抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種新型的抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型，可應(yīng)用于人類(lèi)丙型肝炎病毒感染機(jī)制的研究及藥物篩選，它是一種針對(duì)HCV侵染進(jìn)行高效應(yīng)答的報(bào)告系統(tǒng)。當(dāng)HCV侵入細(xì)胞后，其所表達(dá)的蛋白酶NS3/4A將切割并釋放通過(guò)蛋白MAVS錨定于線(xiàn)粒體外膜的四環(huán)素調(diào)控反式激活子rtTA，在強(qiáng)力霉素或四環(huán)素存在的情況下激活報(bào)告基因的表達(dá)，并在一定時(shí)間內(nèi)觀察到明顯的熒光信號(hào)；或在GCV存在時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于HCV侵染的實(shí)時(shí)定量觀測(cè)、流式細(xì)胞分選、高通量化合物篩選、高通量宿主細(xì)胞靶基因篩選以及HCV侵染的分子機(jī)制研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、基因工程和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]HCV (Hepatitis C virus)是一種直到1989年才被首次報(bào)道的肝炎病毒(Choo等，1989)，是一種單鏈RNA病毒，其導(dǎo)致的丙型肝炎是引起人類(lèi)病毒性肝炎的主要原因之一。截止2005年在全球約有3%的人口，超過(guò)1.7億人被丙型肝炎病毒感染。HCV是一種不導(dǎo)致細(xì)胞病變的肝臟的病毒，是黃病毒科的成員，被感染后可能發(fā)生急性肝炎，急性肝炎可被治愈，而另有約70%會(huì)發(fā)展成慢性肝炎，并最終導(dǎo)致肝硬化、肝癌等嚴(yán)重疾病(Hoofnagle等，2002)。目前為止，還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出抗HCV疫苗，而且對(duì)于6個(gè)亞型一直沒(méi)有廣譜高效的藥物。臨床上主要米用PEG-1FN-α和Ribavirin聯(lián)合治療(Fried and Hoofnagle, 1995;McHutchison, Gordon等，1998)，此療法價(jià)格昂貴，并且只對(duì)其中某些亞型具有一定的療效；2012年美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)上市了抑制HCV復(fù)制過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白NS3/4A活性的小分子藥物Telaprevir (VX-950) (Lin, Perni等，2006)和 Boceprevir (SCH503034) (Njoroge, Chen 等，2008),但是它們僅針對(duì)其中基因型I有比較好的療效。[0003]在針對(duì)HCV的研究方面，直到2005年，人類(lèi)才分離出可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中完成整個(gè)生命周期的 HCVcc (Cell culture-derived infectious HCV, HCVcc),從此對(duì)于HCV機(jī)制的研究進(jìn)入了一個(gè)高速發(fā)展的時(shí)期(Cai，Zhang等，2005; He 11 er，Sai to等，2005; Lindenbach, Evans 等，2005; Wakita and Kato, 2006)。但是，因?yàn)?HCV 病毒并無(wú)細(xì)胞毒性，也沒(méi)有明顯的特征，所以就衍生出一系列針對(duì)HCV侵染的報(bào)告系統(tǒng)。因?yàn)樵贖CV的生命周期中，會(huì)首先轉(zhuǎn)錄出一條多蛋白的肽鏈，然后被不同的蛋白酶切開(kāi)變成具有活性的蛋白，而其中最重要的蛋白酶當(dāng)屬HCV自帶的NS3/4A，其能識(shí)別特定氨基酸序列并進(jìn)行切割，于是報(bào)告系統(tǒng)和藥物設(shè)計(jì)主要圍繞NS3/4A展開(kāi)。
[0004]2004年Laura Pacini報(bào)道了一種報(bào)告系統(tǒng)，其是基于SEAP-1,它被插入一段可以被NS3/4A特異識(shí)別的肽段，插入位置在SEAP-1和一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜錨之間，當(dāng)被NS3/4A切開(kāi)，SEAP-1可以被分泌到細(xì)胞周?chē)呐囵B(yǎng)基中(Pacini等，2004)。該系統(tǒng)構(gòu)建原理也是利用了 NS3/4A的活性，不過(guò)其檢測(cè)方法是通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中SEAP-1的活性，檢測(cè)過(guò)程比較復(fù)雜也難以保證精確性。
[0005]2006年Breiman報(bào)道了一個(gè)基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白PERK偶聯(lián)Gal4VP16的報(bào)告系統(tǒng)。PERK蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER上，通過(guò)NS3/4A特異性酶切位點(diǎn)NS5A/5B之間肽段偶聯(lián)Gal4VP16，當(dāng)HCV侵入細(xì)胞并表達(dá)NS3/4A時(shí)，Gal4VP16被釋放，并且啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，報(bào)告基因可以是突光、自殺基因等(Breiman等，2006)。
