痕量rna實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種痕量RNA實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法，包括以下步驟：A1、首先進(jìn)行DNA探針在芯片上的包被；A2、然后將待檢痕量RNA與預(yù)先包被的DNA探針雜交，再加入DSN酶以降解雜交雙鏈中的DNA，使RNA游離出來與DNA探針雜交，進(jìn)而RNA-DNA復(fù)合物中的DNA繼續(xù)被DSN降解，再次使RNA游離出來，重復(fù)上述過程，可以使體系中所有RNA-DNA復(fù)合物中的DNA均可被DSN酶降解。由于芯片上包被的DNA探針的量與SPR角度值成正相關(guān)，隨著芯片上的DNA探針被逐漸酶切，導(dǎo)致其SPR角度值逐漸改變，通過該SPR角度值的變化對(duì)靶分子RNA進(jìn)行快速定量實(shí)時(shí)檢測(cè)。
【專利說明】痕量RNA實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種痕量RNA實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核糖核酸RNA是存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體，對(duì)基因的表達(dá)與蛋白質(zhì)生物合成起重要的作用。在生物體內(nèi)主要有四種不同的RNA分子，分別是信使 RNA (mRNA)、轉(zhuǎn)移 RNA (tRNA)、核糖體 RNA (rRNA)、微小 RNA (microRNA，miRNA)。它們參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能。要了解RNA在基因調(diào)控中扮演的角色，很關(guān)鍵的一個(gè)方法就是迅速、準(zhǔn)確地定量檢測(cè)RNA基因的表達(dá)。因此如果早期能對(duì)疾病進(jìn)行分子水平RNA的檢測(cè)，將為疾病的早期診斷提供重要的依據(jù)。
[0003]但是由于小分子RNA是一類很小的分子，部分小分子RNA表達(dá)水平極低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。傳統(tǒng)常用的檢測(cè)方法有Northern blot技術(shù)、RNA芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)三類。Northern blot技術(shù)是驗(yàn)證和確認(rèn)RNA的重要方法，但該方法操作繁瑣并且靈敏度低，不適用于臨床樣本的高通量檢測(cè)芯片技術(shù)檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)快速、高通量的檢測(cè)，但其需要的RNA初始樣本量大，并且以雜交為基礎(chǔ)，因此無法區(qū)分單堿基差異的RNA，再者，芯片技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果為半定量，該方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性較差，一般多用于初篩。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可以定量分析RNA的表達(dá)，且樣本需要量較少，顯著提高了敏感度，但對(duì)于miRNAs檢測(cè)存在以下問題，由于成熟miRNAs長(zhǎng)度較短，難以針對(duì)成熟miRNAs設(shè)計(jì)有效的特異性引物和探針，只能用前體miRNAs來代替，因此無法真實(shí)體現(xiàn)相應(yīng)的成熟miRNAs水平。另外，實(shí)時(shí)定量PCR是基于體外擴(kuò)增的技術(shù)，易受擴(kuò)增溫度的影響，后來演變出以滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)為代表的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)低豐度核酸的等溫檢測(cè)。然而該技術(shù)同樣存在著如下缺陷，當(dāng)前，RCA均相檢測(cè)RNA多采用熒光染料與DNA產(chǎn)物相結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)熒光進(jìn)行檢測(cè)，但由于熒光染料與溶液中的DNA和RNA都能結(jié)合，在實(shí)際樣品分析時(shí)易使檢測(cè)的背景值偏高，降低檢測(cè)的靈敏度。