用于檢測禽流感病毒n9亞型的rt-pcr引物對、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測禽流感病毒N9亞型的RT-PCR引物對、試劑盒及檢測方法，屬于病毒檢測領(lǐng)域，本發(fā)明引物對由兩條引物組成，其中一條引物AIV-N9-F3包含如SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列，另一條引物AIV-N9-R3包含如SEQ?ID?NO：6所示的核苷酸序列。本發(fā)明引物對只針對禽流感的N9亞型具有特異性，本發(fā)明試劑盒具有快速簡便、特異性強、敏感性高、可靠性好、檢測成本低、檢測效率高、假陽性低等特點，適用于禽流感病毒N9亞型的快速檢測，為禽流感病毒N9亞型的疫情監(jiān)測、防控提供強有力的技術(shù)支持，有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】用于檢測禽流感病毒N9亞型的RT-PCR引物對、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，涉及用于檢測禽流感病毒N9亞型的引物對、試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】 [0002]禽流感(avian influenza)是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一種主要流行于雞群中的烈性傳染病。高致病力毒株可致禽類突發(fā)死亡，是國際獸疫局規(guī)定的A類疫病，也能感染人。禽流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae) A型流感病毒屬。根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MP)的不同，流感病毒共分3個型，即A，B和C型，每個型內(nèi)的毒株都有基本相同的NP和MP，也就是說NP和MP具有型特異性。AIV屬A型流感病毒，在正粘病毒屬中A型流感病毒是唯一感染禽類的病毒型。根據(jù)Al V囊膜表面糖蛋白血凝素和神經(jīng)氨酸酶的不同可以分為好多亞型，目前已分離到17種特異的HA抗原(H1-H17)和10種不同的NA抗原(N1-N10)。禽流感不僅嚴(yán)重危害禽類，而且危害哺乳動物，尤其是可感染人并致人死亡，極大的威脅人類公共衛(wèi)生安全。H7N9 (Influenza A virus subtype H7N9)是一種甲型流感病毒，是禽流感病毒的一個亞型，因病毒在鳥類的死亡率低，經(jīng)基因交換后轉(zhuǎn)移到人類上感染后成為病發(fā)期短、重癥率與死亡率均相對于SARS略高而引發(fā)社會注意。H7N9原屬于低致病性病毒，僅在禽間發(fā)現(xiàn)，2013年3月下旬，人類感染甲型流感H7N9病毒的病例被發(fā)現(xiàn)，這是該病毒全球首次感染人類。目前，進行N9亞型分型的主要是神經(jīng)氨酸酶抑制試驗，耗時、麻煩等諸多問題，并且現(xiàn)有技術(shù)中并沒有檢測禽流感病毒N9亞型的RT-PCR檢測試劑盒以及方法，因此，建立一種特異性強、敏感性高、可靠性好的檢查方法意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]根據(jù)上述領(lǐng)域的需求和不足，本發(fā)明提供一種用于檢測禽流感病毒N9亞型的引物對、試劑盒及檢測方法。本發(fā)明所述引物對檢測禽流感病毒N9亞型的特異性強、靈敏度聞。
[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0005]本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向書寫。
[0006]本發(fā)明的一個方面提供一種引物對，所述引物對由兩條引物組成，其中一條引物AIV-N9-F3包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，另一條引物AIV-N9-R3包含如SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列如下:
[0007]5，-GCTGGCCACTATCATCACC-3’ (AIV-N9-F3, SEQ ID NO:3)；
[0008]5’ -TCGTTCCCCGTAACATGA-3’ (AIV-N9-R3, SEQ ID NO:6)。
[0009]本發(fā)明還提供包含上述引物對的組合物。
[0010]此外，本發(fā)明還提供一種用于檢測禽流感病毒N9亞型的試劑盒，其特征在于，包含上述的組合物。
[0011]所述的試劑盒還包含RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、所述的RT-PCR反應(yīng)液由上述的引物對、反應(yīng)緩沖液和dNTPs混合在一起；所述酶混合液由RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶和Taq DNA聚合酶按3:2:10混合在一起。
