一種利用轉(zhuǎn)基因酵母混合發(fā)酵生產(chǎn)秸稈乙醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用轉(zhuǎn)基因酵母混合發(fā)酵生產(chǎn)秸稈乙醇的方法，所用的轉(zhuǎn)基因酵母可以將秸稈的纖維素、木聚糖分別降解為葡萄糖、木糖并將它們原位發(fā)酵為乙醇，不需要另外提供纖維素酶、木聚糖酶；纖維素、木聚糖降解與發(fā)酵同步進行。本發(fā)明的優(yōu)點在于：無需另外加入纖維素酶、木聚糖酶，利用該轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母、轉(zhuǎn)基因休哈塔假絲酵母即可實現(xiàn)秸稈纖維素原料的同步酶水解－發(fā)酵從而生產(chǎn)乙醇，可大幅度降低秸稈纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，推動秸稈纖維素乙醇替代石油燃料的進程。
【專利說明】一種利用轉(zhuǎn)基因酵母混合發(fā)酵生產(chǎn)秸稈乙醇的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵工程和基因工程領域，尤其是使用轉(zhuǎn)基因釀酒酵母和轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母等混合發(fā)酵，將秸桿等纖維質(zhì)原料經(jīng)同步酶水解一發(fā)酵工藝，降解為葡萄糖、木糖然后轉(zhuǎn)化為乙醇的方法，所述的重組釀酒酵母可分泌三種纖維素酶、轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母、轉(zhuǎn)基因休哈塔假絲酵母可以分泌3種木聚糖酶，可以利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。并且，上述菌株經(jīng)過篩選馴化，對乙醇、乙酸、糠醛的耐受性較好。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著石化燃料由短缺變成枯竭，能源危機是人類面臨的共同問題。2006年6月，我國出臺《可再生能源發(fā)展專項資金管理暫行辦法》，明確重點扶持發(fā)展以秸桿等非糧食資源制取的生物乙醇燃料。開發(fā)替代糧食資源生產(chǎn)纖維乙醇，是解決燃料乙醇原料成本高的根本出路。
中國專利申請200880119451.X公開了能夠同時發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的細菌和使用該細菌生產(chǎn)生物乙醇的方法，但是，該工藝不能直接使用秸桿，只能利用葡萄糖、木糖、甘露糖，將秸桿轉(zhuǎn)化為葡萄糖，其成本遠大于由葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。此外，所用菌種的乙醇耐受低，導致工藝的乙醇含量低，平均濃度僅為3.83%,。
中國專利申請201110135607.7，公開了利用低溫纖維素酶同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝方法，然而，由于使用了纖維素酶，致使生產(chǎn)成本大幅度提高，而且，不能利用木糖，使秸桿轉(zhuǎn)化乙醇得率低，缺 乏市場競爭力。
]國專利申請200710012382.X，公開了一種酶解秸桿生產(chǎn)燃料酒精的方法，加入秸桿重量1-5%的微生物復合酶菌液，對秸桿中可利用的纖維素、半纖維素進行分解，使其轉(zhuǎn)化為糖。但是，該技術(shù)僅用了釀酒酵母，只能利用葡萄糖，秸桿整體利用率低；此外，由于所用的復合酶菌液效率低，需發(fā)酵長達10-15天，生長周期長，大幅度增加了生產(chǎn)成本，降低了競爭力。
中國專利申請201210540604.6，公開了一種以堿蓬為原料制備生物乙醇的方法，該技術(shù)只能利用葡萄糖，并且使用了低溫纖維素酶。使得生產(chǎn)成本大幅度增加。
中國專利申請201110460248.2，公開了纖維素酵母、雙菌種釀酒酵母組合物及纖維素乙醇的發(fā)酵方法，由于使用了多種酶，生產(chǎn)成本高。而且，所用的釀酒酵母，只能利用葡萄糖，不能利用木糖，秸桿整體利用率低。
本發(fā)明人提出的專利ZL200710107687.9，公開了一種利用重組釀酒酵母生產(chǎn)纖維素乙醇的方法，但是，該方法只能利用葡萄糖，不能利用木糖，而且，僅表達了一種木聚糖酶，因而不能將木聚糖完全降解為木糖。這些不足，限制了該方法的競爭力。
目前，生產(chǎn)秸桿乙醇成本高的主要問題在于纖維素酶及木聚糖酶生產(chǎn)成本高、木糖沒有利用、酵母對秸桿預處理中的有毒物質(zhì)耐受性低等，需要解決這些問題，才能大幅度降低生產(chǎn)成本，使秸桿乙醇具有市場競爭力。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種可以直接轉(zhuǎn)化秸桿的纖維素、木聚糖為葡萄糖、木糖并將它們發(fā)酵為乙醇的工藝，不需要另外提供纖維素酶、木聚糖酶，所用菌株對秸桿預處理降解液中的乙酸、糠醛有較高耐受力，對產(chǎn)物乙醇也有較高耐受力。
用轉(zhuǎn)基因釀酒酵母和轉(zhuǎn)基因的可利用木糖的酵母(例如樹干畢赤酵母)混合發(fā)酵，并且同步酶水解一發(fā)酵秸桿等纖維質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇的技術(shù)，可以實現(xiàn)上述工藝。