并且，上述實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、RCA技術(shù)都是是以擴(kuò)增為基礎(chǔ)，檢測(cè)結(jié)果的特異性存在風(fēng)險(xiǎn)，極大的限制了核酸檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用。因此，實(shí)現(xiàn)無需熒光標(biāo)記無需核酸擴(kuò)增的低豐度核酸直接檢測(cè)和實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)將是方法學(xué)上的一大突破。
[0004] 雙鏈特異性核酸酶(Duplex-specificnuclease, DSN)能夠選擇性降解DNA-RNA雜交體中的DNA，對(duì)單鏈核酸分子幾乎沒有作用，因此是構(gòu)建RNA文庫中的最經(jīng)典工具之一。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道了將DSN用于miRNA檢測(cè)，其原理也是基于DSN能夠選擇性降解DNA-RNA雜交體中的DNA。通過使體系中RNA與DNA探針雜交，再運(yùn)用DSN酶切DNA-RNA雙鏈中的DNA單鏈，使RNA單鏈游離后繼續(xù)與預(yù)先包被的DNA探針進(jìn)行雜交。重復(fù)上述“雜交-酶切-游離”過程即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大。然而上述方法有兩個(gè)問題尚無法克服:DmiRNA檢測(cè)技術(shù)是基于終點(diǎn)觀測(cè)，無法動(dòng)態(tài)觀測(cè)miRNA-DNA結(jié)合與選擇性酶切這一動(dòng)態(tài)過程，因此檢測(cè)結(jié)果的可靠性受到質(zhì)疑。2)由于芯片上的包被的DNA數(shù)量是有限的(過高則存在較大空間位阻，過低則靈敏度差)，從而使得上述miRNA檢測(cè)的最低檢出限差，無法真正實(shí)現(xiàn)臨床樣本中低濃度miRNA的無擴(kuò)增直接檢測(cè)。
[0005]表面等離子體共振(SPR)技術(shù)可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)生物大分子間的反應(yīng)，是觀測(cè)生物分子結(jié)合與解離的可靠檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明擬通過SPR技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建能夠?qū)崟r(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)痕量RNA的核酸檢測(cè)技術(shù)。并且通過發(fā)明一維碳納米材料石墨烯金膜包被技術(shù)和納米金修飾探針技術(shù)，數(shù)量級(jí)放大已包被的DNA探針質(zhì)量信號(hào)，結(jié)合DSN的循環(huán)酶切技術(shù)，從而指數(shù)級(jí)提高檢測(cè)靈敏度，從而實(shí)現(xiàn)RNA的無需擴(kuò)增直接檢測(cè)與動(dòng)態(tài)觀測(cè)。最終建立一套“可視化” DSN信號(hào)放大RNA實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方法，以期為疾病的早期診斷提供可靠技術(shù)支撐(原理如圖1所示)。為增強(qiáng)檢測(cè)方法的靈敏度，引入了一種吸附性很強(qiáng)的石墨烯，通過構(gòu)建的石墨烯芯片實(shí)現(xiàn)高效包被DNA探針，同時(shí)，對(duì)DNA探針進(jìn)行納米金修飾，增加探針的質(zhì)量，從而增大SPR的監(jiān)測(cè)信號(hào)。另外，石墨烯芯片上的石墨烯可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，避免造成SPR信號(hào)干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的靈敏度不足和無法實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)的問題提供一種痕量RNA實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一、首先進(jìn)行DNA探針在芯片上的包被；包括如下方法:石墨烯系統(tǒng)，純金膜-巰基系統(tǒng)，短鏈羧化物-氨基系統(tǒng)(如常用的鏈酶親和素-生物素)。
