用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體和細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組載體和重組細胞，具體涉及一種用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體以及包含該重組載體的重組細胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細胞在二惡英類物質(zhì)生物檢測方面的用途。
【專利說明】用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體和細胞
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體和重組細胞，具體涉及一種用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體以及包含該重組載體的重組細胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細胞在二惡英類物質(zhì)生物檢測方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境污染問題一直伴隨著人類社會的發(fā)展進程而日益復(fù)雜化及多樣化，這使得環(huán)境污染對人類的健康所帶來的負面影響也日益嚴重。世界衛(wèi)生組織(WHO)在其《2004年世界衛(wèi)生報告》中指出在全球范圍內(nèi)估計24%的疾病負擔(dān)(健康壽命年損失)和23%的所有死亡(早逝)可歸因于環(huán)境因素，而其中最主要的因素之一就是日益加劇的化學(xué)污染物。在眾多的化學(xué)污染物中，持久性有機污染物(POPs)因為其自身的物化特性和對人類健康的嚴重威脅受到全球極大的重視。
[0003]二惡英類化合物(Dioxins)是一類典型的持久性有機污染物，也是斯德哥爾摩公約中首批被列入對人類健康和生態(tài)環(huán)境有害的持久性有機污染物。國際癌癥研究中心已將其列為人類一級致癌物。持久性有機污染物(POPs)具有生物蓄積性、半揮發(fā)性和持久性等特點(Vallack etal., 1998; Jonesand de Voogt, 1999)。151 個國家的政府簽署的斯德哥爾摩公約“關(guān)于持久性有機污染物”，旨在消除或控制至少12種持久性有機污染物(環(huán)境署，2006年)。根據(jù)本公約，建立持久性有機污染物的排放清單是強制性的，這為進一步減少排放量奠定基礎(chǔ)。因此，在環(huán)境中持久性有機污染物監(jiān)測是重要的第一步(WH0，1999)。其中，持久性有機污染物，多氯二苯并二惡英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)和多氯聯(lián)苯(PCBs)，即所謂的“二惡英類化合物”，是目前公開的監(jiān)管和科學(xué)關(guān)注對象，因為這些化合物具有廣泛的毒性效應(yīng)，包括免疫毒性、發(fā)育毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和致癌性(Kerkvliet，1995;Brouwer, 1991;Neb ert et al.，1993)。
[0004]高分辨率氣相色譜/質(zhì)譜被認為是分析二惡英類物質(zhì)的黃金標準方法。高分辨液相質(zhì)譜連用具有靈敏度高、結(jié)果準確等優(yōu)點，但是檢測費用相當高昂，并且檢測周期長，需要樣品量大，使其在環(huán)境、食品和衛(wèi)生等領(lǐng)域開展二惡英類化合物污染狀況篩查中的應(yīng)用受到一定限制。另外，由于化學(xué)分析僅限于17種二惡英/呋喃的風(fēng)險評估，而對其他的有毒多鹵代芳香烴化合物(PHAHs)，包括氟化、溴代和混合鹵化二惡英/呋喃以及偶氮、氧化偶氮化合物、聯(lián)苯醚、萘、硫類似物等二氧芑類物質(zhì)和烷基化的二氧芑類物質(zhì)則不能指示。此外，化學(xué)方法會忽略二惡英類化合物潛在的協(xié)同或拮抗作用。在環(huán)境中，二惡英類化合物共存的復(fù)雜性以及各種同系物的混合物和多級二惡英類化合物之間的相互作用可以調(diào)節(jié)他們的潛在毒性。大量的研究表明二惡英類化合物和非添加劑之間的相互作用(Davis andSafe, 1990; Harper et al., 1995)。因此,化學(xué)分析既不高通量監(jiān)測環(huán)境二惡英類化合物也不適合生物毒性的預(yù)測，急需要快速而廉價的生物檢測方法。
