酸（對應于給定的X值）被定義為來自核苷酸位置：
[0184] η 至（n+(X_l))
[0185] 的Z寡核苷酸的有限集；
[0186] 其中

【權(quán)利要求】
1. 用于確定至少一種選自S印tin9(包括其所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、 PRDM6、NR2E1、FAT以及SEQ ID NO :160至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列的表達水平 的裝置在制備用于檢測和/或分類個體中細胞增殖性病癥的方法的試劑盒中的用途， 其中所述方法包括確定分離自所述個體的生物樣品中至少一種選自Septin9 (包括其 所有的轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 以及 SEQ ID NO :160 至 SEQ ID NO :165的基因或基因組序列的表達水平，其中欠表達和/或CpG甲基化表明所述病癥存在 或其種類。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中癌性細胞增殖性病癥區(qū)別于良性細胞增殖性病癥， 所述方法特征在于欠表達和/或CpG甲基化的存在表明癌性細胞增殖性病癥的存在，而其 不存在表明良性細胞增殖性病癥的存在。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述細胞增殖性病癥為癌癥。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其中所述細胞增殖性病癥為肝細胞或結(jié)腸直腸癌。
5. 如權(quán)利要求1-4任一項所述的用途，其中所述表達水平通過檢測從所述基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA的存在與否或水平來確定。
6. 如權(quán)利要求1-4任一項所述的用途，其中所述表達水平通過檢測由所述基因或其序 列編碼的多肽的存在與否或水平來確定。
7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述多肽通過一種或多種選自western印跡分析、色 譜法、免疫分析、ELISA免疫分析、放射免疫分析、抗體法及其組合來檢測。
8. 如權(quán)利要求1-4任一項所述的用途，其中所述表達通過檢測所述基因內(nèi)CpG甲基化 的存在與否來確定，其中甲基化的存在表明細胞增殖性病癥的存在。
9. 區(qū)分基因組DNA至少一個靶區(qū)域內(nèi)甲基化和未甲基化CpG二核苷酸的至少一種試劑 或成組試劑在制備用于檢測和/或分類個體中細胞增殖性病癥的方法的試劑盒中的用途， 其中所述方法包括使從所述個體生物樣品中分離的基因組DNA與所述至少一種試劑或成 組試劑接觸， 其中所述靶區(qū)域包含或在嚴緊條件下雜交于至少一種分別選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159 至 SEQ ID NO :167 的序列的至少 16 連續(xù) 核苷酸的序列，其中所述連續(xù)核苷酸包含至少一個CpG二核苷酸序列，由此至少部分地提 供對細胞增殖性病癥的檢測和/或分類。
10. 將其5位未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶或在雜交性能方面可檢測地不同于 胞嘧啶的其它堿基的一種或多種試劑，和 擴增酶和至少一種包含至少9核苷酸連續(xù)序列的引物 在制備用于檢測和/或分類個體中細胞增殖性病癥的方法的試劑盒中的用途，其中所 述方法包括： a. 提取或以其它方式從所述個體生物樣品分離基因組DNA ; b. 用所述一種或多種試劑處理a)的所述基因組DNA或其片段； c. 使所述經(jīng)處理的基因組DNA或其經(jīng)處理的片段與所述擴增酶和所述至少一種引物 接觸，所述引物包括至少9核苷酸的連續(xù)序列，其互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交 于選自 SEQ ID NO :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NO. 42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :168至SEQ ID NO :203及其互補序列的序列，其中所述經(jīng)處理的基 因組DNA或其片段被擴增以產(chǎn)生至少一種擴增產(chǎn)物或不被擴增；以及 d.基于所述擴增物是否存在或其性質(zhì)，確定選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159 至 SEQ ID NO :167 的序列的至少一個 CpG 二核苷酸的 甲基化狀態(tài)或水平，或者反映選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO : 28、SEQ ID NO :159至SEQ ID NO :167的序列的多個CpG二核苷酸平均甲基化狀態(tài)或水平的 均值或值，由此至少部分地提供至少檢測和分類細胞增殖性病癥之一。
11. 如權(quán)利要求9所述的用途，其中b)中處理所述基因組DNA或其片段包括使用選自 亞硫酸氫鹽、酸式亞硫酸鹽、disulfite及其組合的試劑。
