一種利用固定化脂肪酶制備共軛亞油酸甘油酯的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種固定化脂肪酶法制備共軛亞油酸甘油酯的方法。采用含有部分游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯/乙酯與甘油為原料，固定化脂肪酶為催化劑，前期共軛亞油酸酯與甘油交替進(jìn)料，有效地增加甘油與固定化酶的接觸幾率，增加反應(yīng)效率，后期共軛亞油酸酯與甘油混合進(jìn)料的方法制備共軛亞油酸甘油酯，由于游離脂肪酸與甘油反應(yīng)生成水分子，有利于酶活的發(fā)揮，加快了反應(yīng)效率，同時(shí)反應(yīng)過(guò)程中利用充入氮?dú)饣虺檎婵盏姆绞皆诰€(xiàn)脫甲醇或乙醇，大大縮短反應(yīng)時(shí)間，整個(gè)制備過(guò)程無(wú)需添加任何有機(jī)試劑，不會(huì)帶來(lái)任何有機(jī)溶劑的殘留。與已知的甘油酯的制備方法相比，本發(fā)明的方法更簡(jiǎn)單、成本更低、得到的共軛亞油酸甘油酯產(chǎn)品品質(zhì)更高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種利用固定化脂肪酶制備共軛亞油酸甘油酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用固定化脂肪酶制備共軛亞油酸甘油酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]共輒亞油酸(Conjugatedlinoleic acids,簡(jiǎn)稱(chēng)CLA)是亞油酸(Linoleic acids,簡(jiǎn)稱(chēng)LA)分子的幾種立體和位置異構(gòu)體的通稱(chēng)，是一系列含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸。CLA的雙鍵在碳鏈上主要有四種位置的排列方式:8，10-、9，11-、10，12-和11，13_，且由于共軛雙鍵兩端的碳原子都具有順式(cis)和反式(trans)兩種幾何構(gòu)型，即每種位置異構(gòu)又具有cis-cis、cis-trans、trans-cis、trans-trans四種幾何異構(gòu)體，所以CLA異構(gòu)體的種類(lèi)眾多。其中c9，111-CLA和tlO，C12-CLA是含量最多且已經(jīng)被證實(shí)具有生理活性的兩種主要異構(gòu)體。天然的CLA主要存在于瘤胃動(dòng)物如牛、羊的乳脂及肉制品中，每克乳脂中含量從2~25mg不等，并主要以c9，tll_CLA異構(gòu)體的形式存在。在天然的植物種子中，并不存在具有生理活性的c9，111-CLA和tlO，C12-CLA這兩種異構(gòu)體。無(wú)論是從動(dòng)物來(lái)源還是植物來(lái)源中，人們都無(wú)法從直接大量獲取CLA。
[0003]共軛亞油酸(CLA )具有明顯的抗癌作用，對(duì)胃癌、乳腺癌、腸癌、皮膚癌和前列腺癌有明顯的抑制作用。CLA具有抗動(dòng)脈硬化、降低血脂及調(diào)節(jié)血壓的作用。CLA能有效地發(fā)揮“血管清道夫”的作用。可清除血管中的垃圾。有效調(diào)節(jié)血液粘稠度，達(dá)到舒張血管，改善微循環(huán)，平穩(wěn)血壓的作用。同時(shí)CLA具有抗氧化、抗疲勞作用、免疫調(diào)節(jié)及減肥增肌等生理活性被越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外 科研和醫(yī)療機(jī)構(gòu)關(guān)注。由于CLA無(wú)毒，無(wú)用量上限，CLA產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)將在食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。
[0004]多不飽和脂肪酸作為保健食品已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，但其產(chǎn)品形式主要為乙酯型和游離脂肪酸型，研究結(jié)果表明，多不飽和脂肪酸在人體中不僅消化和吸收比較困難，而且可能存在安全隱患；游離型多不飽和脂肪酸易于被人體消化和吸收，但易氧化產(chǎn)生對(duì)人體有害的過(guò)氧化物，直接食用難以被人們接受；甘油酯型是其天然存在形式，易于被人體消化和吸收，且不存在安全性問(wèn)題，因此甘油酯型多不飽和脂肪酸是作為食用的最好產(chǎn)品形式，其中尤以三甘酯為最理想的形式。
[0005]目前，用于制備高CLA含量的甘油酯的方法主要有傳統(tǒng)化學(xué)法和生物酶法。傳統(tǒng)化學(xué)法存在反應(yīng)溫度高，對(duì)設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，產(chǎn)品色澤差等缺點(diǎn)；而酶催化法由于具有特異的選擇性，具有反應(yīng)條件溫和及對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在油脂工業(yè)中的應(yīng)用日益受到人們的青睞。
[0006]脂肪酶(EC3.1.1.3)是一類(lèi)特殊的酰基水解酶，多被用來(lái)催化一些酯類(lèi)合成和轉(zhuǎn)化反應(yīng)。脂肪酶是作為重要的工業(yè)酶制劑品種之一，廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)，具有其他酶蛋白無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)?？梢岳弥久复呋セⅤソ粨Q反應(yīng)將CLA結(jié)合到甘油骨架上，但是一般的游離脂肪酶在無(wú)溶劑體系中催化反應(yīng)活性低并且難以回收，會(huì)造成產(chǎn)品分離困難以及成本的增加。目前用于此方面的固定化脂肪酶多為NOVOZym435，這是一種來(lái)源于南極假絲酵母的脂肪酶，但脂肪酶NOVOZym435的價(jià)格昂貴，這是制約其應(yīng)用的最重要因素。