[0005]為了克服化學(xué)分析方法的限制，國際上已經(jīng)開發(fā)出各種生物檢測法，主要包括:EROD (ethoxyresorufin-O-deethylas)、ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay)和 CALUX (chemical-activatedluc if erase expression)。這些生物測定的方法是根據(jù)多項研究成果(Nebert et al., 1993; Lucieret al., 1993; Safe, 1990; SchmidtandBradfield, 1996)。二惡英類化合物的毒性是通過芳香烴受體(AHR)配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的(Nie et al.，2001)。目前二惡英類化合物結(jié)合芳香烴后，芳香烴受體復(fù)合物進行變構(gòu)和AHR核轉(zhuǎn)運蛋白(ARNT) 二聚合相互作用。這種異源性的配體復(fù)合物(AhR-Arnt)結(jié)合到基因啟動區(qū)的二惡英反應(yīng)元件(DRE)上，DRE序列的結(jié)合導(dǎo)致DNA彎曲、干擾染色質(zhì)和和核小體，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄。隨后，P4501A1蛋白合成增加并誘導(dǎo)P4501A1酶活性增加，然后產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)和毒性效應(yīng)。因此，分析P4501A1依賴的EROD酶活性變化可以指示外源物質(zhì)的影響。但是，EROD法靈敏度低，限制了其應(yīng)用范圍。ELISA法有很好的特異性，然而該方法不能反映樣品的總毒性當量，而且檢測過程都需要大量而且昂貴的抗體，增加了檢測成本。CALUX法成本低，而且靈敏度高，被認為是最好的生物檢測二惡英類物質(zhì)的生物方法。
[0006]CALUX方法由美國科學(xué)家Denison及其同事在1996年發(fā)明(MurkA.J etal.，1996)，該技術(shù)已經(jīng)在多國包括我國獲得了多項相關(guān)專利。目前，美國、歐盟以及日本已經(jīng)建立和完善了基于該方法的標準，例如US EPA Method4435,EU Commission RegulationN01883/2006,以及日本的N0.92-1-1。因此，在我國開發(fā)二惡英生物檢測的CALUX方法迫在眉睫。二惡英類物質(zhì)可以激發(fā)Ah受體(AhR)，這種DNA結(jié)合蛋白質(zhì)接觸二惡英類物質(zhì)時能夠產(chǎn)生相應(yīng)的毒性和生物學(xué)反應(yīng)從而引起化學(xué)響應(yīng)。經(jīng)過遺傳工程處理過的商品化細胞株含有螢火蟲熒光素酶基因，通過進入AhR受體激活。這些細胞株可以用于混合物對AhR激發(fā)響應(yīng)的靈敏檢測和相對含量確定。這種細胞體外測定法稱之為化學(xué)響應(yīng)熒光素酶基因表達或CALUX分析法。能夠激發(fā)這一體系的化合物主要是多氯代芳烴如2，3，7，8-四氯二苯并二惡英(T⑶D)。鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)以及一些天然化合物都可以活化該系統(tǒng)，即該系統(tǒng)特異性不夠高，所以目前所用的CALUX系統(tǒng)并不能區(qū)分檢測這些可以激活A(yù)hR的化合物，可以通過有效的前處理方法達到區(qū)分和檢測二惡英類化合物的目的。其他類多氯代芳烴的相對毒性和生物效應(yīng)可以轉(zhuǎn)化成相對2，3，7，8-TCDD毒性的值來衡量。因為該物質(zhì)能最強最有效的激活A(yù)hR反應(yīng)，包括基因轉(zhuǎn)錄。這種相對定量的方法可以得到總體毒性情況并用毒性當量TEQs來表示。即使用該方法可以得到樣品的總毒性當量。目前的問題在于，未來可以通過優(yōu)化環(huán)境樣品的前處理方法，提高樣品的純度，進一步提高CALUX系統(tǒng)的特異性。
[0007]根據(jù)二惡英類物質(zhì)生物檢測的現(xiàn)狀并結(jié)合我國檢測設(shè)備和水平較落后的具體情況，仍需開發(fā)成本低廉、靈敏度高以及克服現(xiàn)有系統(tǒng)缺陷的生物報告檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，提供了改進的二惡英類化合物生物報告檢測載體和細胞，由此完成了本發(fā)明。
[0009]本發(fā)明第一方面涉及重組載體，所述載體沿著其基因轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連接有來源于CYPlAl啟動子的CYPlAl啟動子基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段，以及報告基因；
[0010]所述CYPlAl啟動子基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件富集區(qū)段調(diào)節(jié)該報告基因的轉(zhuǎn)錄。
[0011]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的CYPlAl啟動子為哺乳動物CYPlAl啟動子，例如為小鼠、豚鼠或人的CYPlAl啟動子。在本發(fā)明的實施方案中，所述的CYPlAl啟動子為小鼠啟動子。