12. 如權(quán)利要求9所述的用途，其中c)中的接觸或擴增包括使用至少一種選自如下的 方法：使用耐熱DNA聚合酶作為所述擴增酶；使用缺乏5'-3'外切酶活性的聚合酶；使用聚 合酶鏈式反應（PCR);產(chǎn)生帶有可檢測標記的擴增產(chǎn)物核酸分子。
13. 如權(quán)利要求1-11中任一項所述的用途，其中從所述個體獲得的所述生物樣品選自 細胞系、組織學切片、組織活檢、石蠟包埋的組織、體液、糞便、結(jié)腸流出物、尿、血漿、血清、 全血、分離的血細胞、從血液中分離的細胞，或其組合。
14. 如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述方法還在步驟d)中包括使用至少一種核酸 分子或肽核酸分子，其在各種情況下都包含互補于或在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于選自 SEQ ID NO :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO : 31、SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :168至SEQ ID NO :203序列及其互補序列的至少9核苷酸長度的連續(xù)序 列，其中所述核酸分子或肽核酸分子抑制其所雜交的所述核酸的擴增。
15. 如權(quán)利要求10所述的用途，其中d)中的確定包括至少一種核酸分子或肽核酸分子 的雜交，所述至少一種核酸分子或肽核酸分子在各種情況下包含互補于或在中等嚴緊或嚴 緊條件下雜交于選自 SEQ ID NO :10 至 SEQ IDN0 :15、SEQ ID NO :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :50至SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :168至SEQ ID NO :203序列及其互補序列的至少9核 苷酸長度的連續(xù)序列。
16. 如權(quán)利要求15所述的用途，其中至少一種這種雜交核酸分子或肽核酸分子被連接 到固相。
17. 如權(quán)利要求15所述的用途，其中所述方法還包括使至少一種這種雜交的核酸分子 延伸至少一個堿基。
18. 如權(quán)利要求10所述的用途，其中d)中的確定包括對所述擴增產(chǎn)物的測序。
19. 如權(quán)利要求10所述的用途，其中c)中的接觸或擴增包括使用甲基化特異的引物。
20. -種或多種甲基化敏感限制酶和 擴增酶和適于擴增包含選自 SEQ IDN0 :1 至 SEQ IDNO :3、SEQ IDNO :24、SEQ IDN0 :28、 SEQ ID NO :159至SEQ ID NO :167的序列的至少一個CpG二核苷酸的至少兩種引物 在制備用于檢測和/或分類細胞增殖性病癥的方法的試劑盒中的用途，其中所述方法 包括： a.提取或以其它方式從得自所述個體的生物樣品分離基因組DNA ; b. 以一種或多種甲基化敏感限制酶消化a)的所述基因組DNA或其片段； 使b)的DNA限制酶消化產(chǎn)物與所述擴增酶和所述至少兩種引物接觸；以及 c. 基于擴增產(chǎn)物存在與否，確定選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159至SEQ ID NO :167的序列的至少一個CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài) 或水平，由此至少部分地提供至少檢測和分類細胞增殖性病癥之一。
21. 如權(quán)利要求20所述的用途，其中通過雜交至少一種核酸或肽核酸來確定擴增產(chǎn) 物的存在與否，所述至少一種核酸或肽核酸等同于、互補于或在嚴緊或高度嚴緊條件下雜 交于選自 SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159 至 SEQ IDNO :167的序列的至少16堿基長片段。
22. 衍生自基因組SEQ ID NO :1 至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO : 159至SEQ ID NO :167的經(jīng)處理的核酸，其中所述處理適合于將所述基因組DNA序列的至少 一個未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化至尿嘧啶或在雜交上可檢測地不同于胞嘧啶的其它堿基。
23. 核酸，其包含選自 SEQ ID NO :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :28 至 SEQ ID NO :33、 SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO : 39、SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :168 至 SEQ ID NO :203 的經(jīng)處理的基因組 DNA 序列及其互補序列的至少16連續(xù)核苷酸，其中所述處理合適于將所述基因組DNA序列的至 少一個未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ蛟陔s交上可檢測地不同于胞嘧啶的其它堿 基。