所述的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母可分泌三種纖維素酶:葡聚糖內(nèi)切酶、纖維二糖水解酶、β -葡聚糖苷酶。所述的轉(zhuǎn)基因的可利用木糖的酵母可以分泌外切β -1,4-木聚糖酶內(nèi)切β-1, 4-木聚糖酶和木聚糖苷酶，并具有利用木糖轉(zhuǎn)化為乙醇的能力。
在秸桿等植物纖維素中，纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素的含量比為4:3:3，半纖維素的主要成份是木聚糖，約為85~90%，木聚糖水解產(chǎn)物是木糖。充分利用纖維素原料中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)酒精，能使秸桿植物纖維素原料的酒精發(fā)酵的產(chǎn)量在原有的基礎上增加25%。因此，酵母利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是大幅度提高秸桿整體利用率、決定秸桿植物纖維資源生產(chǎn)乙醇經(jīng)濟可行的關鍵因素之一。
目前已發(fā)現(xiàn)能利用木糖的菌種有兩百多種，但能發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的菌種就幾十種，而被認為最具有工業(yè)價值的菌種為休哈塔假絲酵母(Candida shehatae )、嗜鞋管囊酵母(Pachys- olen tannophilus )、樹干畢赤酵母{Pichia stipitis )
將秸桿中的纖維素和木聚糖降解為葡萄糖和木糖，需要纖維素酶和木聚糖酶，而酶的成本占秸桿乙醇成本>70%，是制約秸桿乙醇商業(yè)化進程的關鍵因素。纖維素酶、木聚糖酶的協(xié)同作用，解除半纖維素包裹后，才能徹底分解纖維素，將其最大限度的降解為可發(fā)酵糖。生產(chǎn)秸桿乙醇 ，通常要進行預處理以除去半纖維素和木質(zhì)素的包裹，以提高纖維素、半纖維素的轉(zhuǎn)化率，在秸桿預處理中會產(chǎn)生乙酸、糠醛等對酵母有毒物質(zhì)。因此，為了降低秸桿乙醇成本，本發(fā)明提出以下措施:
(1)發(fā)酵過程中同時將葡萄糖和木糖均轉(zhuǎn)化為乙醇，可望提高產(chǎn)量25%，所以應采用能夠利用葡萄糖和木糖的菌株混合發(fā)酵，從而將葡萄糖和木糖都轉(zhuǎn)化為乙醇；
(2)采用可以分泌纖維素酶、木聚糖酶的菌株發(fā)酵，從而省去高昂的酶成本。通過基因工程可以將纖維素酶基因和木聚糖基因轉(zhuǎn)入相應酵母，得到可以分泌纖維素酶和木聚糖酶的酵母；隨著基因工程的技術(shù)發(fā)展，將外源基因在釀酒酵母、休哈塔假絲酵母、樹干畢赤酵母等酵母中表達，是可以實現(xiàn)的。
(3)選育耐受乙醇好、耐受乙酸、糠醛好的菌株，從而可以得到較高的乙醇濃度，并且大幅度減少秸桿預處理降解液脫毒成本，且發(fā)酵效率高。通過篩選馴化，可以得到這樣的菌株。
纖維素酶是一種多組分的復合酶，包括葡聚糖內(nèi)切酶(EG)，葡聚糖外切酶(或稱纖維二糖水解酶)(CHB)和β-葡聚糖苷酶(BG)等3種主要組分。在天然纖維素水解成葡萄糖的過程中，必須依靠3種酶的協(xié)同作用才能完成。釀酒酵母不能降解纖維素，只能利用葡萄糖。在釀酒酵母中要轉(zhuǎn)入葡聚糖內(nèi)切酶，葡聚糖外切酶和β-葡聚糖苷酶3種酶基因，從而構(gòu)建可以分泌纖維素酶的釀酒酵母，它可以將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進而發(fā)酵為乙醇。由此省去了高昂的纖維素酶成本。
同樣，木聚糖酶也是一種多組分的復合酶，包括外切β -1,4-木聚糖酶內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶和木聚糖苷酶，將木聚糖降解為木糖過程中，也需要3種酶的協(xié)同作用才能完成。
休哈塔假絲酵母、樹干畢赤酵母等可以利用木糖，將木糖發(fā)酵為乙醇，因此是將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇的理想菌株。但是，它們只能利用木糖，而不能利用木聚糖，需要將木聚糖降解為木糖后，方可利用。如果將外切β -1,4-木聚糖酶內(nèi)切β -1,4-木聚糖酶和木聚糖苷酶在樹干畢赤酵母、休哈塔假絲酵母中表達，使其具有降解木聚糖為木糖的能力，則轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母、休哈塔假絲酵母就可以將木聚糖降解為木糖，進而原位轉(zhuǎn)化為乙醇，由此省去了高昂的木聚糖酶成本。
將上述轉(zhuǎn)基因釀酒酵母(表達纖維素酶)與轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母、休哈塔假絲酵母(表達木聚糖酶)，混合培養(yǎng)，即可直接使用秸桿發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，且同時利用葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化為乙醇。
所用的釀酒酵母和樹干畢赤酵母、休哈塔假絲酵母，應該經(jīng)過馴化選育，得到耐受乙醇、乙酸、糠醛均較好的菌株，使得其在秸桿預處理降解液中有較高的耐受力，可以較好的發(fā)揮產(chǎn)乙醇能力。
