用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體和細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組載體和重組細(xì)胞，具體涉及一種用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體以及包含該重組載體的重組細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細(xì)胞在二惡英類物質(zhì)生物檢測方面的用途。
【專利說明】用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體和細(xì)胞
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體和重組細(xì)胞，具體涉及一種用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體以及包含該重組載體的重組細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細(xì)胞在二惡英類物質(zhì)生物檢測方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境污染問題一直伴隨著人類社會的發(fā)展進(jìn)程而日益復(fù)雜化及多樣化，這使得環(huán)境污染對人類的健康所帶來的負(fù)面影響也日益嚴(yán)重。世界衛(wèi)生組織(WHO)在其《2004年世界衛(wèi)生報告》中指出在全球范圍內(nèi)估計24%的疾病負(fù)擔(dān)(健康壽命年損失)和23%的所有死亡(早逝)可歸因于環(huán)境因素，而其中最主要的因素之一就是日益加劇的化學(xué)污染物。在眾多的化學(xué)污染物中，持久性有機(jī)污染物(POPs)因為其自身的物化特性和對人類健康的嚴(yán)重威脅受到全球極大的重視。
[0003]二惡英類化合物(Dioxins)是一類典型的持久性有機(jī)污染物，也是斯德哥爾摩公約中首批被列入對人類健康和生態(tài)環(huán)境有害的持久性有機(jī)污染物。國際癌癥研究中心已將其列為人類一級致癌物。持久性有機(jī)污染物(POPs)具有生物蓄積性、半揮發(fā)性和持久性等特點(Vallack etal., 1998; Jonesand de Voogt, 1999)。151 個國家的政府簽署的斯德哥爾摩公約“關(guān)于持久性有機(jī)污染物”，旨在消除或控制至少12種持久性有機(jī)污染物(環(huán)境署，2006年)。根據(jù)本公約，建立持久性有機(jī)污染物的排放清單是強(qiáng)制性的，這為進(jìn)一步減少排放量奠定基礎(chǔ)。因此，在環(huán)境中持久性有機(jī)污染物監(jiān)測是重要的第一步(WH0，1999)。其中，持久性有機(jī)污染物，多氯二苯并二惡英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)和多氯聯(lián)苯(PCBs)，即所謂的“二惡`英類化合物”，是目前公開的監(jiān)管和科學(xué)關(guān)注對象，因為這些化合物具有廣泛的毒性效應(yīng)，包括免疫毒性、發(fā)育毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和致癌性(Kerkvliet，1995;Brouwer, 1991;Nebert et al.，1993)。
[0004]高分辨率氣相色譜/質(zhì)譜被認(rèn)為是分析二惡英類物質(zhì)的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法。高分辨液相質(zhì)譜連用具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，但是檢測費用相當(dāng)高昂，并且檢測周期長，需要樣品量大，使其在環(huán)境、食品和衛(wèi)生等領(lǐng)域開展二惡英類化合物污染狀況篩查中的應(yīng)用受到一定限制。另外，由于化學(xué)分析僅限于17種二惡英/呋喃的風(fēng)險評估，而對其他的有毒多鹵代芳香烴化合物(PHAHs)，包括氟化、溴代和混合鹵化二惡英/呋喃以及偶氮、氧化偶氮化合物、聯(lián)苯醚、萘、硫類似物等二氧芑類物質(zhì)和烷基化的二氧芑類物質(zhì)則不能指示。此外，化學(xué)方法會忽略二惡英類化合物潛在的協(xié)同或拮抗作用。在環(huán)境中，二惡英類化合物共存的復(fù)雜性以及各種同系物的混合物和多級二惡英類化合物之間的相互作用可以調(diào)節(jié)他們的潛在毒性。大量的研究表明二惡英類化合物和非添加劑之間的相互作用(Davis andSafe, 1990; Harper et al., 1995)。因此,化學(xué)分析既不高通量監(jiān)測環(huán)境二惡英類化合物也不適合生物毒性的預(yù)測，急需要快速而廉價的生物檢測方法。