[0012]所述試劑盒還包含一種X液，所述的X液為一對引物，所述引物對只要滿足可對陽性對照的RNA進行擴增，擴增的片段長度與禽流感病毒N9亞型所檢測的目的基因長度相同即可。
[0013]本發(fā)明中優(yōu)選使用的X液為自行設(shè)計的引物對，其中一條引物包含如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列，另一條引物包含如SEQ ID NO:8所示核苷酸序列。
[0014]本發(fā)明中優(yōu)選使用的X液的上游引物N9UND-F:TGGAGTAGAGTACGCTCAGGC ;下游引物 N9UND-R: CCCAGTCGGTGTCGTTGTCTT
[0015]X液擴增的序列:
[0016]TGGAGTAGAGTACGCTCAGGCTCAGGGAAGTAGCATTAACGAGGATATGGCTGCCGAGCTAAAGCTAACCCCAGCAGCAAGGAGGGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGGGTCTCCGAGGAGACCAGCAGCATAGACATGCCTACTCAACAAGTCGGAGTCCTCACTGGGCTTAGCGAGGGGGGGTCCCAAGCTCTACAAGGCGGATCGAATAGATCGCAAGGGCAACCAGAAGCCGGGGATGGGGAGACCCAATTCCTGGATCGGATGAGAGCGGTAGCAAATAGCATGAGGGAGGCGCCAAACTCTGCACAGGGCACTCCCCAATCGGGGCCTCCCCCAACTCCTGGGCCATCCCAAGATAACGACACCGACTGGG
[0017]上述的試劑盒還包含陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為新城疫耐熱保護劑活疫苗(LaSota株)，經(jīng)滅活后 得到；所述陰性對照為SPF雞胚尿囊液，經(jīng)滅活后得到。
[0018]上述的試劑盒還包含RNA提取試劑和電泳檢測試劑；所述RNA提取試劑為包括裂解液、洗液1、洗液2、70%乙醇、洗脫液(為市售購買分裝)、吸附柱和收集管購買，所述電泳檢測試劑為由50XTAE電泳緩沖液、染色液、上樣緩沖液配制而得。其中50XTAE電泳緩沖液:242g Tris 堿，57.1ml 冰乙酸，100mL0.5mol/L EDTA (Ph8.0)，IL0 染色液(溴化乙錠 IOmg/ml):在100mL水中加入Ig溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時，以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。上樣緩沖液為:0.25% (m/V)溴酚藍，40% Cm/V)蔗糖。本發(fā)明中所用的電泳檢測試劑參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)進行配制的。
[0019]所述的引物對在制備檢測禽流感病毒N9亞型的試劑中的用途。
[0020]一種檢測禽流感病毒N9亞型的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的引物對。
[0021]上述的方法包括如下步驟:
[0022](I)使用權(quán)利要求1所述的引物對形成RT-PCR反應(yīng)液，并與酶混合液形成擴增反應(yīng)體系；
[0023](2)將步驟(1)的擴增反應(yīng)體系在PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)。
[0024](3)將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察檢查結(jié)果。
[0025]本發(fā)明的引物對與申請?zhí)枮镃N201310215954.X(稱為XI)的中國發(fā)明專利所公開的N9上游引物有10個堿基重疊，但二者的反應(yīng)體系不同，本發(fā)明為一步法RT-PCR擴增反應(yīng)，而Xl為兩步法。本發(fā)明一步法RT-PCR的優(yōu)點為:因為在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋，所以本發(fā)明一步法可以在處理大量樣品時易于操作，這樣有助于減少殘余污染；另外，一步法靈敏度更高，最低可以達到0.1pg總RNA，這是因為整個cDNA樣品都被擴增。[0026]本發(fā)明的有益效果
[0027]本發(fā)明引物對具有特異性強、敏感性高的特點，包含本發(fā)明引物對的試劑盒快速簡便、特異性強、敏感性高、可靠性好、檢測成本低、檢測效率高、假陽性低等。本發(fā)明試劑盒可以特異地檢測到N9亞型的禽流感病毒，為禽流感病毒N9亞型疫情的監(jiān)測、防控提供強有力的技術(shù)支持，有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明試劑盒進行RT-PCR檢測特異性擴增圖1
[0029]圖2為本發(fā)明試劑盒進行RT-PCR檢測靈敏度擴增圖2
[0030]圖3為本發(fā)明試劑盒進行RT-PCR檢測敏感性擴增圖3
【具體實施方式】