[0012]在本發(fā)明的實施方案中，所述啟動子基本區(qū)段包括啟動子核心啟動序列和近端啟動序列。
[0013]在本發(fā)明的實施方案中，所述的二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段包含四個二惡英反應(yīng)元件。
[0014]在本發(fā)明中，所述兩個或多個二惡英反應(yīng)元件富集區(qū)段是指兩個或兩個以上，例如 2 — 8 個(例如 2、3、4、5、6、7、8 個)。
[0015]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段的序列為SEQ ID NO:8所示的序列；和/或所述二惡英反應(yīng)元件的富集區(qū)段的序列為SEQ IDNO:9所示的序列；和/或所述兩個或多個二惡英反應(yīng)元件富集區(qū)段的序列為SEQ ID NO:15所示的序列。
[0016]在本發(fā)明中，所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和所述二惡英反應(yīng)元件的富集區(qū)段之間或者兩個或多個二惡英反應(yīng)元件富集區(qū)段之間的連接方式為本領(lǐng)域所公知，例如可以通過linker或酶切位點連接。在本發(fā)明的實施方案中,所述二惡英反應(yīng)元件的富集區(qū)段位于CYPlAl啟動子的基本區(qū)段的上游方向。
[0017]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(DRE)的富集區(qū)段的序列為SEQ ID N0:16所示的序列。
[0018]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
[0019]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，所述載體含有螢火蟲熒光素酶基因。
[0020]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其是在pGL系列載體的螢火蟲熒光素酶基因的上游可操作地連接有所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(DRE)的富集區(qū)段。
[0021]在本發(fā)明的實施方案中，其是在多克隆位點連接有所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(DRE)的富集區(qū)段。
[0022]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的pGL系列載體為pGL2、pGL3、pGL4 或 pGL6。
[0023]在本發(fā)明的實施方案中，所述pGL系列載體為pGL3系列載體。在本發(fā)明的實施方案中，所述pGL系列載體為pGL3 — basic載體。
[0024]在本發(fā)明的實施方案中，所述重組載體為pCL-CR2。
[0025]本發(fā)明第二方面涉及重組細胞，其含有本發(fā)明第一方面任一項的重組載體。
[0026]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的重組細胞，所述細胞為哺乳動物細胞。
[0027]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的重組細胞，其為重組肝源細胞，例如為重組肝癌細胞(例如!fepal、HePG2、SMMC-7721、BEL-7402, QGY-7701)，例如為重組!fepal 細胞。
[0028]在本發(fā)明中，所述肝源細胞是指來源于肝實質(zhì)的細胞。
[0029]在本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，所述重組細胞為CBG2.8D，其于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCCN0.8957。
[0030]本發(fā)明第三方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的重組載體或第二方面任一項的重組細胞用于二惡英類化合物生物檢測的用途。
[0031]本發(fā)明第四方面涉及一種二惡英類化合物生物檢測方法，所述方法使用本發(fā)明第一方面任一項的重組載體或第二方面任一項的重組細胞的步驟。
[0032]根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途或者第四方面任一項的方法，其中所述的二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(P⑶Ds)(例如2，3，7,8-四氯二苯并二惡英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合鹵代化合物。
[0033]保藏信息
[0034]細胞株CBG2.8D，分類命名小鼠肝癌細胞，其于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編 100101)，保藏編號 CGMCC N0.8957。