[0009]二、然后將待 檢痕量RNA與預(yù)先包被的DNA探針雜交，再加入DSN酶以降解雜交雙鏈中的DNA，使RNA游離出來與DNA探針雜交，進(jìn)而RNA-DNA復(fù)合物中的DNA繼續(xù)被DSN降解，再次使RNA游離出來，重復(fù)上述過程,可以使體系中所有RNA-DNA復(fù)合物中的DNA均可被DSN酶降解。
[0010]三、由于芯片上包被的DNA探針的量與SPR角度值成正相關(guān)，隨著芯片上的DNA探針被逐漸酶切，導(dǎo)致其SPR角度值逐漸改變，利用表面等離子體共振(SPR)平臺(tái)，可觀測(cè)每個(gè)時(shí)刻SPR角度值的變化，其反映了檢測(cè)RNA每個(gè)時(shí)刻的情況，通過該SPR角度值的變化可對(duì)靶分子RNA進(jìn)行快速定量實(shí)時(shí)檢測(cè)。本方法可根據(jù)酶切完全時(shí)間來定量RNA，或者確定某一時(shí)刻根據(jù)相應(yīng)的SPR角度值來定量RNA。
[0011]四、為了增大DNA探針在SPR上的監(jiān)測(cè)信號(hào)，以納米金修飾DNA探針。
[0012]五、構(gòu)建了石墨稀芯片以聞效包被DNA探針,確保檢測(cè)的靈敏度。同時(shí)，石墨稀可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號(hào)干擾。
[0013]六、酶切過程中加入的雙鏈特異性核酸酶(DSN)的反應(yīng)溫度可在20°C -50°C，這里首選37 °C作為反應(yīng)最適溫度。
[0014]七、為了增強(qiáng)DSN酶在反應(yīng)過程中的活性，可加入一定濃度SDS，巰基乙醇，或者H202水溶液。
[0015]八、本方法利用表面等離子體共振(SPR)平臺(tái)，可完成檢測(cè)過程中對(duì)RNA水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:[0017]構(gòu)建石墨烯芯片，以石墨烯的高親和性提高包被DNA探針數(shù)量，以納米金修飾DNA探針，增強(qiáng)單個(gè)探針的SPR信號(hào)，從而確保所包被探針具有較高的基礎(chǔ)SPR信號(hào)。以雙鏈特異性核酸酶(DSN)進(jìn)行選擇性酶切，既可以實(shí)現(xiàn)在等溫情況下對(duì)痕量RNA的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大提高檢測(cè)靈敏度，又可以利用DSN的酶切校正功能確保檢測(cè)特異性。同時(shí)，包被的多層石墨烯可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號(hào)干擾。通過表面等離子體共振(SPR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)痕量RNA的無需標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。有機(jī)整合上述方案可實(shí)現(xiàn)痕量RNA恒溫實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。同時(shí)本方法適合各種RNA分子的檢測(cè)，實(shí)用性廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1DSN對(duì)于雙鏈的切割過程原理圖；
[0019]圖2DSN在不同條件下活性的檢測(cè)電泳圖；
[0020]圖3石墨稀芯片構(gòu)建不意圖；
[0021]圖4石墨烯系統(tǒng)納米金DNA探針包被前后及解離后SPR圖；
[0022]圖5純金膜-巰基系統(tǒng)DNA探針包被前后及解離后SPR圖；
[0023]圖6短鏈羧化物-氨基系統(tǒng)DNA探針包被前后及解離后SPR圖；
[0024]圖7DNA探針包被、miRNA21雜交及DSN酶切動(dòng)態(tài)過程圖；
[0025]圖8不同濃度miRNA21雜交標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0026]圖9DNA探針與miRNA特異性檢測(cè)圖；
[0027]圖10不同濃度miRNA酶切時(shí)間比較圖；
[0028]圖1lmiRNA酶切完全時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0029]圖12定量檢測(cè)miRNA21標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0030]圖13驗(yàn)證DSN活性最適條件圖；