[0005]為了克服化學(xué)分析方法的限制，國際上已經(jīng)開發(fā)出各種生物檢測法，主要包括:EROD (ethoxyresorufin-Q-deethylas)> ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)和 CALUX (chemical-activated luciferase expression)。這些生物測定的方法是根據(jù)多項研究成果(Nebert et al., 1993; Lucieret al., 1993; Safe, 1990; Schmidt andBradfield, 1996)。二惡英類化合物的毒性是通過芳香烴受體(AHR)配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的(Nie et al.，2001)。目前二惡英類化合物結(jié)合芳香烴后，芳香烴受體復(fù)合物進(jìn)行變構(gòu)和AHR核轉(zhuǎn)運蛋白(ARNT) 二聚合相互作用。這種異源性的配體復(fù)合物(AhR-Arnt)結(jié)合到基因啟動區(qū)的二惡英反應(yīng)元件(DRE)上，DRE序列的結(jié)合導(dǎo)致DNA彎曲、干擾染色質(zhì)和和核小體，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄。隨后，P4501A1蛋白合成增加并誘導(dǎo)P4501A1酶活性增加，然后產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)和毒性效應(yīng)。因此，分析P4501A1依賴的EROD酶活性變化可以指示外源物質(zhì)的影響。但是，EROD法靈敏度低，限制了其應(yīng)用范圍。ELISA法有很好的特異性，然而該方法不能反映樣品的總毒性當(dāng)量，而且檢測過程都需要大量而且昂貴的抗體，增加了檢測成本。CALUX法成本低，而且靈敏度高，被認(rèn)為是最好的生物檢測二惡英類物質(zhì)的生物方法。
[0006]CALUX方法由美國科學(xué)家Denison及其同事在1996年發(fā)明(Murk A.J etal.，1996)，該技術(shù)已經(jīng)在多國包括我國獲得了多項相關(guān)專利。目前，美國、歐盟以及日本已經(jīng)建立和完善了基于該方法的標(biāo)準(zhǔn)，例如US EPA Method4435,EU Commission RegulationN01883/2006,以及日本的N0.92-1-1。因此，在我國開發(fā)二惡英生物檢測的CALUX方法迫在眉睫。二惡英類物質(zhì)可以激發(fā)Ah受體(AhR)，這種DNA結(jié)合蛋白質(zhì)接觸二惡英類物質(zhì)時能夠產(chǎn)生相應(yīng)的毒性和生物學(xué)反應(yīng)從而引起化學(xué)響應(yīng)。經(jīng)過遺傳工程處理過的商品化細(xì)胞株含有螢火蟲熒光素酶基因，通過進(jìn)入AhR受體激活。這些細(xì)胞株可以用于混合物對AhR激發(fā)響應(yīng)的靈敏檢測和相對含量確定。這種細(xì)胞體外測定法稱之為化學(xué)響應(yīng)熒光素酶基因表達(dá)或CALUX分析法。能夠激發(fā)這一體系的化合物主要是多氯代芳烴如2，3，7，8-四氯二苯并二惡英(T⑶D)。鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)以及一些天然化合物都可以活化該系統(tǒng)，即該系統(tǒng)特異性不夠高，所以目前所用的CALUX系統(tǒng)并不能區(qū)分檢測這些可以激活A(yù)hR的化合物，可以通過有效的前處理方法達(dá)到區(qū)分和檢測二惡英類化合物的目的。其他類多氯代芳烴的相對毒性和生物效應(yīng)可以轉(zhuǎn)化成相對2，3，7，8-TCDD毒性的值來衡量。 因為該物質(zhì)能最強(qiáng)最有效的激活A(yù)hR反應(yīng)，包括基因轉(zhuǎn)錄。這種相對定量的方法可以得到總體毒性情況并用毒性當(dāng)量TEQs來表示。即使用該方法可以得到樣品的總毒性當(dāng)量。目前的問題在于，未來可以通過優(yōu)化環(huán)境樣品的前處理方法，提高樣品的純度，進(jìn)一步提高CALUX系統(tǒng)的特異性。
[0007]根據(jù)二惡英類物質(zhì)生物檢測的現(xiàn)狀并結(jié)合我國檢測設(shè)備和水平較落后的具體情況，仍需開發(fā)成本低廉、靈敏度高以及克服現(xiàn)有系統(tǒng)缺陷的生物報告檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，提供了改進(jìn)的二惡英類化合物生物報告檢測載體和細(xì)胞，由此完成了本發(fā)明。
[0009]本發(fā)明第一方面涉及重組載體，所述載體沿著其基因轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連接有CYPlAl啟動子及報告基因，所述啟動子調(diào)節(jié)該報告基因的轉(zhuǎn)錄。
[0010]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的CYPlAl啟動子為哺乳動物CYPlAl啟動子，例如為小鼠、豚鼠或人的CYPlAl啟動子。在本發(fā)明的實施方案中，所述CYPlAl啟動子為小鼠CYPlAl啟動子。
[0011]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述CYPlAl啟動子的序列例如為SEQ ID NO:3所示的序列。
[0012]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
[0013]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，所述載體含有螢火蟲熒光素酶基因。
[0014]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其是在pGL系列載體的螢火蟲熒光素酶基因的上游可操作地連接有CYPlAl啟動子。
[0015]在本發(fā)明的實施方案中，其是在多克隆位點連接有CYPlAl啟動子。
[0016]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的pGL系列載體例如為pGL2、pGL3、pGL4 或pGL6。
