一種食品中二噁英含量的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種食品中二噁英含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：取待檢畜、禽類產(chǎn)品油脂樣品；將樣品溶于戊烷中，得到混合溶液；將混合溶液加熱，依次使混合液中的戊烷和大部分油脂揮發(fā)，得到高含量的二噁英油脂；采用淋洗法將高含量的二噁英油脂凈化提純；將通過凈化提純得到的二噁英進(jìn)行熒光分析，得到畜、禽類產(chǎn)品中二噁英含量的結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：使用本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法，不用再將樣品送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，而且檢測(cè)省時(shí)、快速、便捷、便宜、操作容易，給檢測(cè)機(jī)構(gòu)減少了大量的人力、物力、財(cái)力，節(jié)約了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率。
【專利說明】—種食品中二噁英含量的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種食品質(zhì)量檢測(cè)方法，特別涉及一種肉類食品中二噁英含量的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會(huì)的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，食品安全越來越受到許多國家政府和民眾廣泛的關(guān)注，“民以食為天，食以安為先”的理念在消費(fèi)者心里越來越強(qiáng)，特別是近年來發(fā)生的“禽流感”、“瘦肉精”、“人造蜂蜜”、“二噁英”等食品安全事件使人們愈發(fā)關(guān)注食品安全問題。隨著時(shí)代的和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們不再擔(dān)心食品短缺的問題，漸漸的對(duì)食品質(zhì)量安全的要求越來越高，尤其是家禽肉類的食品安全，人們對(duì)家禽肉類產(chǎn)品的需求已開始從數(shù)量型向?qū)|(zhì)量安全型轉(zhuǎn)變。
[0003]二噁英類廣泛和持久地存在于環(huán)境中，并富集于食物鏈的污染物，其主要來源是火山爆發(fā)，森林火災(zāi)，化工生產(chǎn)，廢物燃燒，金屬冶煉和造紙等。二噁英類物質(zhì)不僅存在于土壤，沉積物，水中，而且存在于野生動(dòng)物，家畜，人體組織。食品中二噁英類物質(zhì)不易被生物和化學(xué)降解，故具有生物富集和生物放大性，能在生物體內(nèi)和環(huán)境中長(zhǎng)期留存二噁英類物質(zhì)還具有親脂性，進(jìn)入身體后，主要存積于脂肪內(nèi)人和動(dòng)物主要是通過食物接觸二噁英類物質(zhì)，其中很大部分是來自于動(dòng)物食品！通過該裝置可以快速的檢測(cè)出家禽肉類中二噁英的含量，提高食品的安全質(zhì)量，讓人們吃上綠色無污染食品。
[0004]現(xiàn)階段我國只有少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室具備要檢測(cè)肉類食品中二噁英含量的能力，且檢測(cè)價(jià)格昂貴、操作方法繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)二噁英的檢測(cè)需要。因此急需一種能夠快速檢測(cè)肉類食品中二噁英含量的方法，以實(shí)現(xiàn)在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速檢測(cè)樣品的目的，經(jīng)過廣泛檢索，尚未發(fā)現(xiàn)較為理想的技術(shù)方案。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)階段對(duì)肉類食品中二噁英含量檢測(cè)存在的價(jià)格昂貴、操作方法繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，而提出的一種食品中二噁英含量的檢測(cè)方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
一種食品中二噁英含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟:
a、取待檢畜、禽類產(chǎn)品的固態(tài)脂肪，加熱熔解成液態(tài)油脂，從液態(tài)油脂中取樣；
b、將所取樣的液態(tài)油脂完全溶于戊烷中，得到混合溶液；
C、將混合溶液加熱，加熱的溫度保持在戊烷的沸點(diǎn)和油脂沸點(diǎn)之間，并保持一段時(shí)間，使混合液中的戊烷全部揮發(fā)；