[0031]圖14石墨烯系統(tǒng)RNA的DNA探針包被前后及解離后SPR圖；
[0032]圖15RNA的DNA探針包被、RNA雜交及DSN酶切動(dòng)態(tài)過程圖；
[0033]圖16不同濃度RNA雜交標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0034]圖17RNA的DNA探針與RNA特異性檢測(cè)圖；
[0035]圖18不同濃度RNA酶切時(shí)間比較圖；
[0036]圖19RNA酶切完全時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0037]圖20定量檢測(cè)RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0039]具體實(shí)施方案一(檢測(cè)痕量miRNA):
[0040]一、雙鏈特異性核酸酶(DSN)酶切條件的優(yōu)化
[0041]雙鏈特異性核酸酶(DSN)最適反應(yīng)溫度為60°C，本實(shí)驗(yàn)需要采用SPR技術(shù)，而SPR芯片的運(yùn)行溫度不超過50°C。所以需要找到某種特定濃度的物質(zhì)使酶在37°C有較高的活性。
[0042]1.雙鏈特異性核酸酶(DSN)分裝(由everogen公司生產(chǎn)的DSN試劑盒)
[0043]2.在整個(gè)反應(yīng)體系(3ul 雙 鏈 DNA，lullOXDSNmasterbuffer，lulDSN 酶)中加入5ul2%的SDS，優(yōu)化得到的雙鏈特異性核酸酶(DSN)的最適反應(yīng)條件，保證最終SDS占1%。
[0044]在1.5%瓊脂糖、TBE緩沖液、80V電壓下，電泳30min。(圖3) M: 2000的marker,1.模板+37°C +未酶切，2.模板+37°C +酶切，3.模板+37°C +酶切+1%SDS，4.模板+65°C +酶切，5.模板+65°C +酶切+1%SDS。參考圖3，通過1.5%瓊脂糖電泳驗(yàn)證DSN酶的活性，每個(gè)泳道的DNA加樣量為200ng ;泳道1-DNA模板在37°C孵育未加DSN酶，泳道2-DNA模板與DSN酶在37°C孵育，泳道3-DNA模板與DSN酶、1%SDS在37°C共同孵育，泳道4-DNA模板與DSN酶在65 °C孵育，泳道5-DNA模板與DSN酶、1%SDS在65 °C共同孵育。
[0045]泳道I在IOObp處可見高亮度的DNA條帶，泳道2、3、4在IOObp處模糊可見DNA條帶的痕跡，泳道5在IOObp處可見亮度明顯高于泳道2、3、4的DNA條帶，泳道3、5在750bp處的條帶痕跡是未溶解的SDS。
[0046]該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在37°C時(shí)加入1%的SDS’ DSN具有較好的酶切活性，在65°C時(shí)加入1%的SDS，DSN的酶切活性明顯受到抑制，使泳道5可以看見明顯條帶。
[0047]二、DNA探針和miRNA的合成(由上海生物工程公司合成)
[0048]1.合成 miRNA21:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
[0049]2.合成 miRNA21 的 DNA 探針 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探針的 5 ‘端進(jìn)行納米金修飾(Pl)
[0050]3.合成 miRNA21 的 DNA 探針 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探針的 5 ‘端進(jìn)行巰基修飾(P2) [0051]4.合成 miRNA21 的 DNA 探針 ATCGAATAGTCTGACTACAACT，在探針的 5 ‘端進(jìn)行氨基修飾(P3)
[0052]三、DNA探針在芯片上的包被(三種方法)
[0053](一)方法一:利用石墨烯高親和性包被探針Pl
[0054]1.從炭美石墨烯產(chǎn)品網(wǎng)絡(luò)銷售中心購買濃度為3mg/ml的氧化石墨烯水溶液。
[0055]2.制作基底芯片(具體過程見圖3):底層為石英玻璃(SiO2)，依次向上鍍有5nm的鈦(Ti)或者鉻(Cr)金屬層，50nm的金膜層。
[0056]3.構(gòu)建石墨烯芯片:石墨烯芯片是通過電泳沉積分別使0.lmg/ml,0.3mg/ml,