[0017]在本發(fā)明的實施方案中，所述pGL系列載體為pGL3系列載體。在本發(fā)明的實施方案中，所述pGL系列載體為pGL3 — basic載體。
[0018]在本發(fā)明的實施方案中，所述重組載體為pCL-FL。
[0019]本發(fā)明第二方面涉及重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面任一項的重組載體。
[0020]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的重組細(xì)胞，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。
[0021]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項的重組細(xì)胞，其為重組肝源細(xì)胞，例如為重組肝癌細(xì)胞(例如!fepal、HePG2、SMMC-7721、BEL-7402, QGY-7701)，例如為重組!fepal 細(xì)胞。
[0022]在本發(fā)明中，所述肝源細(xì)胞是指來源于肝實質(zhì)的細(xì)胞。
[0023]在本發(fā)明的實施方案中，所述重組細(xì)胞為CBG1.FL，其于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCC N0.8956。
[0024]本發(fā)明第三方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的重組載體或第二方面任一項的重組細(xì)胞用于二惡英類化合物生物檢測的用途。
[0025]本發(fā)明第四方面涉及一種二惡英類化合物生物檢測方法，所述方法使用本發(fā)明第一方面任一項的重組載體或第二方面任一項的重組細(xì)胞的步驟。
[0026]根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的用途或者第四方面任一項的方法，其中所述的二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(P⑶Ds)(例如2，3，7,8-四氯二苯并二惡英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合鹵代化合物。
[0027]保藏信息
[0028]細(xì)胞株CBG1.FL，分類命名小鼠肝癌細(xì)胞，其于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編 100101)，保藏編號 CGMCC N0.8956。
[0029]發(fā)明的有益效果
[0030]本發(fā)明采用CYPlAl啟動子作為熒光素酶報告基因的啟動子，構(gòu)建了二惡英類物質(zhì)生物檢測的重組載體，由于該啟動子未添加任何外源基因，更有利于二惡英類物質(zhì)與二惡英反應(yīng)元件的特異性結(jié)合，以盡可能模擬二惡英類物質(zhì)暴露的真實情況；
[0031 ] 且在相同處理及儀器檢測條件下，熒光檢測強(qiáng)度(RLU)較目前常用的生物檢測載體提高了一個數(shù)量級，這樣可以降低對酶標(biāo)儀檢測參數(shù)的要求，進(jìn)而降低檢測成本，為實現(xiàn)檢測方法的大范圍推廣提供了更加有利的條件；
[0032]本發(fā)明還構(gòu)建了基于該生物報告基因檢測載體的穩(wěn)定細(xì)胞株，并篩選到具有較高靈敏度的細(xì)胞株，為二惡英類物質(zhì)的生物報告基因檢測奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1pCL-FL構(gòu)建示意圖；
[0034]圖2為pCL-FL和pGL6.1對T⑶D的反應(yīng)，其中縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，其單位為RLU，即相對發(fā)光值；
[0035]圖3為pCL-FL對T⑶D刺激不同時間的反應(yīng)，其中橫坐標(biāo)為時間(單位為小時)，縱坐標(biāo)為熒光素酶水平相對于溶劑對照的倍數(shù)；
[0036]圖4為pCL-FL對梯度濃度的T⑶D的反應(yīng)，其中橫坐標(biāo)為濃度(單位為摩爾濃度M)，縱坐標(biāo)為熒光素酶水平相對于溶劑對照的倍數(shù)。
[0037]圖5CBG1.FL及H印a6.1對T⑶D的反應(yīng)，其中左縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，單位為RLU ；
[0038]圖6CBG1.FL對T⑶D的反應(yīng)的MDL，其中縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，單位為RLU，橫坐標(biāo)為濃度(單位為pmol/L)，其中*表示與溶劑對照組相比有顯著差異。
【具體實施方式】
[0039]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0040]本發(fā)明中使用的縮寫，具有以下含義:AhR，芳基烴受體;ARNT，芳基烴受體核轉(zhuǎn)蛋白；TCDD，2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英；TCDF，2，3，7，8-四氯二苯并呋喃；PeCDF，2，3，4，7，8-五氯二苯并呋喃；DRE，二惡英反應(yīng)元件；POTDS，多氯代二苯并-對-二惡英；P⑶Fs,，多氯代二苯并呋喃；PCBs，多氯聯(lián)苯；DLCs，二惡英類化合物。