d、再將不含戊烷的溶液繼續(xù)加熱，加熱的溫度控制在油脂的沸點(diǎn)和二噁英的沸點(diǎn)之間，并保持一段時(shí)間，使溶液中大部分油脂揮發(fā)，得到高含量的二噁英油脂；
e、凈化提純:采用淋洗法將高含量的二噁英油脂，依次通過酸性硅膠柱和活性炭柱進(jìn)行過濾提純； f、將通過凈化提純得到的二噁英進(jìn)行熒光分析，得到畜、禽類產(chǎn)品中二噁英含量的結(jié)果O
[0007]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，可以有以下進(jìn)一步的技術(shù)方案:
所述淋洗法包括以下步驟，把酸性硅膠柱和活性炭柱放置在一個(gè)管道中，形成串聯(lián)柱，先用正戊烷淋洗串聯(lián)柱，再將酸性硅膠柱取出管道，使用甲苯單獨(dú)淋洗活性炭柱，最后把酸性硅膠柱放回管道，通入高含量的二噁英油脂進(jìn)行淋洗提純。
[0008]所述酸性硅膠柱從下至上依次填充玻璃纖維、無水硫酸鈉17份和33%的硫酸硅膠30份，填充好后通過正戊烷淋洗。
[0009]所述活性炭柱從下至上依次填充玻璃棉、無水硫酸鈉5份、1%的X-CARB/硅藻土 3份和無水硫酸鈉10份，填充好后依次通過I份的丙酮，4份的甲苯和2份的正戊烷淋洗。
[0010]所述熒光分析包括以下步驟:先向已經(jīng)提純的二噁英油脂加入400 μ LPMI1640濃縮至正戊烷完全揮發(fā)；再加入含有二噁英熒光酶細(xì)胞的培養(yǎng)液后混勻；第三把混合液均勻添加到放置有細(xì)胞H1L6.1c2的96孔的孔板上，培養(yǎng)20?24h ;最后把培養(yǎng)液通過紅外線光照射，投影到熒光識(shí)別分析板，通過熒光分光光度計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，并連接至計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得二噁英含量結(jié)果，并顯示在屏幕上。
[0011]在畜、禽等肉類食品中，由于其脂肪中二噁英含量相比其他組織較高，所以在檢測(cè)肉類食品中二噁英含量時(shí)，取其油脂來做質(zhì)量檢測(cè)。
[0012]本發(fā)明采用的是CALUX法檢測(cè)食品中二噁英污染物，本檢測(cè)法的操作步驟主要有:樣品收集、二噁英類物質(zhì)提取、純化、干燥、細(xì)胞處理、細(xì)胞裂解、熒光分光光度計(jì)分析及數(shù)據(jù)處理，具體操作方法因材料的不同而有所不同，不同樣品之間的主要區(qū)別在對(duì)其所含二噁英類污染物的提取和純化的操做上，不方法主要是畜、禽等肉類食品中二噁英含量的檢測(cè)。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:使用本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法，不用再將樣品送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，而且檢測(cè)省時(shí)、快速、便捷、便宜、操作容易，給檢測(cè)機(jī)構(gòu)減少了大量的人力、物力、財(cái)力，節(jié)約了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率。

【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明提供的一種食品中二噁英含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟:
一、加熱得到含量較高的二噁英油脂，其步驟如下:
a、取待檢的畜、禽等肉類食品的固態(tài)脂肪，加熱熔解成液態(tài)油脂，從得到的液態(tài)油脂中取出50g作為樣品。
[0015]b、先在加熱裝濃縮置中裝入戊烷，將取得的50g的液態(tài)油脂加入加熱裝濃縮置中，其中戊烷與的液態(tài)油脂按10:1的比例混合，混合后將混合液搖勻，使得液態(tài)油脂完全溶于戊烷中，得到混合溶液。
[0016]C、加熱裝濃縮置將混合溶液加熱，加熱的溫度保持在戊烷的沸點(diǎn)和油脂沸點(diǎn)之間，并保持一段時(shí)間，其中加熱的溫度優(yōu)選40°C，保溫時(shí)間優(yōu)選5-10min，使混合液中的戊烷全部揮發(fā)。
[0017]d、再將不含戊烷的混合溶液繼續(xù)加熱，加熱的溫度控制在油脂的沸點(diǎn)和二噁英的沸點(diǎn)之間，并保持一段時(shí)間，其中加熱的溫度優(yōu)選300°C，保溫時(shí)間優(yōu)選5-10min，使溶液中大部分油脂揮發(fā)，得到高含量的二噁英油脂。
[0018]二、將第一步中得到的高含量二噁英油脂采用淋洗法進(jìn)行凈化提純，其步驟如下:
e、把第一步中得到的高含量二噁英油脂通過串聯(lián)的1mL酸性硅膠柱和5mL活性炭柱進(jìn)行凈化。
[0019]所述1mL酸性硅膠柱的制作方法是，從下至上依次填充玻璃纖維、無水硫酸鈉107g和33%的硫酸硅膠3.0g，填充好后用30ml的正戊烷淋洗一次。