0.5mg/ml,0.7mg/ml,0.9mg/ml的氧化石墨烯沉積到基底芯片上，電壓均為150V,時(shí)間20s,(可控制電壓、時(shí)間來決定沉積的氧化石墨烯的量)每個(gè)濃度做3組平行試驗(yàn)。通過SEM/AFM檢測(cè)，篩選出氧化石墨烯沉積分布最均一的濃度，作為制備石墨烯芯片的最適濃度。這里首選0.5mg/ml的氧化石墨烯。
[0057]4.系統(tǒng)自動(dòng)采樣，采樣容量是實(shí)際的樣品量減去30微升，采樣流速一般為5微升/min。采樣成功后，停止采樣，停止掃描，停止柱塞泵，系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)包被Pl探針30-40min(包被前后數(shù)據(jù)圖如圖4)，參考圖4，通過SPR對(duì)石墨烯芯片在0-1162S進(jìn)行連續(xù)掃描，SPR角度值為68015毫度左右；P1探針包被后在1163-6500S對(duì)石墨烯芯片進(jìn)行連續(xù)掃描，SPR角度值為69915毫度左右；6500s之后進(jìn)行的是石墨烯芯片的再生處理，DNA解離后石墨烯芯片連續(xù)掃描的SPR角度值為68000毫度左右。該實(shí)驗(yàn)表明在SPR上Pl探針的包被和解離過程現(xiàn)象十分明顯，可清晰的看見實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)過程。
[0058](二)方法二:巰基化DNA探針P2包被
[0059]1、沒有點(diǎn)樣的金芯片(金芯片UMPH0A600芯片由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供)首先用30%的H202對(duì)新芯片進(jìn)行預(yù)處理，除去雜質(zhì)，并使金膜表面暴露。
[0060]2、在SPR上進(jìn)行P2探針的包被
[0061]P2探針的包被過程同包被方法(一)的步驟4，(包被前后數(shù)據(jù)圖如圖5)，參考圖5，通過SPR對(duì)裸金芯片在0-1162s進(jìn)行連續(xù)掃描，SPR角度值為67082毫度左右；P2探針包被后在1163-6500S對(duì)金芯片進(jìn)行連續(xù)掃描，SPR角度值為67315毫度左右；6500s之后進(jìn)行的是金芯片再生處理，DNA解離后金芯片連續(xù)掃描的SPR角度值為67051毫度左右。該實(shí)驗(yàn)表明在SPR上進(jìn)行P2探針的包被和解離過程現(xiàn)象明顯，可看見實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)過程。
[0062](三)方法三:氨基化DNA探針P3包被
[0063]1、表面為短鏈羧基的芯片(由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供)，該芯片可以偶聯(lián)帶有氨基、巰基、醛基、羥基、羧基的分子。
[0064]2、在SPR上進(jìn)行P3探針的包被
[0065]P3探針的包被過程同包被方法(一)的步驟4，(包被前后數(shù)據(jù)圖如圖6)，參考圖6，通過SPR對(duì)短鏈羧基的芯片在0-1162s進(jìn)行連續(xù)掃描，SPR角度值為67155毫度左右；P3探針包被后在1163-6500S對(duì)金芯片進(jìn)行連續(xù)掃描，SPR角度值為67409毫度左右；6500s之后進(jìn)行的是金芯片再生處理，DNA解離后金芯片連續(xù)掃描的SPR角度值為67152毫度左右。該實(shí)驗(yàn)表明在SPR上進(jìn)行P3探針的包被和解離過程現(xiàn)象明顯，可看見實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)過程。
[0066]以上三種方法均可用 于DNA探針包被，這里我們?yōu)榱嗽龃驞NA探針在SPR上的監(jiān)測(cè)信號(hào)，以納米金修飾DNA探針，所以選擇石墨烯芯片以高效包被DNA探針，確保檢測(cè)的靈敏度。同時(shí)，石墨烯可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號(hào)干擾。
[0067]以下則是選用石墨烯芯片包被DNA探針對(duì)本專利具體實(shí)施方案進(jìn)行說明。
[0068]四、SPR用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)miRNA與DNA探針的雜交
[0069]1、加入50ul含20uM的納米金修飾的DNA探針Pl混合體系，進(jìn)行DNA探針包被；
[0070]2、40min后，加入50 μ I的miRNA21和IU/ μ IDSN酶的混合體系，使其進(jìn)行反應(yīng)；