[0006]2008年第四軍醫(yī)大學(xué)一個(gè)研究組開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于細(xì)胞的指示NS3/4A活性的報(bào)告系統(tǒng)，該系統(tǒng)中將重組的CaSpaSe3 (啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序中其關(guān)鍵作用的酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)中原本的酶切位點(diǎn)改為NS3/4A的特異性酶切位點(diǎn)，這樣當(dāng)細(xì)胞被HCV侵染后，細(xì)胞表達(dá)NS3/4A，剪切Caspase3前體并釋放出有活性的Caspase3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并最終通過(guò)MTT檢驗(yàn)細(xì)胞的存活率(Lei等，2008)。該方法利用了細(xì)胞凋亡機(jī)制，但是其最大的缺陷在于效率過(guò)低，在其實(shí)驗(yàn)中只得到了 45%的死亡率，并且采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法植入系統(tǒng)，不夠穩(wěn)定。
[0007]2009年，Qingxia Han報(bào)道了一組基于對(duì)2a型HCVcc (JFH-1)進(jìn)行改造的報(bào)告系統(tǒng)(Qingxia Han等，2009)。其在HCVcc基因組NS5A的C端插入了 eGFP，從而使得宿主細(xì)胞被改造后的HCVcc侵染后發(fā)出綠色熒光。這套系統(tǒng)讀數(shù)方便，而且可以熒光定量，但是構(gòu)造過(guò)程復(fù)雜，并且只能針對(duì)可以在細(xì)胞體外培養(yǎng)的HCVcc這一種基因型，其他型別的HCV很難嫁接。
[0008]2010年Charles M Rice的研究組報(bào)道了另一個(gè)針對(duì)HCV侵染的報(bào)告系統(tǒng)。因?yàn)镠CV 能夠切割 IPS-I (Seth 等，2005; Xu 等，2005; Meylan 等，2005)，這些蛋白是 NS3/4A 的天然底物，其中IPS-1是定位在線(xiàn)粒體外膜上的蛋白，利用eGFP替換NS3/4A識(shí)別位點(diǎn)N端的部分，構(gòu)建了一套熒光報(bào)告系統(tǒng)。當(dāng)HCV入侵后，NS3/4A表達(dá)可以切割特異性酶切位點(diǎn)，導(dǎo)致eGFP從線(xiàn)粒體外膜上脫落下來(lái)，從點(diǎn)狀聚集變化為彌散在細(xì)胞里(Jones等，2010)。該系統(tǒng)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，也非常有效。但是最大的缺陷在于難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化監(jiān)測(cè)，特別是無(wú)法經(jīng)過(guò)FACS分選，故而難以應(yīng)用于高通量篩選。
[0009]上述方法或存在操作過(guò)程或讀取信息復(fù)雜，或存在應(yīng)答效率不高，很多時(shí)候無(wú)法滿(mǎn)足科學(xué)研究甚至藥物篩選的需要。相較而言，Charles Rice小組研發(fā)的方法相對(duì)操作簡(jiǎn)單，易于觀察，但是其依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白的圖形模式變化(從點(diǎn)狀聚集到彌散)，人為因素及誤差都較大，也難以實(shí)現(xiàn)高通量或自動(dòng)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種新型的抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型及其應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供一種針對(duì)HCV侵染實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)的活細(xì)胞報(bào)告系統(tǒng)，達(dá)到操作簡(jiǎn)單、背景值低、靈敏度高、特異性強(qiáng)的目的，并可以實(shí)現(xiàn)高通量以及自動(dòng)化，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)病毒侵染機(jī)制研究，醫(yī)療診斷及藥物篩選。
[0012]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型，其構(gòu)建方法包括以下步驟:
[0013]I)報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建:以慢病毒包裝質(zhì)粒為骨架，其中至少串聯(lián)連接有兩個(gè)基因表達(dá)盒，一個(gè)基因表達(dá)盒用于表達(dá)rtTA-MAVS融合蛋白，另一個(gè)基因表達(dá)盒用于表達(dá)tight-TRE啟動(dòng)子下游的報(bào)告蛋白，兩個(gè)基因表達(dá)盒之后連接有抗性基因，即構(gòu)建得到報(bào)告質(zhì)粒。
[0014]其中，rtTA為四環(huán)素調(diào)控反式激活子，其編碼基因的核苷酸序列如Seq ID N0.5所示，MAVS為線(xiàn)粒體外膜蛋白，其編碼基因的核苷酸序列如Seq ID N0.6所示，tight-TRE啟動(dòng)子的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示。
[0015]2)采用慢病毒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生含有上述報(bào)告質(zhì)粒的慢病毒，然后侵染HCV宿主細(xì)胞，將侵染的細(xì)胞作為針對(duì)HCV NS3/4A蛋白酶的抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型，向含有上述侵染細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入待篩選的藥物化合物，培養(yǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)報(bào)告蛋白的表達(dá)和/或細(xì)胞的存活情況，來(lái)評(píng)價(jià)該藥物化合物對(duì)丙肝病毒的抑制活性。[0016]前述的篩選模型，步驟I)中所述慢病毒包裝質(zhì)粒為pLentiCMVMCSSBsd，質(zhì)粒全序列如Seq ID N0.9所示。