[0020]所述5ml活性炭柱的制作方法是，從下至上依次填充玻璃棉、無水硫酸鈉0.5g、1%的X-CARB/娃藻土 0.3g和無水硫酸鈉1.0g,填充好后依次通過5ml的丙酮,20mL的甲苯和1mL的正戊烷淋洗。
[0021]1mL酸性硅膠柱和5mL活性炭柱制備好后，將它們串聯(lián)在一個(gè)管道中，形成串聯(lián)柱，先用正戊烷淋洗串聯(lián)柱，將兩柱中的雜質(zhì)去除；再將酸性硅膠柱取出管道，使用甲苯單獨(dú)淋洗活性炭柱，分離出PCDD/Fs，用甲苯淋洗活性炭柱使得在過濾二噁英時(shí)可增加其通過率；最后把酸性硅膠柱放回管道，通入高含量的二噁英油脂，將淋洗液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再用正戊烷把濃縮液定容至4mL的樣品。
[0022]三、把第二步中的凈化得到的二噁英進(jìn)行熒光分析
f、從定容至4mL的樣品中取出ImL置于試管中，然后向試管中加入400μLPMI1640濃縮，等到樣品中的正戊烷完全揮發(fā)后加入400 μ L 二噁英熒光酶細(xì)胞的培養(yǎng)液混勻得到混合液，所述η惡英突光酶細(xì)胞為現(xiàn)有技術(shù)采用1%的Penicilllin-Streptomycin +8%的FBS。
[0023]g、在已經(jīng)放置有細(xì)胞H1L6.1c2的96孔的孔板上，每孔均加入190 μ L混合液培養(yǎng)20?24h，其中培養(yǎng)的溫度設(shè)置在37°C，培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)為5%的C02。
[0024]h、培養(yǎng)后把每孔內(nèi)的培養(yǎng)液收集到試管中，通過紅外線光照射試管，照射后將光線投影到熒光識(shí)別分析板，通過熒光分光光度計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，并連接至計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得二噁英含量結(jié)果，并顯示在屏幕上。其中采用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)量發(fā)光度，通過發(fā)光度計(jì)算PCDD濃度。
[0025]檢測(cè)原理
本發(fā)明的采用CALUX法檢測(cè)食品中二噁英類物質(zhì)的原理是建立在二噁英類物質(zhì)進(jìn)入生物機(jī)體后所產(chǎn)生的生物作用的原理的基礎(chǔ)上的。二噁英進(jìn)入細(xì)胞后，首先與細(xì)胞質(zhì)中的芳香烴受體AhR結(jié)合,形成d1xin-AhR結(jié)合物,該結(jié)合物再轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,在核中，芳香烴受體先后與其結(jié)合的2個(gè)熱休克蛋白亞基Hsp90，I個(gè)p23和I個(gè)XAP2蛋白配體脫離，并在細(xì)胞核中聚集，然后D1xin-AhR混合物又與細(xì)胞核中的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子蛋白結(jié)合形成與DNA有高度結(jié)合力的d1xin-AhR-AR NT蛋白二聚體，該二聚體再特異性地結(jié)合在二噁英反應(yīng)基因的上游增強(qiáng)子中的二噁英反應(yīng)元件DREs上，從而啟動(dòng)這些靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并導(dǎo)致一系列與這些基因表達(dá)有關(guān)的生物化學(xué)變化和毒性作用。
[0026]CALUX法是一種用含熒光素酶報(bào)告基因的重組細(xì)胞來檢測(cè)食品中二噁英類物質(zhì)生物學(xué)分析方法。使用這種方法時(shí)首先是要構(gòu)建含熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞中制成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞系，最后用重組細(xì)胞來檢測(cè)食品提取物中的二噁英類物質(zhì)。從理論上來講，CALUX法檢測(cè)可用很多不同的細(xì)胞系，只要這些細(xì)胞內(nèi)含有功能健全的芳香烴受體信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，但實(shí)際上不同細(xì)胞系對(duì)各種二噁英類物質(zhì)的反應(yīng)會(huì)有所不同。目前，常用的細(xì)胞株有大鼠肝癌細(xì)胞株，小鼠肝癌細(xì)胞株和人類肝癌細(xì)胞株。