[0071]3、37攝氏度下反應(yīng)60min，期間采用SPR儀器自動(dòng)采樣并記錄反應(yīng)后的SPR曲線。圖7中SPR角度為68000毫度時(shí)，是石墨烯芯片的角度值；74000毫度時(shí)，是完成了 Pl探針的包被此時(shí)石墨烯芯片的角度值；之后圖中曲線呈不規(guī)則下降，是加入了 miRNA21和DSN酶，雜交和酶切共同作用的動(dòng)態(tài)過程。
[0072]五、SPR檢測(cè)miRNA的條件優(yōu)化
[0073]1、向已經(jīng)包被了固定濃度的Pl探針的石墨烯芯片上，加入50微升0.01nM的miRNA21,檢測(cè)在30min時(shí)SPR角度值，同上步驟加入50微升0.1nM的miRNA21、lnM的miRNA21、IOnM的miRNA21、IOOnM的miRNA21，分別檢測(cè)在30min時(shí)SPR角度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)。參考圖8，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著miRNA21濃度的增加，其與Pl探針雜交的效果呈上升趨勢(shì)。
[0074]2、分別加入50微升30nM的堿基完全匹配、單堿基不匹配、雙堿基不匹配、三堿基不匹配、四堿基不匹配、完全不匹配的靶分子序列，判斷該方法的特異性(附圖9)。參考圖9，該實(shí)驗(yàn)表明，雜交過程中加入的miRNA堿基不匹配，其酶切時(shí)間明顯延長(zhǎng)，結(jié)果明顯受到影響，說明本方法特異性高。
[0075]3、向已經(jīng)包被了固定濃度的Pl探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的miRNA21和IU/μ IDSN酶混合體系，檢測(cè)其酶切完成的時(shí)間，觀察酶切過程。miRNA的濃度分別為 0.03ηΜ(0.01lng)，0.3ηΜ(0.ling)，3ηΜ(1.lng)，30nM(llng)，60nM(22ng).(附圖10)。參考圖10，該實(shí)驗(yàn)說明，在包被了等量的Pl探針石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，隨著加入miRNA21濃度的增加，酶切雜交的時(shí)間將會(huì)縮短。
[0076]4、向已經(jīng)包被了固定濃度的Pl探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的miRNA21和IU/μ IDSN酶混合體系，檢測(cè)其雜交酶切完成的時(shí)間，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。miRNA的濃度分別為0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附圖11)。參考圖11，該實(shí)驗(yàn)說明，在包被了等量的Pl探針石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，隨著加入miRNA21濃度的增加，雜交酶切完全時(shí)間呈下降趨勢(shì)。
[0077]六、定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
[0078]在已經(jīng)包被了固定濃度的Pl探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的miRNA21和IU/ μ IDSN酶混合體系，在60min后，檢測(cè)不同濃度miRNA21的SPR角度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，miRNA21 的濃度分別為 0.0OlnM,0.01nM,0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附圖 12)。參考圖12，在包被了固定濃度的PI探針石墨烯芯片上，當(dāng)反應(yīng)60min后，根據(jù)SPR角度值可定量miRNA21的濃度。[0079]具體實(shí)施方案二 (檢測(cè)痕量RNA):
[0080]一、采用具體實(shí)施方案一所得的雙鏈特異性核酸酶(DSN)最適反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。
[0081]在1.5%瓊脂糖、TBE緩沖液、80V電壓下，電泳30min。(附圖13)M:2000的marker，