[0017]前述的篩選模型，步驟I)中用于表達(dá)rtTA-MAVS融合蛋白的基因表達(dá)盒位于SV40啟動(dòng)子下游，且該融合蛋白的C端連有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列IRES (Seq ID N0.7)。
[0018]前述的篩選模型，步驟I)中所述報(bào)告蛋白為mCherry熒光蛋白和自殺基因Delta-tk之間通過(guò)2A序列連接。其中，自殺基因Delta-tk的核苷酸序列如Seq ID N0.2所示,2A序列如Seq ID N0.3所示,編碼突光蛋白mCherry的核苷酸序列如Seq ID N0.4所示。[0019]前述的篩選模型，步驟I)中所述抗性基因優(yōu)選為殺稻瘟菌素抗性基因。
[0020]前述的篩選模型，步驟I)中構(gòu)建得到的報(bào)告質(zhì)粒為pLent1-TK-mCherry-rtTA-MAVS,其核苷酸序列如 Seq ID N0.8 所不。
[0021]前述的篩選模型，步驟2)中所述HCV宿主細(xì)胞為Huh7.5細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞所使用的培養(yǎng)基為DMEM，其中還含有10%FBS、I XNEAA、I X青霉素鏈霉素雙抗溶液和2 μ g/ml強(qiáng)力霉素，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 °C，5%C02。
[0022]前述的篩選模型，步驟2)中使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)報(bào)告蛋白的表達(dá)和/或細(xì)胞的存活情況。
[0023]本發(fā)明還提供所述篩選模型在抗丙肝病毒藥物高通量篩選中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明還提供所述篩選模型在研究HCV侵染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制中的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明利用HCV表達(dá)產(chǎn)生的NS3/4A對(duì)于定位于線(xiàn)粒體外膜蛋白MAVS上一段特異性氨基酸序列具有切割活性，將tight-TRE啟動(dòng)子所需要的轉(zhuǎn)錄因子rtTA通過(guò)該識(shí)別切割序列連接在MAVS的N端，從而確保了 rtTA與啟動(dòng)子的空間分離。而tight-TRE啟動(dòng)子后連接了報(bào)告基因，該報(bào)告基因可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，采用常規(guī)分子克隆的基本方法進(jìn)行調(diào)整，并可以通過(guò)2A序列串聯(lián)多個(gè)報(bào)告基因。當(dāng)HCV侵入細(xì)胞并表達(dá)產(chǎn)生NS3/4A，其特異性的識(shí)別位于線(xiàn)粒體外膜的MAVS融合蛋白上的切割序列，從而切割并釋放rtTA。在培養(yǎng)基中存在強(qiáng)力霉素(Doxycycline)的情況下，報(bào)告基因表達(dá)。涉及系統(tǒng)的所有分子生物元件通過(guò)慢病毒(Ientivirus)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，并利用該轉(zhuǎn)入方式將所有功能序列整合入細(xì)胞。
[0026]本發(fā)明將熒光蛋白mCherry和自殺基因HSV_tk的變種Delta-tk作為雙報(bào)告基因，兩個(gè)蛋白采用2A序列連接，并整體插入啟動(dòng)子之后，確保報(bào)告基因等量表達(dá)。而功能序列中還包含SV40啟動(dòng)子，其后插入了 rtTA-MAVS融合蛋白序列，然后通過(guò)IRES串聯(lián)殺稻瘟菌素(Blasticidin, Bsd)抗性基因用于篩選成功植入功能序列的細(xì)胞。
[0027]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“HCV”為丙型肝炎病毒(h印atitis C virus)。
[0028]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“NS3/4A”為丙型肝炎病毒基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的蛋白酶名稱(chēng)，其在病毒正常生命周期起關(guān)鍵作用。
[0029]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“線(xiàn)粒體外膜蛋白MAVS”是一種正常生理狀態(tài)下嚴(yán)格將C端錨定于細(xì)胞器線(xiàn)粒體外膜的蛋白，MAVS是其蛋白名稱(chēng)，在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中不游離分布。它是NS3/4A的天然受體，其中第462-540位氨基酸包含NS3/4A識(shí)別切割序列。
[0030]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“tight-TRE啟動(dòng)子”是一種tet-οη型啟動(dòng)子，即轉(zhuǎn)錄因子rtTA和強(qiáng)力霉素的共同作用下啟動(dòng)下游蛋白的表達(dá)，缺一不可。
[0031]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“rtTA”為tight-TRE啟動(dòng)子所需轉(zhuǎn)錄因子。[0032]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“強(qiáng)力霉素(Doxycycline)”是一種四環(huán)素類(lèi)抗生素藥物。