[0027]構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，先將不同數(shù)目的二噁英反應(yīng)元件DREs插入含熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒中受MMTV啟動(dòng)子調(diào)控的區(qū)域制成重組質(zhì)粒,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞制成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。檢測(cè)時(shí)，用含二噁英類物質(zhì)的食品提取物處理重組細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞接觸到二噁英類物質(zhì)后，細(xì)胞中的芳香烴受體會(huì)被激活，進(jìn)一步會(huì)導(dǎo)致熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。熒光素酶基因的表達(dá)所產(chǎn)生的熒光則可用熒光分光光度計(jì)來檢測(cè)。因重組細(xì)胞接觸到二噁英類物質(zhì)后所表達(dá)的熒光素酶的熒光量在一定范圍內(nèi)與二噁英類物質(zhì)的含量成正比，因此通過可通過檢測(cè)熒光量來計(jì)算二噁英類化合物的量。
[0028]此外，也可用重組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來檢測(cè)食品提取物中的二噁英類物質(zhì)，這樣可以節(jié)省制作穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需的時(shí)間。不過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的試驗(yàn)重復(fù)性不如穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系檢測(cè)的好，且瞬時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的基因在72h后通常會(huì)丟失，故只適合用于短期研究用。
【權(quán)利要求】
1.一種食品中二噁英含量的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: a、取待檢畜、禽類產(chǎn)品的固態(tài)脂肪，加熱熔解成液態(tài)油脂，從液態(tài)油脂中取樣； b、將所取樣的液態(tài)油脂完全溶于戊烷中，得到混合溶液； C、將混合溶液加熱，加熱的溫度保持在戊烷的沸點(diǎn)和油脂沸點(diǎn)之間，并保持一段時(shí)間，使混合液中的戊烷全部揮發(fā)； d、再將不含戊烷的溶液繼續(xù)加熱，加熱的溫度控制在油脂的沸點(diǎn)和二噁英的沸點(diǎn)之間，并保持一段時(shí)間，使溶液中大部分油脂揮發(fā)，得到高含量的二噁英油脂； e、凈化提純:采用淋洗法將高含量的二噁英油脂，依次通過酸性硅膠柱和活性炭柱進(jìn)行過濾提純； f、將通過凈化提純得到的二噁英進(jìn)行熒光分析，得到畜、禽類產(chǎn)品中二噁英含量的結(jié)果O
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述淋洗法包括以下步驟，把酸性硅膠柱和活性炭柱放置在一個(gè)管道中，形成串聯(lián)柱，先用正戊烷淋洗串聯(lián)柱，再將酸性硅膠柱取出管道，使用甲苯單獨(dú)淋洗活性炭柱，最后把酸性硅膠柱放回管道，通入高含量的二噁英油脂進(jìn)行淋洗提純。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述酸性硅膠柱從下至上依次填充玻璃纖維、無水硫酸鈉17份和33%的硫酸硅膠30份，填充好后通過正戊烷淋洗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述活性炭柱從下至上依次填充玻璃棉、無水硫酸鈉5份、1%的X-CARB/硅藻土 3份和無水硫酸鈉10份，填充好后依次通過I份的丙酮，4份的甲苯和2份的正戊烷淋洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述熒光分析包括以下步驟:先向已經(jīng)提純的二噁英油脂加入400 μ LPMI1640濃縮至正戊烷完全揮發(fā)；再加入含有二噁英熒光酶細(xì)胞的培養(yǎng)液后混勻；第三把混合液均勻添加到放置有細(xì)胞H1L6.1c2的96孔的孔板上，培養(yǎng)20?24h ;最后把培養(yǎng)液通過紅外線光照射，投影到熒光識(shí)別分析板，通過熒光分光光度計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，并連接至計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得二噁英含量結(jié)果，并顯示在屏幕上。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104048947SQ201410219084
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】孟令啟 申請(qǐng)人:孟令啟