1.模板+37°C +未酶切，2.模板+37°C +酶切+1%SDS。參考圖13，通過1.5%瓊脂糖電泳試驗(yàn)對(duì)DSN酶活性驗(yàn)證，每個(gè)泳道的DNA加樣量為200ng ;泳道1-DNA模板在37°C孵育未加DSN酶，泳道2-DNA模板與DSN酶、1%SDS在37 °C共同孵育。
[0082]泳道I在IOObp處可見高亮度的DNA條帶，泳道2在IOObp處僅隱約可見DNA條
帶的痕跡。
[0083]該實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次驗(yàn)證在37°C時(shí)加入1%的SDS’ DSN具有較好的酶切活性。
[0084]二、DNA探針和RNA的合成(由上海生物工程公司合成)
[0085]1.合成RNA:人類胰島素mRNA的部分序列:
[0086]ccugcagccc uuggcccugg aggggucccu gcagaagcgu ggcauugugg aacaaugcug
[0087]uaccagcauc ugcucccucu accagcugga gaacuacugc
[0088]2.合成 RNA 的 DNA 探針 atggtcgtag acgagggaga tggtcgacct,在探針的 5 ‘端加上納米金(Ρ1')。
[0089]三、RNA的DNA探針P1’在石墨烯芯片上的包被同具體實(shí)施方案一的步驟三。(包被前后數(shù)據(jù)圖如圖14)，參考圖14，通過SPR對(duì)石墨烯芯片在0-1162S進(jìn)行連續(xù)掃描，SPR角度值為68500毫度左右；Ρ1'探針包被后在1163-6500S對(duì)石墨烯芯片進(jìn)行連續(xù)掃描，SPR角度值為73000毫度左右；6500s之后進(jìn)行的是石墨烯芯片再生處理，DNA解離后石墨烯芯片連續(xù)掃描的SPR角度值為68450毫度左右。
[0090]該實(shí)驗(yàn)表明在SPR上進(jìn)行Ρ1'探針的包被和解離過程現(xiàn)象十分明顯，可清晰的看見實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)過程。
[0091]四、SPR用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RNA與DNA探針的雜交同具體實(shí)施方案一的步驟四。
[0092]1、加入50ul含20uM的DNA探針混合體系，進(jìn)行P1’探針包被；[0093]2、40min后，加入50 μ I的RNA和IU/ μ IDSN酶的混合體系，使其進(jìn)行反應(yīng)；
[0094]3、37攝氏度下反應(yīng)60min，期間采用SPR儀器自動(dòng)采樣并記錄反應(yīng)后的SPR曲線。圖15中，SPR角度值為68000毫度時(shí)，是石墨烯芯片的角度值；75000毫度時(shí)，是完成了 P1’探針包被此時(shí)石墨烯芯片的角度值；之后圖中曲線呈不規(guī)則下降，是加入了 RNA和DSN酶，雜交和酶切共同作用的動(dòng)態(tài)過程。
[0095]五、SPR檢測(cè)RNA的條件優(yōu)化同具體實(shí)施方案一的步驟五。
[0096]1、向已經(jīng)包被了 ΡI探針的石墨烯芯片上，加入50微升0.01nM的RNA，檢測(cè)在30min時(shí)SPR角度值，同上步驟加入50微升0.1nM的RNA、InM的RNA、IOnM的RNA、IOOnM的RNA，分別檢測(cè)在30min時(shí)SPR角度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖16)。圖16中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著RNA濃度的增加，其與ΡI探針雜交的效果呈上升趨勢(shì)。
[0097]2、分別加入50微升30nM的堿基完全匹配、單堿基不匹配、雙堿基不匹配、三堿基不匹配、四堿基不匹配、五堿基不匹配的靶分子序列，判斷該方法的特異性(附圖17)。圖17中，實(shí)驗(yàn)表明，雜交過程中加入的RNA堿基不匹配，其酶切時(shí)間明顯延長(zhǎng)，結(jié)果明顯受到影響，說明本方法特異性高。
[0098]3、向已經(jīng)包被了固定濃度的ΡI探針石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的RNA和IU/μ IDSN酶混合體系，檢測(cè)其酶切完成的時(shí)間，RNA的濃度分別為0.03nM(0.01lng)，