[0033]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“2A”是具有自剪切活性的一段包含21個(gè)氨基酸的多肽，來(lái)自于病毒 porcine teschovirus-1。
[0034]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“慢病毒(lentivirus)”是一種常用的分子生物學(xué)工具，可用于將所需要的DNA序列隨機(jī)插入宿主細(xì)胞的基因組中。所需要傳遞的DNA序列需要克隆在特定的一類(lèi)質(zhì)粒上。
[0035]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“熒光蛋白”是一種報(bào)告基因編碼的蛋白，表達(dá)出的該蛋白在特定激發(fā)光激發(fā)下，可以發(fā)出特定波長(zhǎng)的熒光。
[0036]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“mCherry”是突光蛋白的一種,激發(fā)光峰值587nm,發(fā)射光峰值610nmo
[0037]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“Delta-tk”是自殺基因中的一種，來(lái)源于單純性孢疹病毒胸苷激酶(Herpes Simplex Virus Thimidine Kinase,HSV-tk),是經(jīng)過(guò)修改的變種，具有更高的生物學(xué)活性。其可將正常狀態(tài)下無(wú)毒的化合物更昔洛韋(Gancil0vir，GCV)磷酸化，磷酸化后的GCV對(duì)細(xì)胞有毒，可以高效殺死細(xì)胞。
[0038]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“SV40啟動(dòng)子”是一種常用的啟動(dòng)子，其特性是可以持續(xù)性的轉(zhuǎn)錄連接在其下游的基因序列。
[0039]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“IRES”是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(Internal ribosome entrysite)的縮寫(xiě)，是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA內(nèi)部一段功能序列，可以啟動(dòng)其下游RNA序列的翻譯。用IRES連接的兩個(gè)基因，其下游基因表達(dá)量相較于上游會(huì)衰減。
[0040]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“殺稻瘟菌素”是一種真核細(xì)胞抗生素，Blasticidin簡(jiǎn)稱(chēng)BSD，生物學(xué)研究中通常用于殺死不含抗性基因的真核細(xì)胞。
[0041]本發(fā)明通過(guò)常用分子克隆手段將以上元件按照特定順序克隆于pLentiCMVMCSSBsd質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。然后采用標(biāo)準(zhǔn)慢病毒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生慢病毒，并侵染HCV宿主細(xì)胞，然后采用BSD進(jìn)行篩選，挑選出單克隆細(xì)胞系。植入該系統(tǒng)的細(xì)胞系即可用于HCV侵染的檢測(cè)，原理示意圖如圖2所示。
[0042]當(dāng)含有上述報(bào)告系統(tǒng)的宿主細(xì)胞Huh7.5培養(yǎng)基中含有HCVcc時(shí)，HCVcc會(huì)侵入細(xì)胞并表達(dá)NS3/4A蛋白酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有強(qiáng)力霉素時(shí)，被侵染細(xì)胞會(huì)在72小時(shí)以?xún)?nèi)發(fā)出mCherry紅色熒光，在普通熒光顯微鏡下采用激發(fā)光光譜范圍內(nèi)的激光激發(fā)下可以觀察到紅色熒光，而同時(shí)此活動(dòng)受到強(qiáng)力霉素存在與否的嚴(yán)格調(diào)控，如圖3所示。當(dāng)向培養(yǎng)基中加入更昔洛韋(2 μ g/ml)，120小時(shí)后可以觀察到明顯的細(xì)胞死亡，如圖4所示。
[0043]含有上述報(bào)告系統(tǒng)的宿主細(xì)胞可以應(yīng)用于藥物篩選，當(dāng)藥物可以抑制HCV入胞并成功表達(dá)出NS3/4A，其切割并釋放rtTA之前的任何一步生理活動(dòng)，都可以通過(guò)報(bào)告基因的信號(hào)找到特定的化合物。為此，發(fā)明人特地選取了 NS3/4A的特異性抑制劑VX-950(Telaprivir)，當(dāng)培養(yǎng)基中VX-950的濃度不斷提高時(shí)，可以明顯看到發(fā)出紅色熒光的細(xì)胞比例減少，直至完全被抑制，如圖5所示。
[0044]本發(fā)明基于熒光信號(hào)作用機(jī)理，可應(yīng)用于流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，并通過(guò)分選實(shí)現(xiàn)遺傳篩選，而且其靈敏性、穩(wěn)定性和效率都足以保證將HCV侵染應(yīng)答的假陰性率控制在4%以?xún)?nèi)，如圖6所示。如果將病毒濃度按照一定梯度逐級(jí)稀釋?zhuān)谇秩?2小時(shí)后可通過(guò)流式細(xì)胞儀分析發(fā)出mCherry熒光的細(xì)胞的比例，其數(shù)值與病毒濃度呈嚴(yán)格線(xiàn)性正相關(guān)，如圖7所示。同時(shí)，從圖7可以看出，在病毒滴度在102個(gè)/ml量級(jí)就已經(jīng)可以明顯監(jiān)測(cè)到數(shù)據(jù)變化，體現(xiàn)了系統(tǒng)的高度靈敏性，由此可應(yīng)用于臨床監(jiān)測(cè)。