[0007]專(zhuān)利US20030175914利用固定化酶(Novozym435)催化共軛亞油酸乙酯與甘油或者甘油酯進(jìn)行反應(yīng)，在添加有機(jī)試劑(甲苯，二氧雜環(huán)環(huán)己烷)及真空度比較大的條件下，反應(yīng)l_7h，生成的三甘酯含量為84-90%。此工藝存在的問(wèn)題是有機(jī)溶劑毒性大、易殘留在產(chǎn)品中，同時(shí)有機(jī)溶劑揮發(fā)性較大造成生產(chǎn)成本較高。
[0008]專(zhuān)利CN200710030862.9利用固定化酶(Novozym435)在正己烷存在下，催化甘油與ω-3多不飽和脂肪酸游離脂肪酸酯化反應(yīng)制備三甘酯，反應(yīng)24h，甘油三酯含量為甘油酯量的31%，此工藝反應(yīng)時(shí)間比較長(zhǎng)，產(chǎn)率比較低。此工藝存在的問(wèn)題是整個(gè)工藝過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，易造成產(chǎn)物氧化，降低產(chǎn)品品質(zhì)，增加成本。
[0009]專(zhuān)利CN200810196271.3是通過(guò)化學(xué)法與酶法結(jié)合的方法進(jìn)行制備甘油酯，首先利用化學(xué)法水解魚(yú)油，然后利用固定化酶(Novozym435)在正己燒存在下,催化甘油與水解產(chǎn)物多不飽和脂肪酸進(jìn)行酯化反應(yīng)制備甘油酯，利用分子篩除去反應(yīng)中生成的水，反應(yīng)48h，甘油三酯含量為90%以上。此工藝存在的問(wèn)題是有機(jī)溶劑毒性大、易殘留在產(chǎn)品中，同時(shí)有機(jī)溶劑揮發(fā)性較大造成生產(chǎn)成本較高。
[0010]專(zhuān)利CN200810162265.6采用多不飽和脂肪酸游離脂肪酸與甘油進(jìn)行脂肪酶(Novozym435)催化反應(yīng)制備n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)甘油酯,添加1,4-二氧六環(huán)。反應(yīng)2-4h，酯化率達(dá)到50%，甘油三酯含量占10-20%。用到的添加劑會(huì)在最終產(chǎn)品中殘留，同時(shí)工藝中用到分子篩，不易重復(fù)利用，增加了反應(yīng)成本。此外，該工藝存在的問(wèn)題是有機(jī)溶劑毒性大、易殘留在產(chǎn)品中，同時(shí)有機(jī)溶劑揮發(fā)性較大造成生產(chǎn)成本較高。
[0011]專(zhuān)利CN200820168426.8設(shè)計(jì)了一套新型的制備甘油酯產(chǎn)品的裝置，酶層析柱與分子篩柱為一組反應(yīng)器， 進(jìn)行酶催化，可以實(shí)現(xiàn)幾組反應(yīng)器串聯(lián)的連續(xù)化反應(yīng)設(shè)備。同時(shí)利用有機(jī)溶劑(1，4-二氧六環(huán))對(duì)物料進(jìn)行混勻。但沒(méi)有具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。此工藝存在的問(wèn)題是有機(jī)溶劑毒性大、易殘留在產(chǎn)品中，同時(shí)有機(jī)溶劑揮發(fā)性較大，造成生產(chǎn)成本較高。
[0012]通過(guò)以上專(zhuān)利對(duì)比分析可以看出，由于脂肪酸和甘油難于形成均一反應(yīng)體系，往往需要選用適宜的有機(jī)溶劑體系的同時(shí)加強(qiáng)攪拌。但能擴(kuò)大到商業(yè)規(guī)模的很少，原因是有機(jī)溶劑的毒性、揮發(fā)性和昂貴的價(jià)格。無(wú)溶劑體系酶促反應(yīng)不僅解決了有機(jī)溶劑的毒性或表面活性劑問(wèn)題，而且減少了純化過(guò)程的許多步驟，大大降低了對(duì)環(huán)境的污染，有很好的應(yīng)用前景。同時(shí)無(wú)溶劑體系為反應(yīng)提供了與傳統(tǒng)溶劑不同的新的分子環(huán)境，有可能使反應(yīng)的選擇性或轉(zhuǎn)化率得到提高。在脂肪酶催化的酯交換反應(yīng)和酯合成反應(yīng)中，常使用無(wú)溶劑體系。但是，無(wú)溶劑體系也存在較大的問(wèn)題。例如專(zhuān)利CN201010147162利用多不飽和脂肪酸乙酯與甘油進(jìn)行酶催化反應(yīng)，真空脫除乙醇促使反應(yīng)進(jìn)行，不添加任何有機(jī)溶劑，反應(yīng)300h，甘油三酯含量為甘油酯的80%以上。但是可以看出，無(wú)溶劑體系反應(yīng)時(shí)間比較長(zhǎng)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0013]產(chǎn)品化的共軛亞油酸甘油酯的制備大部分是化學(xué)法，起始原料為共軛亞油酸乙酯及甲酯，制備共軛亞油酸乙酯及甲酯是通過(guò)紅花油與甲醇酯酯交換得到亞油酸甲酯產(chǎn)品，然后通過(guò)堿性催化劑催化共軛化后，得到共軛亞油酸乙酯及甲酯，物料中含有部分皂化的游離脂肪酸，需要進(jìn)行去酸值得到酸值< I的物料才能進(jìn)行酯交換反應(yīng)，工序繁瑣，影響產(chǎn)品品質(zhì)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明提供一種利用固定化脂肪酶催化共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯與甘油反應(yīng)制備共軛亞油酸甘油酯型產(chǎn)品的方法，目的是提供一種反應(yīng)時(shí)間比較短，利于工業(yè)化生產(chǎn)的無(wú)溶劑體系的生物酶法制備共軛亞油酸甘油酯型產(chǎn)品的方法。