因此，將三個纖維素酶基因同時轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，構(gòu)建一種能同時分泌三種纖維素酶的釀酒酵母工程菌；將三個木聚糖酶基因同時轉(zhuǎn)入樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)中，構(gòu)建一種能同時分泌三種木聚糖酶的樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)工程菌，直接將秸桿中的纖維素、木聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖、木糖，并同時將其發(fā)酵為乙醇。對于降低秸桿乙醇生產(chǎn)成本，促進秸桿乙醇的工業(yè)化進程具有重要意義。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1、釀酒酵母和樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)篩選馴化
[0004]用汽爆秸桿預處理液分別對釀酒酵母和樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)進行篩選馴化，同時篩選乙醇耐受度高的菌株。通過篩選馴化，得到對乙酸、糠醛、乙醇耐受好的釀酒酵母和樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)菌株。
2、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因釀酒酵母
(1)構(gòu)建重組表達載體構(gòu)
[0005]將葡聚糖內(nèi)切酶基因egl、纖維二糖水解酶基因cbhl和β _葡聚糖苷酶基因bglc與合適的載體和啟動子連接，構(gòu)建成三基因重組表達載體；
(2)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母；
(3)進行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選
利用重組子本身帶有的抗生素抗性基因或者是氨基酸、尿嘧啶缺陷的選擇性培養(yǎng)基進行篩選。其次,進行PCR檢測、Southern blot對選擇出的菌株進一步鑒定篩選,最終篩選出同時含有三個纖維素酶基因的釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子，可以分泌3種纖維素酶。
3、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母等)酵母
(1)構(gòu)建重組表達載體構(gòu)
[0006]將外切β -1，4-木聚糖酶內(nèi)切β -1，4-木聚糖酶和木聚糖苷酶與合適的載體和啟動子連接，構(gòu)建成三基因重組表達載體；
(2)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)酵母；
(3)進行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選[0007]利用重組子本身帶有的抗生素抗性基因或者是氨基酸、尿嘧啶缺陷的選擇性培養(yǎng)基進行篩選。其次,進行PCR檢測、Southern blot對選擇出的菌株進一步鑒定篩選,最終篩選出同時含有三個木聚糖酶基因的樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)陽性轉(zhuǎn)化子，可以分泌3種木聚糖酶。
4、轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)混合同步酶水解發(fā)酵秸桿生
產(chǎn)乙醇
[0008]應用上述轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)，以秸桿等纖維質(zhì)為原料，采用汽爆預處理秸桿，進行同步酶水解一發(fā)酵，將秸桿轉(zhuǎn)化葡萄糖、木糖，進而原位發(fā)酵為乙醇。由于溫度、pH、秸桿濃度、轉(zhuǎn)基因釀酒酵母與轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)的比例，氮源、培養(yǎng)時間等對乙醇產(chǎn)率、發(fā)酵速度均有較大影響，所以，需要用響應面法進行優(yōu)化的試驗設計，以確定較優(yōu)的轉(zhuǎn)化發(fā)酵工藝條件。而且，由于是混合培養(yǎng)，2種酵母對發(fā)酵條件的要求不同，所以，需通過優(yōu)化試驗設計，得到對2種酵母綜合較優(yōu)的工藝條件。
本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(1)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母，可同時分泌三種纖維素酶到胞外，即葡聚糖內(nèi)切酶(EG)、纖維二糖水解酶(CHB)和β-葡聚糖苷酶(BG);本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)，可同時分泌三種木聚糖酶到胞外，即外切β -1，4-木聚糖酶內(nèi)切β-1, 4-木聚糖酶和木聚糖苷酶，不需要另外提供酶，從而大幅度降低秸桿乙醇的生產(chǎn)成本。同時，由于纖維素酶和木聚糖同時作用，可以大幅度提供纖維素、木聚糖的轉(zhuǎn)化率，提高乙醇得率。