[0045]本發(fā)明提供的高通量篩選模型可應(yīng)用于人類(lèi)丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)感染機(jī)制的研究及藥物篩選，是一種針對(duì)HCV侵染進(jìn)行高效應(yīng)答的報(bào)告系統(tǒng)。當(dāng)HCV侵入細(xì)胞后，其所表達(dá)的蛋白酶NS3/4A將切割并釋放通過(guò)蛋白MAVS錨定于線(xiàn)粒體外膜的四環(huán)素調(diào)控反式激活子rtTA，在強(qiáng)力霉素或四環(huán)素存在的情況下激活報(bào)告基因的表達(dá)，并在一定時(shí)間內(nèi)觀察到明顯的熒光信號(hào)；或在GCV存在時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于HCV侵染的實(shí)時(shí)定量觀測(cè)、流式細(xì)胞分選、高通量化合物篩選、高通量宿主細(xì)胞靶基因篩選以及HCV侵染的分子機(jī)制研究。
[0046]本發(fā)明中僅提供了激發(fā)兩種信號(hào)的基本使用方法，一種是熒光信號(hào)，一種是死亡信號(hào)。其他基于此功能的應(yīng)用都可在此基本使用方法基礎(chǔ)上衍生。
[0047]1、通過(guò)熒光定性驗(yàn)證HCVcc的侵染
[0048](1)需要研究的細(xì)胞系通過(guò)上述構(gòu)建方法植入報(bào)告系統(tǒng)，并挑選出性能良好的單克隆細(xì)胞株；如果涉及到指定基因的過(guò)表達(dá)、基因干涉(RNAi)或基因敲除，也可以在已構(gòu)建野生型細(xì)胞株的基礎(chǔ)上進(jìn)一步操作；以HCV領(lǐng)域研究常用的宿主細(xì)胞系Huh7.5為例。
[0049](2)細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要提前培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)板上，要求細(xì)胞正常貼壁，狀態(tài)良好。培養(yǎng)基為 DMEM (Life Technologies)、10%FBS (Thermo Scientific)、I XNEAA (LifeTechnologies)并包含 IX 的雙抗(penicillin-streptomycin),細(xì)胞在 37°C, 二氧化碳濃度5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0050](3)在培養(yǎng)基中加入強(qiáng)力霉素，終濃度為2μ g/ml，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入適量含有HCVcc病毒的培養(yǎng)基，在正常培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，如果中途需要更新培養(yǎng)基，消化傳代都可在24小時(shí)后正常操作，但要確保強(qiáng)力霉素的濃度。
[0051](4)72小時(shí)后可以在顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長(zhǎng)參考mCherry激發(fā)光光譜。
[0052]2、通過(guò)細(xì)胞死亡與否驗(yàn)證HCVcc入侵
[0053]培養(yǎng)環(huán)境與侵染與上述(I)- (2)相同，只是需要在(3)中同時(shí)加入2μ g/ml的更昔洛韋，并在其后的所有操作中維持該濃度。120小時(shí)后可觀察到明顯的死亡信號(hào)。
[0054]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0055](一)本發(fā)明原理簡(jiǎn)單明確，充分考察了丙型肝炎病毒HCV的生理特性以及宿主細(xì)胞的天然受體(該受體對(duì)多種亞型的HCV病毒株敏感)，提供一種基于宿主細(xì)胞的報(bào)告系統(tǒng)，該系統(tǒng)的構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單易行，而且NS3/4A是HCV最核心的功能蛋白，進(jìn)化上具有保守性，理論上可針對(duì)各種亞型的HCV，相較于通過(guò)對(duì)HCV病毒基因組的改造實(shí)現(xiàn)應(yīng)答更加簡(jiǎn)單方便。
[0056](二)本發(fā)明對(duì)丙型肝炎病毒的監(jiān)測(cè)信號(hào)明顯，現(xiàn)有的報(bào)告系統(tǒng)只是有或無(wú)的顯著差別，而非程度的差別或圖形的變化。
[0057](三)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單易行，實(shí)驗(yàn)周期短，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作人的經(jīng)驗(yàn)沒(méi)有過(guò)高的要求，可在72小時(shí)觀察到明顯的信號(hào)。
[0058](四)本發(fā)明對(duì)HCV侵染具有高度的靈敏性，當(dāng)培養(yǎng)基中HCV的滴度低達(dá)IO2個(gè)/ml量級(jí)時(shí)，即可在流式細(xì)胞儀分析中觀察到明顯的變化，因此可用于臨床診斷。
[0059](五)本發(fā)明可適用于流式細(xì)胞儀分析、分選，具備實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化篩選的性能要求。[0060](六)本發(fā)明對(duì)于HCV侵染單一因素的因果關(guān)系要求嚴(yán)格，不同實(shí)驗(yàn)組中陽(yáng)性率與病毒滴度嚴(yán)格線(xiàn)性正相關(guān)，R2=0.99517。
[0061](七)本發(fā)明提供的高通量篩選模型穩(wěn)定性強(qiáng)、效率高，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析可最高達(dá)近到97%的陽(yáng)性率，從而大大降低了高通量自動(dòng)化遺傳篩選的假陰性率。
[0062](八)本發(fā)明可應(yīng)用于藥物的規(guī)?；Y選，通過(guò)機(jī)器讀取熒光或死亡信號(hào)的有無(wú)來(lái)鎖定具有潛在臨床價(jià)值的化合物。