本發(fā)明的方法是以具有酸值的共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯和甘油為起始料，固定化脂肪酶為催化劑，采用在制備工藝的前期甘油與共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯交替進(jìn)料，后期甘油與共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯混合進(jìn)料的工藝。與已知的酶法制備甘油酯的工藝相比，此工藝更簡(jiǎn)單、成本更低、得到的共軛亞油酸甘油酯產(chǎn)品品質(zhì)更高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0015]本發(fā)明是以如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0016]一種制備共軛亞油酸甘油酯的方法，包括以下步驟:
[0017](I)物料罐中加入含游離脂肪酸的共軛亞油酸酯原料與甘油，靜置分層，預(yù)熱至65-85 0C ；
[0018](2)將在物料罐上層的共軛亞油酸酯與在物料罐下層的甘油交替泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應(yīng)柱中，分別勻速循環(huán)；
[0019](3)將步驟(2)的物料罐中物料，混合均勻，勻速泵入步驟(2)的酶反應(yīng)柱中，酶催化反應(yīng)20-30h，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0020]其中，所述共軛亞油酸酯原料中所述的共軛亞油酸酯為共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯；在步驟(3)所述的酶催化反應(yīng)過(guò)程中物料罐物料連續(xù)通入氮?dú)饣蛘叱檎婵?，脫除甲醇或乙醇?br> [0021]本發(fā)明所述固定化脂肪酶是 申請(qǐng)人:申請(qǐng)的專(zhuān)利CN103224926A中所述的方法制備。具體為，所述的固定化脂肪酶來(lái)源于南極假絲酵母(C.Antarctica)、產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)、曼赫根毛霉(R.miehei)。制備固定化脂肪酶時(shí),將含脂肪酶、水溶性蛋白以及糖類(lèi)化合物的液體介質(zhì)吸附于載體，載體可以為高分子有機(jī)合成材料，主要有Amberlite XAD761、Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD16、Amberlite XAD1600、ES-1 環(huán)氧樹(shù)脂。然后通過(guò)交聯(lián)劑將脂肪酶連接至載體上，不易脫落。交聯(lián)劑可以是聚乙烯亞胺，碳化二亞胺、聚丙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、戊二醛、丁二醛、對(duì)苯二醛中的一種。再加入適當(dāng)濃度的包埋劑，包埋劑可以選擇阿拉伯膠、海藻酸鈣、聚乙二醇、聚乙烯醇、酪蛋白酸鈉和明膠中的一種，使吸附的脂肪酶更緊密的結(jié)合于載體上，使其不易泄露，增加酶活性，提高重復(fù)使用次數(shù)。
[0022]本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的固定化脂肪酶的含水量控制在1_10%。
[0023]本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的固定化脂肪酶可以循環(huán)利用100次以上，每次更換新的物料，只需用共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯浸潤(rùn)即可。
[0024]本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯所含游離脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、共軛亞油酸的混合物，游離脂肪酸的質(zhì)量百分含量?jī)?yōu)選為0-15%，更優(yōu)選為5-15%，最優(yōu)選為5-10%。所述的共軛亞油酸(CLA)，由四種異構(gòu)體組成，其中順9，反11 (“c9，til”) -CLA和反10，順12 (“tlO，cl2”) -CLA含量為80%及以上，其它的異構(gòu)體反9，反11 (“t9，til”)-CLA與反10，反12 (“tlO，tl2”)_CLA的含量≤1%。
[0025]本發(fā)明采用含有部分游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯為原料進(jìn)行制備甘油酯反應(yīng)。技術(shù)人員在實(shí)踐中，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，含有少量游離脂肪酸的共軛亞油酸酯比不含游離脂肪酸的共軛亞油酸酯反應(yīng)效率更高，分析認(rèn)為，含有游離脂肪酸的共軛亞油酸酯在反應(yīng)中能夠產(chǎn)生部分水分子，對(duì)固定化脂肪酶起到潤(rùn)滑作用，有利于酶活的發(fā)揮，加快了反應(yīng)效率。這一應(yīng)用克服了通常認(rèn)為的必須采用不含游離脂肪酸的共軛亞油酸酯制備共軛亞油酸甘油酯的技術(shù)偏見(jiàn)。同時(shí)，這一應(yīng)用與通常的技術(shù)相比，既省去了反應(yīng)前使用硫酸氫鈉等二次酯化去酸值的過(guò)程，也省去了其后水洗去除中和產(chǎn)物以及雜質(zhì)的步驟，大大減少了反應(yīng)時(shí)間，簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟，減少了反應(yīng)最終產(chǎn)物雜質(zhì)含量，在本領(lǐng)域中尚未見(jiàn)采用含有部分游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯或乙酯為原料，制備共軛亞油酸甘油酯。