[0035]細胞株CBG2.4D，分類命名小鼠肝癌細胞，其于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編 100101)，保藏編號 CGMCC N0.8958。
[0036]細胞株CB G1.FL，分類命名小鼠肝癌細胞，其于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編 100101)，保藏編號 CGMCC N0.8956。
[0037]發(fā)明的有益效果
[0038]本發(fā)明采用CYPlAl的基礎(chǔ)啟動子與多個DRE富集區(qū)段連接作為熒光素酶報告基因的啟動子，構(gòu)建了二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體，大大提高了二惡英類物質(zhì)的檢測靈敏度，達到了 0.ΙρΜ；
[0039]由于該啟動子未添加任何外源基因，更有利于二惡英類物質(zhì)與二惡英反應(yīng)元件的特異性結(jié)合，以盡可能模擬二惡英類物質(zhì)暴露的真實情況；
[0040]同時，該組合啟動子的長度較短，并且具有很高的靈敏度，因此在保證檢測靈敏度的同時可以降低非特異性序列與二惡英類物質(zhì)的結(jié)合，從另一方面也提高了檢測特異性；
[0041]并且，在相同處理及儀器檢測條件下，熒光檢測強度(RLU)較目前常用的生物檢測載體提高了一個數(shù)量級，這樣可以降低對酶標儀檢測參數(shù)的要求，進而降低檢測成本，為實現(xiàn)檢測方法的大范圍推廣提供了更加有利的條件；
[0042]本發(fā)明還構(gòu)建了基于該生物報告基因檢測載體的穩(wěn)定細胞株，并篩選到具有較高靈敏度的細胞株，為二惡英類物質(zhì)的生物報告基因檢測奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1pCL-CRl及pCL_CR2的構(gòu)建示意圖；
[0044]圖2為pCL-CRl、pCL-FL和pGL6.1對T⑶D的反應(yīng)，其中左側(cè)縱坐標為熒光強度，其單位為RLU，即相對發(fā)光值，右側(cè)縱坐標為熒光素酶水平相對于溶劑對照的倍數(shù)；
[0045]圖3 為 pCL-CR2 與 pGL6.l、pCL_FL、pCL_CRl 瞬轉(zhuǎn) H印al 后對 TCDD 的反應(yīng)，縱坐標為熒光強度，其單位為RLU，即相對發(fā)光值；
[0046]圖4 為 pGL6.UpCL-FL, pCL-CRl 與 pCL_CR2 對 InM TCDD 刺激 4 小時的反應(yīng)；
[0047]圖5為pCL-CR2對梯度濃度T⑶D的反應(yīng)。
[0048]圖6為pCL-CRl對梯度濃度T⑶D的反應(yīng)。
[0049]圖7為pCL-FL對梯度濃度T⑶D的反應(yīng)。
[0050]圖8為CBG2.4D與CBG2.8D對T⑶D的反應(yīng)，其中左側(cè)縱坐標為熒光強度，其單位為 RLU;
[0051]圖9為CBG2.8D對T⑶D的MDL，其中縱坐標為熒光強度，其單位為RLU，其中*表
示與溶劑對照組相比有顯著差異；
【具體實施方式】
[0052]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0053]本發(fā)明中使用的縮寫，具有以下含義:AhR，芳基烴受體；ARNT，芳基烴受體核轉(zhuǎn)蛋白；TCDD，2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英；TCDF，2，3，7，8-四氯二苯并呋喃；PeCDF，2，3，4，7，8-五氯二苯并呋喃；DRE，二惡英反應(yīng)元件；POTDS，多氯代二苯并-對-二惡英；P⑶Fs,，多氯代二苯并呋喃；PCBs，多氯聯(lián)苯；DLCs，二惡英類化合物。
[0054]其中Hepal 細胞也叫 Hepalclc7 細胞，Michael S.Denison 贈，參見 Garrison, P.M., Tullis, K., Aarts, J.Μ.M.J.G., Brouwer, A., Giesy, J.P., andDenison, M.S.(1996).Species-specific recombinant cell lines as bioassay systems for thedetection of2,3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like chemicals.Fund.Appl.Toxicol.30，194 - 203.[0055]pGL6.1，也叫 pGudLuc6.1iMichael S.Denisor^§，.MHan，D._H.，Nagy，S.R.，andDenison，M.S.(2004).Comparison of recombinant cell bioassays for the detectionof Ah receptor agonists.Biofactors20, 11 - 22.[0056]Hepa6.1，也叫 H1L6.1c2，Michael S.Denison 贈，參見 Hanj D.-Η.，Nagy, S.R.，andDenison，M.S.(2004).Comparison of recombinant cell bioassays for the detectionof Ah receptor agonists.Biofactors20, 11 - 22.[0057]pGL3_basic 購自 Promega。