[0063] (九)本發(fā)明再開(kāi)發(fā)性強(qiáng)，可基于基本功能衍生出多種應(yīng)用。
[0064](十)本發(fā)明具有高度的移植性，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要通過(guò)簡(jiǎn)單的分子克隆方法替換為其他的報(bào)告基因。
[0065](十一)可根據(jù)研究需要，用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法改變NS3/4A識(shí)別位點(diǎn)，為不同亞型的HCV研究提供便利，并可用于篩選或驗(yàn)證新的NS3/4A識(shí)別位點(diǎn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0066]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建的報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒圖譜。質(zhì)粒骨架為慢病毒包裝質(zhì)粒，可用于包裝慢病毒，并將兩個(gè)LTR之間的部分隨機(jī)插入細(xì)胞基因組。功能部分主要包括tight-TRE啟動(dòng)子啟動(dòng)的報(bào)告基因Delta-tk和mCherry, 二者通過(guò)2A序列連接；另一部分是SV40啟動(dòng)子啟動(dòng)的rtTA-MAVS (C)融合蛋白，并通過(guò)IRES連接BSD抗性基因。
[0067]圖2為本發(fā)明報(bào)告系統(tǒng)的工作原理示意圖。當(dāng)報(bào)告系統(tǒng)轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，持續(xù)的表達(dá)產(chǎn)生定位于線(xiàn)粒體外膜的rtTA-MAV(C)融合蛋白，rtTA此時(shí)被錨定在線(xiàn)粒體上。當(dāng)HCV入侵細(xì)胞并表達(dá)了 NS3/4A，其識(shí)別并剪切MAVS上的識(shí)別序列，釋放游離的rtTA，在強(qiáng)力霉素Dox存在時(shí)，共同激活tight-TRE(Ptight)啟動(dòng)子，啟動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá)。2A肽段發(fā)生自剪切，產(chǎn)生等量的mCherry和Delta-tk蛋白。此時(shí)可以直接觀察mCherry紅色突光或利用其進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析；而Delta-tk并無(wú)毒性，當(dāng)加入無(wú)毒化合物更昔洛韋(GCV)后，GCV被Delta-tk磷酸化并具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
[0068]圖3為本發(fā)明系統(tǒng)報(bào)告基因mCherry對(duì)HCVcc入侵進(jìn)行應(yīng)答。當(dāng)細(xì)胞被丙型肝炎病毒HCVcc侵染72小時(shí),且培養(yǎng)環(huán)境中含有Doxycycline時(shí),mCherry紅色突光被激活,而且信號(hào)受到tight-TRE啟動(dòng)子的嚴(yán)格調(diào)控，缺少其中任何一個(gè)因素，都將無(wú)法激活信號(hào)。比例尺:200 μ m。
[0069]圖4為本發(fā)明系統(tǒng)報(bào)告基因Delta-tk在GCV存在時(shí)對(duì)HCVcc的入侵應(yīng)答。當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中同時(shí)加入了更昔洛韋(GCV，2 μ g/ml)，HCVcc侵染120小時(shí)后，可以看出明顯的細(xì)胞死亡，并且死亡信號(hào)受到HCVcc、Doxycycline和GCV三重因素的嚴(yán)格調(diào)控。比例尺:200 μ m。
[0070]圖5表示NS3/4A抑制劑可明顯抑制本發(fā)明報(bào)告系統(tǒng)對(duì)HCVcc信號(hào)的應(yīng)答。熒光信號(hào)隨NS3/4A抑制物VX-950濃度的提高而不斷衰減。圖中從左到右VX950濃度不斷增高，濃度為OnM的用DMSO代替，可以明顯看出從200nM開(kāi)始紅色熒光明顯減弱，到500nM的濃度紅色熒光幾乎完全抑制。比例尺:200 μ m。
[0071]圖6表示本發(fā)明的報(bào)告系統(tǒng)可應(yīng)用于流式細(xì)胞儀分選并對(duì)不同HCVcc病毒滴度得到的陽(yáng)性率。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析不同HCVcc病毒滴度下的陽(yáng)性率，縱坐標(biāo)為細(xì)胞個(gè)數(shù)，橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。左圖為未用HCVcc侵染的對(duì)照組，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，劃定閾值；中圖為病毒滴度為1.1967X 104FFU/ml時(shí)，細(xì)胞中相當(dāng)一部分越過(guò)了閾值，即為顯示紅色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞樣本；右圖為當(dāng)病毒滴度達(dá)到1.077X 105FFU/ml時(shí)，已有96.8%的細(xì)胞顯示紅色熒光。