[0026]本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟(1)中所述的共軛亞油酸酯與甘油的摩爾比為3-5:1。
[0027]本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟(3)所述的酶催化反應(yīng)溫度優(yōu)選為35_60°C，即在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中酶反應(yīng)柱溫度要控制在35_60°C。
[0028]本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的固定化脂肪酶的使用量為共軛亞油酸酯質(zhì)量的5-10%ο
[0029]上述制備方法的步驟(2)為反應(yīng)第一階段，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，反應(yīng)起始5-10h進(jìn)行交替進(jìn)料，即①將共軛亞油酸酯泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應(yīng)柱中，勻速循環(huán)1-3次，停止循環(huán)；②將甘油泵入酶反應(yīng)柱中，勻速循環(huán)1-3次，停止循環(huán)反復(fù)步驟①~②5-10h ;其中步驟①和②中，物料循環(huán)速率為0.5-3ml/min，最優(yōu)的流速控制在1-2.5ml/min。在【具體實(shí)施方式】中，也可以首先用共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯對(duì)固定化酶進(jìn)行浸潤(rùn)10_20min，然后對(duì)共軛亞油酸甲酯或者乙酯與甘油進(jìn)行交替進(jìn)料，進(jìn)料順序任意。反應(yīng)起始階段，體系中 沒(méi)有單甘脂，物料的混合效果不好，形成的是水包油的體系，固定化酶接觸共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于甘油，導(dǎo)致反應(yīng)效率比較慢，采用共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯與甘油交替進(jìn)料，可以有效地增加甘油與固定化酶的接觸機(jī)率，增加反應(yīng)效率。反應(yīng)體系中產(chǎn)生一定量的單甘脂后，反應(yīng)體系中物料在單甘脂乳化作用下，形成均一體系，反應(yīng)效率提高。
[0030]上述制備方法的步驟(3)為反應(yīng)第二階段，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，在步驟(2)中，物料通過(guò)恒流泵循環(huán)于物料罐與酶反應(yīng)柱后，被收集在物料罐中的物料攪拌混合均勻，攪拌速率為100-200rpm/min,通過(guò)恒流泵勻速,速度控制在0.5-3ml/min,最優(yōu)的流速控制在1-2.5ml/min，將物料液泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應(yīng)柱中酶催化合成甘油酯反應(yīng)。
[0031]在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述酶催化反應(yīng)的溫度為35_60°C，優(yōu)選為40_60°C，更優(yōu)選為 45-55 °C。
[0032]本發(fā)明的共軛亞油酸甘油酯的制備方法，在酶催化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的反應(yīng)副產(chǎn)物為甲醇或乙醇，本發(fā)明采用在整個(gè)酶催化反應(yīng)過(guò)程中不斷通入氮?dú)饣蛘叱檎婵盏姆绞匠ゼ状蓟蛞掖?，其中氮?dú)饬髁靠刂圃?.1-1.0L/min,抽真空的負(fù)壓控制在0.3-1.0Mpa,以保證在最少的能源與物料消耗的前提下，去除反應(yīng)副產(chǎn)物。另一方面，甲醇、乙醇的沸點(diǎn)分別為64.6578.4°C，本發(fā)明將反應(yīng)物料的混合溫度控制在65_85°C可以更好的去除甲醇或乙醇，加快反應(yīng)速度，提高反應(yīng)效率。
[0033]本發(fā)明的方法制備得到的共軛亞油酸甘油酯，色澤淺淡，除c9，tllCLA和tlO，cl2CLA活性異構(gòu)體以外的其它共軛亞油酸異構(gòu)體不增長(zhǎng)，產(chǎn)品中共軛亞油酸甘油單酯質(zhì)量百分含量為0-1%，共軛亞油酸甘油二酯的質(zhì)量百分含量為1_20%，共軛亞油酸甘油三酯的質(zhì)量百分含量為75-90%。[0034]本發(fā)明中，共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯的共軛亞油酸甘油酯酯化率均達(dá)70-90%ο
[0035]本發(fā)明的總反應(yīng)時(shí)間為25_40h，縮短到以往技術(shù)300h的反應(yīng)時(shí)間的8_13%，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0036]本發(fā)明的制備共軛亞油酸甘油酯的方法，也適用于其它多不飽和脂肪酸甘油酯的制備。
[0037]本發(fā)明的有益效果:
[0038](I)本發(fā)明的制備方法，直接利用固定化脂肪酶催化共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯為原料與甘油反應(yīng)制備共軛亞油酸甘油酯。工藝中以含有游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯為原料省去了共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯的去酸值的前處理工藝，同時(shí)整個(gè)工藝中不添加任何有機(jī)試劑，省去了其后水洗去除中和產(chǎn)物以及雜質(zhì)的步驟，也省去了后續(xù)分離純化的繁瑣工序，大大減少了反應(yīng)時(shí)間，簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟，減少了反應(yīng)最終產(chǎn)物雜質(zhì)含量，提高了產(chǎn)品的品質(zhì)，降低了生產(chǎn)成本。
[0039](2)本發(fā)明中使用的固定化脂肪酶成本低廉,約是脂肪酶Novozym435價(jià)格的1/3,重復(fù)利用率高，后續(xù)處理簡(jiǎn)單，大大節(jié)省了成本，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0040](3)本發(fā)明利用升高物料溫度，同時(shí)沖入低流量的氮?dú)獬ド傻募状蓟蛘咭掖?，此工藝脫除副產(chǎn)物的條件簡(jiǎn)單，易于實(shí)驗(yàn)，成本低，易于工業(yè)化。
[0041](4)本發(fā)明制 備得到的共軛亞油酸甘油酯色澤淺淡，除c9，tll-CLA和tlO，cl2-CLA活性異構(gòu)體以外的其它共軛亞油酸異構(gòu)體不增長(zhǎng)，產(chǎn)品中，共軛亞油酸甘油單酯的質(zhì)量百分含量為0-1%，共軛亞油酸甘油二酯的質(zhì)量百分含量為1_20%，共軛亞油酸甘油三酯的質(zhì)量百分含量為75-90%。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用試劑等均可從化學(xué)試劑公司購(gòu)買(mǎi)。
[0043]本發(fā)明所述固定化脂肪酶是我公司申請(qǐng)的專(zhuān)利CN103224926A中所述的方法制備。
[0044]在下述實(shí)施例中使用的固定化脂肪酶是專(zhuān)利CN103224926A中公開(kāi)的實(shí)施例4中制備的固定化脂肪酶。
[0045]酶反應(yīng)柱的準(zhǔn)備:下述實(shí)施例中使用的酶反應(yīng)柱為帶加熱套的玻璃層析柱，反應(yīng)柱的規(guī)格為:長(zhǎng)度20cm，直徑1.6cm。酶反應(yīng)柱與恒流泵相連接。反應(yīng)液在反應(yīng)過(guò)程中勻速流經(jīng)恒流泵然后進(jìn)入酶反應(yīng)柱中，反應(yīng)液在物料罐和酶反應(yīng)柱中勻速循環(huán)。在下述實(shí)施例中，進(jìn)行物料罐上層的共軛亞油酸循環(huán)時(shí)，由上層低端出料循環(huán)回到共軛亞油酸層，避免與下層的甘油混合。同樣，進(jìn)行物料罐上層的甘油循環(huán)時(shí)，由下層的低端出料循環(huán)回到下層的甘油層，避免與下層的甘油混合。
[0046]裝柱方法:將固定化脂肪酶以干法裝住的方式進(jìn)行填充，裝柱時(shí)先利用固定化脂肪酶自然沉降入柱中，然后用轉(zhuǎn)換頭將其壓實(shí)。
[0047]原料:含游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯原料由下述方法制備:[0048]①將紅花籽油、甲醇和氫氧化鈉投入到反應(yīng)釜中，紅花籽油與甲醇的投料摩爾比為1:3.5，氫氧化鈉的加入量為紅花籽油質(zhì)量的20-30%，氮?dú)庵脫Q后在200°C條件下攪拌反應(yīng)7h ；
[0049]②反應(yīng)產(chǎn)物酸化至pH為2，攪拌，靜置，分離出油相產(chǎn)物，水洗至近中性，減壓脫水，得到共軛亞油酸初產(chǎn)物；
[0050]③將共軛亞油酸初產(chǎn)物與甲醇或乙醇以摩爾比1:6混合，加入共軛亞油酸質(zhì)量的7%的硫酸氫鈉或硫酸氫鉀，80°C條件下反應(yīng)7h ;生成酸值≤30mg KOH/g的共軛亞油酸甲酯或乙酷；
[0051]④將步驟③的產(chǎn)物加入其質(zhì)量1%的活性白土及其質(zhì)量1%的活性炭，在75°C攪拌
1.5h后過(guò)濾；
[0052]⑤步驟④所得濾液于175 °C，真空度20Pa條件下進(jìn)行分子蒸餾分離純化得含有0-30%游離酸共軛亞油酸甲酯產(chǎn)品。
[0053]在上述步驟①-⑤中，當(dāng)步驟③的反應(yīng)時(shí)間為7h時(shí)，得到含有1%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯產(chǎn)品。
[0054]在上述步驟①-⑤中，當(dāng)步驟③的反應(yīng)時(shí)間為4h時(shí)，得到含有5%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯產(chǎn)品。
[0055]在上述步驟① -⑤中，當(dāng)步驟③的反應(yīng)時(shí)間為2.5h時(shí)，得到含有10%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯產(chǎn)品。
[0056]在上述步驟①-⑤中，當(dāng)步驟③的反應(yīng)時(shí)間為Ih時(shí)，得到含有15%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯產(chǎn)品。
[0057]本發(fā)明采用高效液相色譜測(cè)定共軛亞油酸產(chǎn)品中所含的組分及其含量，測(cè)定條件為:色譜柱為018柱(4.611111^25011111^5 4 111)，流動(dòng)相為丙酮與乙腈混合物(丙酮:乙腈=70:30 (v/v)),流速為 lml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為 210nm。