[0031]提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，并不局限于所述實施方式，不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0032]實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的常規(guī)技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)試劑產(chǎn)品。
[0033]生物材料:
[0034]禽流感病毒H10N9亞型、禽流感病毒H7N9亞型、禽流感病毒H7N2亞型、禽流感病毒H5N3亞型、禽流感病毒H9N2亞型、新城疫病毒，由中國動物疫病預(yù)防控制中心惠贈。
[0035] 申請人:聲明，以上生物材料均在 申請人:實驗室有保存，自申請日起二十年內(nèi)可向公眾發(fā)放用于驗證試驗。
[0036]GoTaqDNA聚合酶(包括RT-PCR反應(yīng)緩沖液)，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑，dNTP，購自promega公司。
[0037]RNeasy Mini Kit購自Qiagen公司，該試劑盒包含裂解液、洗液1、洗液2、70%乙醇、洗脫液等RNA提取試劑。
[0038]本發(fā)明RT-PCR擴增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
[0039]實施例1:特異性引物的篩選試驗
[0040]1.禽流感病 毒N9亞型的引物設(shè)計
[0041]本發(fā)明人設(shè)計了針對禽流感病毒N9亞型的多對RT-PCR擴增引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成。具體序列如表1所示。
[0042]表1.用于禽流感病毒N9亞型RT-PCR篩選的引物
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測禽流感病毒N9亞型的引物對，其特征在于，一條引物包含如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列，另一條引物包含如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列。
2.包含權(quán)利要求1所述引物對的組合物。
3.一種用于檢測禽流感病毒N9亞型的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包含RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液，所述的RT-PCR反應(yīng)液由權(quán)利要求1所述的引物對、反應(yīng)緩沖液和dNTPs混合在一起；所述酶混合液由RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶和Taq DNA聚合酶按3:2:10混合在一起。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其還包含一種X液，所述的X液為一對引物，所述引物對可對陽性對照的RNA進行擴增，擴增的片段長度與禽流感病毒N9亞型所檢測的目的基因長度相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中X液的一條引物包含如SEQID NO:7所示的核苷酸序列，另一條引物包含如SEQ ID NO:8所示核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其還包含陽性對照、陰性對照、RNA提取試劑和電泳檢測試劑，所述陽性對照為新城疫耐熱保護劑活疫苗(LaSota株)，經(jīng)滅活后得到；所述陰性對照為SPF雞胚尿囊液，經(jīng)滅活后得到。
8.權(quán)利要求1所述的引物對在制備檢測禽流感病毒N9亞型的試劑中的用途。
9.一種檢測禽流感病毒N9亞型的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的引物對。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)使用權(quán)利要求1所述的引物對形成RT-PCR反應(yīng)液，并與酶混合液形成擴增反應(yīng)體系; (2)將步驟(1)的擴增反應(yīng)體系在PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)。 (3)將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察檢查結(jié)果。
【文檔編號】C12N15/11GK104017902SQ201410106522
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】孫明, 陳西釗, 喬明明, 馮向輝, 王傳彬, 才學(xué)鵬 申請人:北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司