[0058]實施例1
[0059]小鼠基因組DNA來自于肝癌細胞!fepa I細胞，按照試劑盒標準方法抽提。
[0060]1.pCL-FL質(zhì)粒的構(gòu)建
[0061]小鼠基因組DNA來自于!fepal細胞，按照試劑盒標準方法抽提。并通過標準的分子克隆手段分別構(gòu)建獲得PCL-FL。
[0062]本實驗的目的是構(gòu)建獲得包括小鼠CYPlAl啟動子(-1400~+3)原始序列的二惡英報告基因檢測質(zhì)粒，該序列包含6個DRE序列。以小鼠基因組DNA為模板，用以下引物進行PCR反應(yīng)。[0063]5’ 引物為:5’ -CACGCTCGAGAACAGGTTGAGTTAGAC-3，(SEQ ID NO:1)
[0064]3，引物為:5，-CACGAAGCTTCAGGGTTAGGGTGAAG-3，(SEQ ID NO:2)
[0065]獲得PCR片段后，以Xho I和Hind III雙酶切，并對載體質(zhì)粒pGL3_basic進行同樣的雙酶切，最后將該片段構(gòu)建入pGL3-basic中。最后經(jīng)酶切測序鑒定后，獲得pCL-FL質(zhì)粒。
[0066]其中啟動子的序列為:
【權(quán)利要求】
1.重組載體，所述載體沿著其基因轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連接有來源于八1啟動子的^？1八1啟動子基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(01?)富集區(qū)段，以及報告基因； 所述^？1八1啟動子基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件富集區(qū)段調(diào)節(jié)該報告基因的轉(zhuǎn)錄。
2.權(quán)利要求1的重組載體，其中所述的八1啟動子為哺乳動物八1啟動子，例如為小鼠^？1八1啟動子。
3.權(quán)利要求1的重組載體，其中所述啟動子的基本區(qū)段的序列為3即10勵:8所示的序列；和/或所述二惡英反應(yīng)元件的富集區(qū)段的序列為3即10勵:9所示的序列；和/或所述兩個或多個二惡英反應(yīng)元件富集區(qū)段的序列為3即10勵:15所示的序列。
4.權(quán)利要求1的重組載體，其中所述^？1八1啟動子的基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(01?)的富集區(qū)段的序列為3即10勵:16所示的序列。
5.權(quán)利要求1的重組載體，其中所述的報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
6.權(quán)利要求1-5任一項的重組載體,其是在系列載體的螢火蟲突光素酶基因的上游可操作地連接有所述八1啟動子的基本區(qū)段和兩個或多個二惡英反應(yīng)元件(01?)的富集區(qū)段。
7.權(quán)利要求6的重組載體，其中所述的系列載體為或？隊6，優(yōu)選地，所述重組載體為隊卜0？2。
8.重組細胞，其含有權(quán)利要求1-7任一項的重組載體。
9.權(quán)利要求8的重組細胞，其為重組肝源細胞，例如為重組肝癌細胞，例如為重組061)811 細胞。
10.權(quán)利要求8或9的重組細胞，其為重組細胞⑶⑵.80，其于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號^0.8957。
11.權(quán)利要求1-7任一項的重組載體或權(quán)利要求8— 10任一項的重組細胞用于二惡英類化合物生物檢測的用途。
12.—種二惡英類化合物生物檢測方法，所述方法使用權(quán)利要求1-7任一項的重組載體或權(quán)利要求8 — 10任一項的重組細胞的步驟。
13.權(quán)利要求11的用途或者權(quán)利要求12的方法，其中所述的二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英⑶08)(例如2，3，7，8-四氯二苯并二惡英?、多氯二苯并呋喃⑶?4、多氯聯(lián)苯(口⑶幻、鹵代芳香烴(撤也)、多環(huán)芳香烴(口八也)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代$800/1^和9888)及其它混合鹵代化合物。
【文檔編號】C12R1/91GK103834689SQ201410100654
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】趙斌, 李帥章, 謝群慧, 鄭明輝, 裴新輝, 周志廣 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心