[0058]實(shí)施例1
[0059](I)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在45°C ；
[0060](2)將含有1%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比3:1投入至物料罐里，預(yù)熱至6511C ；
[0061](3)將步驟(2)中的物料攪拌混合均勻，進(jìn)行攪拌速度為100rpm/min,混合均勻的料液通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，在45°C、連續(xù)反應(yīng)35h，收集反應(yīng)產(chǎn)物，在175°C下，20Pa進(jìn)行分子蒸餾除掉過(guò)量的共軛亞油酸甲酯，得到最終產(chǎn)物。
[0062]最終產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其組成及含量，結(jié)果如表1所示。
[0063]實(shí)施例2
[0064](I)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在45°C ；
[0065](2)將含有0%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比3:1投入至物料罐里，靜置，反應(yīng)液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應(yīng)液預(yù)熱至65°C ；
[0066]( 3 )將連接恒流泵的進(jìn)樣管通入在反應(yīng)液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進(jìn)料管通入到在反應(yīng)液下層的甘油層底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復(fù)交替進(jìn)料反應(yīng)8h,停止循環(huán)；[0067](4)將步驟(3)中物料罐中的反應(yīng)液攪拌混合均勻，攪拌速度為100rpm/min，混合均勻的料液通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，在45°C、連續(xù)反應(yīng)20h，收集反應(yīng)產(chǎn)物，在175°C下，20Pa進(jìn)行分子蒸餾除掉過(guò)量的共軛亞油酸甲酯，得到最終產(chǎn)物。
[0068]最終產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其組成及含量，結(jié)果如表1所示。
[0069]實(shí)施例3
[0070]( 1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在50°C ；
[0071](2)將含有5%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比3.5:1投入至物料罐里，靜置，反應(yīng)液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應(yīng)液預(yù)熱至65°C ；
[0072](3 )將連接恒流泵的進(jìn)樣管通入在反應(yīng)液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進(jìn)料管通入到在反應(yīng)液下層的甘油層底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復(fù)交替進(jìn)料反應(yīng)8h，停止循環(huán)；
[0073](4 )將步驟(3 )中物料罐中的反應(yīng)液攪拌均勻，通過(guò)恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應(yīng)柱中，反應(yīng)液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在50°C、酶催化反應(yīng)20h，收集反應(yīng)產(chǎn)物，在175°C下，20Pa進(jìn)行分子蒸餾除掉過(guò)量的甲酯得到最終產(chǎn)物。
[0074]最終產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其組成及含量，結(jié)果如表1所示。
[0075]實(shí)施例4
[0076](1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在55°C ；
[0077](2)將含有5%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比3.5:1投入至物料罐里，靜置，反應(yīng)液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應(yīng)液預(yù)熱至65°C ；
[0078](3)將連接恒流泵的進(jìn)樣管通入在反應(yīng)液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進(jìn)料管通入到在反應(yīng)液下層的甘油層底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復(fù)交替進(jìn)料反應(yīng)8h，停止循環(huán)；