0.3nM(0.llng)，3nM(l.lng)，30nM(ling)，60nM(22ng)(附圖 18)。參考圖 18，該實(shí)驗(yàn)說明，在包被了等量的ΡI探針石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，隨著加入RNA濃度的增加，酶切雜交的時(shí)間將會(huì)縮短。 [0099]4、向已經(jīng)包被了固定濃度的ΡI探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的RNA和lU/μ IDSN酶混合體系，檢測(cè)其雜交酶切完成的時(shí)間，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。RNA的濃度分別為0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附圖19)。參考圖19，該實(shí)驗(yàn)說明，在包被了等量的ΡI探針石墨烯芯片上，加入等量的DSN酶，隨著加入RNA濃度的增加，雜交酶切完全時(shí)間呈下降趨勢(shì)。
[0100]六、定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制同具體實(shí)施方案一的步驟六。
[0101]在已經(jīng)包被了固定濃度的ΡI探針的石墨烯芯片上，加入50微升不同濃度的RNA和IU/ μ IDSN酶混合體系，在60min后，檢測(cè)不同濃度RNA的SPR角度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，RNA的濃度分別為 0.0OlnM, 0.01nM, 0.1nM, InM, IOnM, IOOnM.(附圖 20)。參考圖 20，在包被了固定濃度的ΡI探針石墨烯芯片上，當(dāng)反應(yīng)60min后，根據(jù)SPR角度值可定量RNA的濃度。
[0102]應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
[0103]
【權(quán)利要求】
1.一種痕量RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: Al、首先進(jìn)行DNA探針在芯片上的包被；包括如下方法:石墨烯系統(tǒng)，純金膜-巰基系統(tǒng)，短鏈羧化物-氨基系統(tǒng)(如常用的鏈酶親和素-生物素)； A2、然后將待檢痕量RNA與預(yù)先包被的DNA探針雜交，再加入DSN酶以降解雜交雙鏈中的DNA，使RNA游離出來與DNA探針雜交，進(jìn)而RNA-DNA復(fù)合物中的DNA繼續(xù)被DSN降解，再次使RNA游離出來，重復(fù)上述過程，可以使體系中所有RNA-DNA復(fù)合物中的DNA均可被DSN酶降解； A3、由于芯片上包被的DNA探針的量與SPR角度值成正相關(guān)，隨著芯片上的DNA探針被逐漸酶切，導(dǎo)致其SPR角度值逐漸改變，利用表面等離子體共振(SPR)平臺(tái)，可觀測(cè)每個(gè)時(shí)刻SPR角度值的變化，其反映了檢測(cè)RNA每個(gè)時(shí)刻的情況，通過該SPR角度值的變化可對(duì)靶分子RNA進(jìn)行快速定量實(shí)時(shí)檢測(cè)；本方法可根據(jù)酶切完全時(shí)間來定量RNA，或者確定某一時(shí)刻根據(jù)相應(yīng)的SPR角度值來定量RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的痕量RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于: Al、為了增大DNA探針在SPR上的監(jiān)測(cè)信號(hào)，以納米金修飾DNA探針； A2、構(gòu)建了石墨稀芯片以聞效包被DNA探針，確保檢測(cè)的靈敏度；同時(shí)，石墨稀可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號(hào)干擾； A3、酶切過程中加入的雙鏈特異性核酸酶(DSN)的反應(yīng)溫度可在20°C -50°C，這里首選，37 °C作為反應(yīng)最適溫度； A4、為了增強(qiáng)DSN酶在 反應(yīng)過 程中的活性，可加入一定濃度SDS，巰基乙醇，或者H2O2水溶液； A5、本方法利用表面等離子體共振( SPR)平臺(tái)，可完成檢測(cè)過程中對(duì)RNA水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882132SQ201410122611
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】羅陽, 邱曉沛, 張洪, 蔣天倫 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院