24. 核酸，包含選自 SEQ ID NO :10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39、 SEQ ID NO. 50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :168 至 SEQ ID NO :203 及其互補序列的 DNA 序列 的至少50連續(xù)核苷酸。
25. 如權(quán)利要求22-24中任一項所述的核酸，其中所述連續(xù)堿基序列包含至少一個 CpG、TpG或CpA二核苷酸序列。
26. 核酸，包含用作診斷工具的選自SEQ IDN0 :1至SEQ IDNO :3、SEQ IDNO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159 至 SEQ ID NO : 167、SEQ ID NO :10 至 SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :168 至 SEQ ID NO :203 的核酸序 列及其互補序列的至少16連續(xù)核苷酸。
27. 適合于實施權(quán)利要求3所述的方法的試劑盒，包括a)多種能夠在嚴緊或中等嚴緊 條件下雜交至少一種選自S印tin9(包括其所有轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、 NR2EUFAT和SEQ IDNO :160至SEQ IDNO :165的基因或基因組序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的寡核苷酸或 多核苷酸；(b)適合于容納所述寡核苷酸或多核苷酸以及包含所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的患者生物樣 品的容器，其中所述寡核苷酸或多核苷酸能在嚴緊或中等嚴緊條件下雜交所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物， (c)檢測（b)的雜交的工具；以及任選地，（d)使用和解釋試劑盒結(jié)果的說明書。
28. 適合于實施權(quán)利要求5所述的方法的試劑盒，包括（a)檢測至少一種選自 S印tin9(包括其所有轉(zhuǎn)錄本變體）、F0XL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT 和 SEQ ID NO :160 至SEQ ID NO :165的基因或基因組序列的多肽的工具；(b)適合于容納所述工具和包含所述 多肽的患者生物樣品的容器，其中所述工具能與所述多肽形成復合物；(c)檢測（b)的復合 物的工具。
29. 適合于實施權(quán)利要求9的方法的試劑盒，包括（a)亞硫酸氫鹽試劑；(b)適合于容 納所述亞硫酸氫鹽和患者生物樣品的容器；(c)含有兩種寡核苷酸的至少一套寡核苷酸， 其序列在各種情況下都等同于、互補于或在嚴緊或高度嚴緊條件下雜交于選自SEQ ID NO : 10 至 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :28 至 SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :30 至 SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :42 至 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :38 至 SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :50 至 SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :168至SEQ ID NO :203的序列的9或更優(yōu)選18堿基長片段。
30. 適合于實施權(quán)利要求9的方法的試劑盒，包括（a)甲基化敏感限制酶試劑；(b)適 合于容納所述試劑和患者生物樣品的容器；（c)含有一種或多種核酸或肽核酸的至少一套 寡核苷酸，其等同于、互補于或在嚴緊或高度嚴緊條件下雜交于選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :159 至 SEQ ID NO :167 的序列的至少 9 堿基 長片段；以及任選地，（d)使用和解釋試劑盒結(jié)果的說明書。
31. 權(quán)利要求22-26的核酸和/或權(quán)利要求27-30的試劑盒在制備用于細胞增殖性病 癥的診斷和/或分類的試劑盒中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046686SQ201410147754
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2006年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2005年4月15日
【發(fā)明者】尤金·迪斯特勒, 托馬斯·希爾德曼, 拉爾夫·萊舍, 卡西·洛夫頓-戴, 法比安·莫德爾, 馬蒂亞斯·許特爾, 安德魯·希萊杰夫斯基, 宋曉齡, 雷莫·特茨納 申請人:Epi基因組股份公司