[0079](4 )將步驟(3 )的物料罐中的反應(yīng)液攪拌均勻，通過(guò)恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應(yīng)柱中，反應(yīng)液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在55°C、酶催化反應(yīng)20h，其中在酶催化反應(yīng)的過(guò)程中同時(shí)通入氮?dú)?，氮?dú)饬髁繛?.51/min。反應(yīng)完畢后，收集反應(yīng)產(chǎn)物，在175°C下，20Pa進(jìn)行分子蒸餾除掉過(guò)量的甲酯，得到最終產(chǎn)物。
[0080]最終產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其組成及含量，結(jié)果如表1所示。
[0081]實(shí)施例5
[0082](1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在60°C ；
[0083](2)將含有5%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比4:1投入至物料罐里，靜置反應(yīng)液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應(yīng)液預(yù)熱至80°C ；
[0084]( 3 )將連接恒流泵的進(jìn)樣管通入在反應(yīng)液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進(jìn)料管通入到在反應(yīng)液下層的甘油層底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復(fù)交替進(jìn)料反應(yīng)8h，停止循環(huán)；
[0085](4 )將步驟(3 )的物料罐中的反應(yīng)液攪拌均勻，通過(guò)恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應(yīng)柱中，反應(yīng)液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在60°C、酶催化反應(yīng)20h，其中在酶催化反應(yīng)的過(guò)程中同時(shí)通入氮?dú)?，氮?dú)饬髁繛?.11/min。反應(yīng)完畢后，收集反應(yīng)產(chǎn)物，在175°C下，20Pa進(jìn)行分子蒸餾除掉過(guò)量的甲酯，得到最終產(chǎn)物。
[0086]最終產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其組成及含量，結(jié)果如表1所示。
[0087]實(shí)施例6
[0088](1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在60°C ；
[0089](2)將含有10%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比4:1投入至物料罐里，靜置反應(yīng)液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應(yīng)液預(yù)熱至75°C ；
[0090]( 3 )將連接恒流泵的進(jìn)樣管通入在反應(yīng)液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進(jìn)料管通入到在反應(yīng)液下層的甘油層底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復(fù)交替進(jìn)料反應(yīng)8h，停止循環(huán)；
[0091 ] (4 )將步驟(3 )的物料罐中反應(yīng)液攪拌均勻，通過(guò)恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應(yīng)柱中，反應(yīng)液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在60°C、酶催化反應(yīng)20h，其中在酶催化反應(yīng)的過(guò)程中同時(shí)通入氮?dú)?，氮?dú)饬髁繛?.51/min，收集反應(yīng)產(chǎn)物，在175°C下，20Pa進(jìn)行分子蒸餾除掉過(guò)量的甲酯，得到最終產(chǎn)物；
[0092]最終產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其組成及含量，結(jié)果如表1所示。
[0093]實(shí)施例7
[0094](I)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在50°C ；
[0095](2)將含有15%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比4:1投入至物料罐里，靜置反應(yīng)液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應(yīng)液預(yù)熱至75°C ；
[0096]( 3 )將連接恒流泵的進(jìn)樣管通入在反應(yīng)液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進(jìn)料管通入到在反應(yīng)液下層的甘油層底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復(fù)交替進(jìn)料反應(yīng)9h，停止循環(huán)；
[0097](4 )將步驟(3 )的物料罐中的反應(yīng)液攪拌均勻，通過(guò)恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應(yīng)柱中，反應(yīng)液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在50°C、酶催化反應(yīng)20h，其中在酶催化反應(yīng)的過(guò)程中同時(shí)通入氮?dú)猓獨(dú)饬髁繛?.31/min,反應(yīng)完畢后，收集反應(yīng)產(chǎn)物，在175°C下，20Pa進(jìn)行分子蒸餾除掉過(guò)量的甲酯，得到最終產(chǎn)物。