(2)本發(fā)明的重轉(zhuǎn) 基因釀酒酵母，轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)可將纖維素直接轉(zhuǎn)化成葡萄糖，將木聚糖轉(zhuǎn)化為木糖，同時將葡萄糖、木聚糖原位轉(zhuǎn)化成乙醇；
(3)本發(fā)明的一種用重組酵母混合發(fā)酵，不需另外加入酶，直接轉(zhuǎn)化秸桿等纖維質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇的方法，可以大幅度降低秸桿乙醇的生產(chǎn)成本，推動秸桿乙醇替代石油燃料的進程，具有廣闊的應用前景。
本工藝的設想，是經(jīng)歷了大量試驗，創(chuàng)造性勞動，才得到的。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1釀酒酵母和樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)篩選馴化用汽爆秸桿預處理液分別對釀酒酵母和樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)進行篩選馴化，同時篩選乙醇耐受度高的菌株。通過篩選馴化，得到對乙酸、糠醛、乙醇耐受好的釀酒酵母和樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)菌株。
具體實驗條件如下:
汽爆條件，溫度160-200°C，時間，3-20分鐘，壓力，1.1_1.8MP，因為汽爆條件對纖維素、木聚糖降解及轉(zhuǎn)化率以及乙酸、糠醛產(chǎn)生量均有影響，所用，用響應面法進行了優(yōu)化，得到了較優(yōu)的汽爆條件為，時間:5-8分鐘；壓力:1.3-1.5MP ;溫度:165-180°C。
馴化篩選所得到釀酒酵母菌株kdn-6, kdn-31、kdn-59、樹干畢赤酵母菌株kds_3、kds-9、kds-75、休哈塔假絲酵母菌株kdx-10、kdx_13、kdx_21在汽爆預處理液中生長良好，對乙醇耐受力均大于15%，葡萄糖、木糖利用率均大于89 %。.實施例2構(gòu)建轉(zhuǎn)基因纖維素酶釀酒酵母I載體pYEX-BX (7.1kb)(含有Ampr，URA3和leu2三個選擇標記)、3_磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(GAPDHp)和終止子(GAPDHt)、信號肽編碼序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信號肽序列(XYNSEC)，構(gòu)建重組表達載體I，其表達序列框為GAPDHp-XYNSEC-cbh 1-GAPDHT-GAPDHP-XYNSEC-eg 1- GAPDHT_GAPDHP - GLUSEC-bgl C-GAPDHt ,命名為pYEX-BX-GAPDH-EchBl。采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母kdn_6 ；根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有egl，cbhl和bglc三個纖維素酶基因，最終篩選出同時含有三種纖維素酶基因的釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子，命名為zkdn-6。
實施例3纖維酶轉(zhuǎn)基因釀酒酵母2
載體pYEX-BX (7.1kb)(含有Ampr，URA3和leu2三個選擇標記)、磷酸甘油酸激酶基因啟動子(PGKp)和終止子(PGKT)、信號肽編碼序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信號肽序列(XYNSEC)，構(gòu)建重組表達載體II，其表達序列框為PGKp-XYNSEC-Cbh1-PGKt-PGKp-XYNSEC-egl-PGKT-PGKP -PGKp- GLUSEC -bglc- PGKt,命名為 pYEX-BX-PGK-EchBl;采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母kdn-59 ;根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有egl，cbhl和bglc三個纖維素酶基因，最終篩選出同時含有三種纖維素酶基因的釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子，命名為zkdn-59。
實施例4纖維 素酶轉(zhuǎn)基因釀酒酵母3
載體Y印lacl95 (5.24kb)(含有Kanr和URA3兩個選擇標記)、3_磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(GAPDHp)和終止子(GAPDHt)、Rhizopusoryzae的葡萄糖淀粉酶基因信號肽(GLUSEC)，構(gòu)建重組表達載體III，其表達序列框為 GAPDHP-XYNSEC-cbhl-GAPDHT-GAPDHP-XYNSEC-eg1-GAPDHT-GAPDHP - GLUSEC-bglC-GAPDHt,命名為 Y印Iac-GAPDH-EchBl。采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母kdn-31 ;根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有egl，cbhl和bglc三個纖維素酶基因，最終篩選出同時含有三種纖維素酶基因的釀酒酵母陽性轉(zhuǎn)化子，zkdn-31。