[0041]其中Hepal 細(xì)胞也叫 Hepalclc7 細(xì)胞，Michael S.Denison 贈，參見 Garrison, P.M., Tullis, K., Aarts, J.Μ.M.J.G., Brouwer, A., Giesy, J.P., andDenison, M.S.(1996).Species-specific recombinant cell lines as bioassay systems for thedetection of2,3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like chemicals.Fund.Appl.Toxicol.30，194 - 203.[0042]pGL6.1，也叫 pGudLuc6.1iMichael S.Denisor^§，.MHan，D._H.，Nagy，S.R.，andDenison，M.S.(2004).Comparison of recombinant cell bioassays for the detectionof Ah receptor agonists.Biofactors20, 11 - 22.[0043]Hepa6.1，也叫 H1L6.1c2，Michael S.Denison 贈，參見 Hanj D.-Η.，Nagy, S.R.，andDenison，M.S.(2004).Comparison of recombinant cell bioassays for the detectionof Ah receptor agonists.Biofactors20, 11 - 22.[0044]pGL3_basic 購自 Promega? [0045]實施例1pCL-FL質(zhì)粒的構(gòu)建
[0046]小鼠基因組DNA來自于肝癌細(xì)胞!fepal細(xì)胞，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方法抽提。并通過標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆手段分別構(gòu)建獲得pCL-FL (圖1，2)。
[0047]本實驗的目的是構(gòu)建獲得包括小鼠CYPlAl啟動子(-1400~+3)原始序列的二惡英報告基因檢測質(zhì)粒，該序列包含6個DRE序列。以小鼠基因組DNA為模板，用以下引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0048]5’ 引物為:5’ -CACGCTCGAGAACAGGTTGAGTTAGAC-3，(SEQ ID NO:1)
[0049]3，引物為:5，-CACGAAGCTTCAGGGTTAGGGTGAAG-3，(SEQ ID NO:2)
[0050]獲得PCR片段后，以Xho I和Hind III雙酶切，并對載體質(zhì)粒pGL3_basic進(jìn)行同樣的雙酶切，最后將該片段構(gòu)建入pGL3-basic中。最后經(jīng)酶切測序鑒定后，獲得pCL-FL質(zhì)粒。
[0051]其中啟動子的序列為:
【權(quán)利要求】
1.重組載體，所述載體沿著其基因轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連接有CYPlAl啟動子及報告基因，所述啟動子調(diào)節(jié)該報告基因的轉(zhuǎn)錄。
2.權(quán)利要求1的重組載體，其中所述的CYPlAl啟動子為哺乳動物CYPlAl啟動子，例如為小鼠CYPlAl啟動子。
3.權(quán)利要求2的重組載體，其中所述CYPlAl啟動子的序列為SEQID NO:3所示的序列。
4.權(quán)利要求1的重組載體，其中所述的報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
5.權(quán)利要求1-4任一項的重組載體，其是在pGL系列載體的螢火蟲熒光素酶基因的上游可操作地連接有CYPlAl啟動子。
6.權(quán)利要求5的重組載體，其中所述的pGL系列載體為pGL2、pGL3、pGL4或pGL6，優(yōu)選地，所述重組載體為pCL-FL。
7.重組細(xì)胞，其含有權(quán)利要求1-6任一項的重組載體。
8.權(quán)利要求7的重組細(xì)胞,其為為重組肝源細(xì)胞,例如為重組肝癌細(xì)胞,例如為重組Hepal細(xì)胞。
9.權(quán)利要求7或8的重組細(xì)胞，其為重組細(xì)胞CBG1.FL，其于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCC N0.8956。
10.權(quán)利要求1-6任一項的重組載體或權(quán)利要求7— 9任一項的重組細(xì)胞用于二惡英類化合物生物檢測的用途。
11.一種二惡英類化合物生`檢測方法，所述方法使用權(quán)利要求1-6任一項的重組載體或權(quán)利要求7-9任一項的重組細(xì)胞的步驟。
12.權(quán)利要求10的用途或者權(quán)利要求11的方法，其中所述的二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(P⑶Ds)(例如2，3，7，8-四氯二苯并二惡英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合鹵代化合物。
【文檔編號】C12N15/85GK103849651SQ201410100554
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】趙斌, 李帥章, 謝群慧, 裴新輝 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心