[0072]圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中將病毒滴度按照一定梯度逐級(jí)稀釋?zhuān)瑢?duì)應(yīng)得到的陽(yáng)性率分別按照指數(shù)坐標(biāo)和線(xiàn)性坐標(biāo)作圖。將不同HCVcc滴度濃度梯度與對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性率作圖并擬合曲線(xiàn)，縱坐標(biāo)為陽(yáng)性率，橫坐標(biāo)為HCVcc病毒滴度，a圖采用指數(shù)坐標(biāo)，b圖采用線(xiàn)性坐標(biāo)。從a圖中可以明顯看出當(dāng)?shù)味冗_(dá)到405FFU/ml時(shí)，曲線(xiàn)開(kāi)始上揚(yáng),達(dá)到1215FFU/ml時(shí)已接近拐點(diǎn)，說(shuō)明系統(tǒng)對(duì)HCVcc的敏感性很高；Wb圖可見(jiàn)陽(yáng)性率與病毒滴度存在顯著的線(xiàn)性正相關(guān)，說(shuō)明系統(tǒng)對(duì)于NS3/4A這一影響因子因果關(guān)系的嚴(yán)謹(jǐn)性和穩(wěn)定性。
[0073]圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中采用TALEN基因敲除技術(shù)敲除CLDN1、OCLN兩個(gè)基因。
a.針對(duì)CLDNl設(shè)計(jì)的一對(duì)TALEN分別針對(duì)的序列；b.測(cè)序結(jié)果表明插入31bp，造成移碼突變；c.針對(duì)OCLN設(shè)計(jì)的一對(duì)TALEN分別針對(duì)的序列；d.發(fā)生了 17bp的缺失，造成移碼突變。
[0074] 圖9表示本發(fā)明實(shí)施例4中CLDN1、OCLN基因敲除可以完全抑制HCVcc的cell-free入胞過(guò)程。a.將野生型細(xì)胞(CLDN+/+)與CLDN1+XLDN1+/CLDN1分別平鋪于12孔板中，HCVcc侵染72小時(shí)后，CLDNl敲除細(xì)胞系完全抑制了紅色熒光，而當(dāng)外源回補(bǔ)表達(dá)了該蛋白，紅色熒光又重新出現(xiàn)；b.有關(guān)OCLN也得到同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。比例尺:100μπι。
[0075]圖10為本發(fā)明實(shí)施例5中用于檢測(cè)HCVcc通過(guò)cell-to-cell transmission方式傳播的原理。綠色標(biāo)記的為預(yù)先36小時(shí)用HCVcc侵染的donor細(xì)胞，將其與帶有報(bào)告系統(tǒng)的待檢測(cè)細(xì)胞混合。如果E2蛋白被抗體封閉或因相關(guān)基因的敲除可以阻斷cell-free傳播途徑，與donor細(xì)胞接觸的帶有報(bào)告系統(tǒng)的細(xì)胞可能會(huì)通過(guò)cell-to-cell transmission的方式被HCVcc侵染并發(fā)出紅色熒光。
[0076]圖11表示本發(fā)明實(shí)施例5中CLDNl敲除可以完全抑制HCVcc的細(xì)胞間傳遞，而OCLN在這一過(guò)程中并非必須。利用報(bào)告系統(tǒng)通過(guò)Transmission assay研究CLDNl、0CLN在HCV通過(guò)cell-to-cell transmission傳播的作用。提前36小時(shí)用HCVcc (HCVcc基因組經(jīng)過(guò)改造，有綠色熒光標(biāo)記以便觀察)對(duì)“donor”細(xì)胞進(jìn)行侵染，然后與各細(xì)胞系混合并繼續(xù)培養(yǎng)，72小時(shí)后觀察。左圖標(biāo)“一”的為“donor”細(xì)胞，沒(méi)有與其他細(xì)胞混合；從中、右兩圖可以明顯看出，CLDNl-/-中可以完全沒(méi)有發(fā)出紅色熒光，也就是說(shuō)CLDNl的敲除完全阻斷了 HCV通過(guò)cell-to-cell transmission的方式在細(xì)胞間傳播,而OCIifA中依然可以進(jìn)行。比例尺:100 μ m。
[0077]圖12為本發(fā)明實(shí)施例1中pLentiCMVMCSSBsd質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0078]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0079]實(shí)施例1抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型及其構(gòu)建方法
[0080]1、報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0081]以質(zhì)粒pLentiCMVMCSSBsd作為骨架，質(zhì)粒圖譜如圖12所示，質(zhì)粒全序列如Seq IDN0.9所示。[0082]克隆分為兩步:
[0083]第一步:Delta_tk、2A、mCherry報(bào)告基因模塊分別對(duì)應(yīng)于表1中引物1_6，采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，基因模板由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏文勝實(shí)驗(yàn)室?guī)齑?。然后分別采用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切，順次裝載入pEN_TTmcS質(zhì)粒tight-TRE啟動(dòng)子后的多克隆位點(diǎn)。由此得到完整的從tight-TRE到mCherry (包含終止密碼子)的完整序列。
[0084]然后，將pLentiCMVMCSSBsd質(zhì)粒自帶的CMV啟動(dòng)子用限制性?xún)?nèi)切酶ClaI和BamHI切掉，切膠回收質(zhì)粒主體部分；同時(shí)用表1中引物7和8擴(kuò)增tightTRE-DeItaTK-2A-mCherry完整序列并分別用ClaI和BglII進(jìn)行酶切并回收片段。最后將片段插入PLenti的ClaI和BamHI兩酶切位點(diǎn)之間。轉(zhuǎn)化此連接產(chǎn)物至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂平板，篩選單克隆，測(cè)序驗(yàn)證插入序列正確。