[0098]最終產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其組成及含量，結(jié)果如表1所示。
[0099]實(shí)施例8
[0100](1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在55°C ；
[0101](2)將含有10%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比4:1投入至物料罐里，靜置反應(yīng)液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應(yīng)液預(yù)熱至85°C ；
[0102](3)將連接恒流泵的進(jìn)樣管通入在反應(yīng)液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進(jìn)料管通入到在反應(yīng)液下層的甘油層底端，通過(guò)恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復(fù)交替進(jìn)料反應(yīng)10h，停止循環(huán)；
[0103](4)將步驟(3)的物料罐中的反應(yīng)液攪拌均勻，通過(guò)恒流泵泵入步驟(3)的酶反應(yīng)柱中，反應(yīng)液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在55°C、酶催化反應(yīng)16h，反應(yīng)過(guò)程中抽真空，真空負(fù)壓為0.6Mpa，反應(yīng)完畢后，收集反應(yīng)產(chǎn)物，在175°C下，20Pa進(jìn)行分子蒸餾除掉過(guò)量的甲酯得到最終產(chǎn)物。
[0104]最終產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其組成及含量，結(jié)果如表1所示。
[0105]在實(shí)施例8的反應(yīng)條件下，固定化酶能夠被循環(huán)利用50次，酶活損失< 10%。
[0106]在實(shí)施例6的反應(yīng)條件下，固定化酶能夠被循環(huán)利用40次，酶活損失< 10%。
[0107]表1.反應(yīng)產(chǎn)物組成及其在反應(yīng)產(chǎn)物中的含量
【權(quán)利要求】
1.一種酶法制備共軛亞油酸甘油酯的方法，包括以下步驟: (1)物料罐中加入含游離脂肪酸的共軛亞油酸酯原料與甘油，靜置分層，預(yù)熱至65-85 0C ； (2)將在物料罐上層的共軛亞油酸酯原料與在物料罐下層的甘油交替泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應(yīng)柱中，分別勻速循環(huán)； (3)將步驟(2)的物料罐中物料，混合均勻，勻速泵入步驟(2)的酶反應(yīng)柱中，酶催化反應(yīng)20-30h，收集反應(yīng)產(chǎn)物； 其中，所述共軛亞油酸酯原料中所述的共軛亞油酸酯為共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯；在步驟(3)所述的酶催化反應(yīng)過(guò)程中充入氮?dú)饣蛘叱檎婵?，脫除甲醇或乙醇?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的游離脂肪酸在共軛亞油酸酯原料中的質(zhì)量百分含量為0_15%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的共軛亞油酸酯與甘油的摩爾比為3-5:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化脂肪酶的使用量為共軛亞油酸酯質(zhì)量的5-10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)包括如下過(guò)程:①將共軛亞油酸酯泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應(yīng)柱中，勻速循環(huán)1-3次，停止循環(huán)；②將甘油泵入酶反應(yīng)柱中，勻速循環(huán)1-3次，停止循環(huán)；③反復(fù)步驟①~②5-10h ;其中步驟①和②中，物料循環(huán)速率均為0.5-3ml/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氮?dú)饬髁繛?.l-1.0L/min，抽真空的負(fù)壓為0.3-1.0Mpa0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的酶催化反應(yīng)溫度為35-60。。。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反應(yīng)產(chǎn)物中共軛亞油酸甘油單酯的質(zhì)量百分含量為0-1%，共軛亞油酸甘油二酯的質(zhì)量百分含量為1_20%，共軛亞油酸甘油三酯的質(zhì)量百分含量為75-90%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，共軛亞油酸酯的共軛亞油酸甘油酯酯化率為 70-90%。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK103849659SQ201410123647
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】吳文忠, 楊大蘋(píng), 伏萃翠, 徐維鋒, 姜書(shū)華, 洪永德 申請(qǐng)人:大連醫(yī)諾生物有限公司