[0085]第二步按照類(lèi)似思路，利用表1中引物9-12，分別進(jìn)行PCR獲得rtTA和MAVS(C)序列，分別采用對(duì)應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶將目的片段順次連接入質(zhì)粒PCDNA6HASIRESPUR0(質(zhì)粒序列如Seq ID N0.10所示)，由此在該質(zhì)粒上得到rtTA-MAVS (C)-1RES完整片段。隨后以此完整片段為模板，用表1中引物13和14進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化產(chǎn)物并用XhoI進(jìn)行酶切并回收酶切片段。同時(shí)將第一步得到的中間產(chǎn)物質(zhì)粒用XhoI單酶切并去磷酸化，得到含有XhoI限制性?xún)?nèi)切酶粘性末端的開(kāi)環(huán)質(zhì)粒。最后將帶有XhoI粘性末端的rtTA-MAVS (C)-1RES插入上述開(kāi)環(huán)質(zhì)粒粘性末端之間。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5ci感受態(tài)細(xì)胞中，并涂平板，篩選單克隆，測(cè)序驗(yàn)證插入序列正確。
[0086]得到包含正確序列插入片段的菌株后，保存菌株并擴(kuò)增，得到報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒(圖1)。
[0087]表1報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建中涉及的引物序列(5' -3')
[0088]
【權(quán)利要求】
1.抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型，其特征在于，其構(gòu)建方法包括以下步驟: 1)報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建:以慢病毒包裝質(zhì)粒為骨架，其中至少串聯(lián)連接有兩個(gè)基因表達(dá)盒，一個(gè)基因表達(dá)盒用于表達(dá)rtTA-MAVS融合蛋白，另一個(gè)基因表達(dá)盒用于表達(dá)tight_TRE啟動(dòng)子下游的報(bào)告蛋白，兩個(gè)基因表達(dá)盒之后連接有抗性基因，即構(gòu)建得到報(bào)告質(zhì)粒； 其中，rtTA為四環(huán)素調(diào)控反式激活子，MAVS為線(xiàn)粒體外膜蛋白； 2)采用慢病毒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生含有上述報(bào)告質(zhì)粒的慢病毒，然后侵染HCV宿主細(xì)胞，將侵染的細(xì)胞作為針對(duì)HCV NS3/4A蛋白酶的抗丙肝病毒藥物高通量篩選模型，向含有上述侵染細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入待篩選的藥物化合物，培養(yǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)報(bào)告蛋白的表達(dá)和/或細(xì)胞的存活情況，來(lái)評(píng)價(jià)該藥物化合物對(duì)丙肝病毒的抑制活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選模型，其特征在于，步驟I)中所述慢病毒包裝質(zhì)粒為pLentiCMVMCSSBsd，序列如 Seq ID N0.9 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選模型，其特征在于，步驟I)中用于表達(dá)rtTA-MAVS融合蛋白的基因表達(dá)盒位于SV40啟動(dòng)子下游，且該融合蛋白的C端連有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列 IRES0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選模型，其特征在于，步驟I)中所述報(bào)告蛋白為mCherry熒光蛋白和自殺基因Delta-tk之間通過(guò)2A序列連接； 其中，自殺基因Delta-tk的核苷酸序列如Seq ID N0.2所示，2A序列如Seq IDN0.3所/Jn ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選模型，其特征在于，步驟I)中所述抗性基因?yàn)闅⒌疚辆乜剐曰颉
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的篩選模型，其特征在于，步驟I)中構(gòu)建得到的報(bào)告質(zhì)粒為 pLent1-TK-mCherry-rtTA-MAVS,其核苷酸序列如 Seq ID N0.8 所不。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選模型，其特征在于，步驟2)中所述HCV宿主細(xì)胞為Huh7.5細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞所使用的培養(yǎng)基為DMEM，其中還含有10%FBS、I XNEAA、I X青霉素鏈霉素雙抗溶液和2 μ g/ml強(qiáng)力霉素，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37°C，5%C02。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選模型，其特征在于，步驟2)中使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)報(bào)告蛋白的表達(dá)和/或細(xì)胞的存活情況。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的篩選模型在抗丙肝病毒藥物高通量篩選中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的篩選模型在研究HCV侵染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103881979SQ201410106330
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】魏文勝, 任慶鵬, 李嬋 申請(qǐng)人:北京大學(xué)