實施例5構(gòu)建轉(zhuǎn)基因木聚糖酶樹干畢赤酵母I
載體pYEX-BX (7.1kb)(含有Ampr，URA3和leu2三個選擇標記)、3_磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(GAPDHp)和終止子(GAPDHt)、信號肽編碼序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信號肽序列(XYNSEC)，構(gòu)建重組表達載體I。采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到樹干畢赤酵母菌株kds-3 ;根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有三種木聚糖酶基因，最終篩選出同時含有三種木聚糖酶基因的樹干畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子，命名為zkds-3。
實施例6構(gòu)建轉(zhuǎn)基因木聚糖酶樹干畢赤酵母2
載體pYEX-BX (7.1kb)(含有Ampr，URA3和leu2三個選擇標記)、磷酸甘油酸激酶基因啟動子(PGKp)和終止子(PGKT)、信號肽編碼序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信號肽序列(XYNSEC)，構(gòu)建重組表達載體II，采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到樹干畢赤酵母菌株kds-9 ;根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有三種木聚糖酶基因，最終篩選出同時含有三種木聚糖酶基因的樹干畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子，命名為zkds-9。
實施例7構(gòu)建轉(zhuǎn)基因木聚糖酶樹干畢赤酵母3
載體Y印lacl95 (5.24kb)(含有Kanr和URA3兩個選擇標記)、3_磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(GAPDHp)和終止子(GAPDHt)、Rhizopusoryzae的葡萄糖淀粉酶基因信號肽(GLUSEC)，構(gòu)建重組表達載體III，。采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到樹干畢赤酵母菌株kds-75 ;根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有三種木聚糖酶基因，最終篩選出同時含有三種木聚糖酶基因的樹干畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子，zkds-75。
實施例8構(gòu)建轉(zhuǎn)基因木聚糖酶休哈塔假絲酵母I
載體pYEX-BX (7.1kb)(含有Ampr，URA3和leu2三個選擇標記)、3_磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(GAPDHp)和終止子(GAPDHt)、信號肽編碼序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信號肽序列(XYNSEC)，構(gòu)建重組表達載體I。采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到休哈塔假絲酵母菌株kdx-10 ;根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有三種木聚糖酶基因，最終篩選出同時含有三種木聚糖酶基因的樹干畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子，命名為zkd-10。
實施例9構(gòu)建轉(zhuǎn)基因木聚糖酶休哈塔假絲酵母2
載體pYEX-BX (7.1kb)(含有Ampr，URA3和leu2三個選擇標記)、磷酸甘油酸激酶基因啟動子(PGKp)和終止子(PGKT)、信號肽編碼序列采用T.reesei中的木聚糖酶基因的信號肽序列(XYNSEC)，構(gòu)建重組表達載體II，;采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到休哈塔假絲酵母菌株kdx-13 ;根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有三種木聚糖酶基因，最終篩選出同時含有三種木聚糖酶基因的樹干畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子，命名為zkdx-13。
實施例10構(gòu)建轉(zhuǎn)基因木聚糖酶休哈塔假絲酵母3
載體Y印lacl95 (5.24kb)(含有Kanr和URA3兩個選擇標記)、3_磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子(GAPDHp)和終止子(GAPDHt)、Rhizopusoryzae的葡萄糖淀粉酶基因信號肽(GLUSEC)，構(gòu)建重組表達載體III。采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化到休哈塔假絲酵母菌株kdx-21 ;根據(jù)所轉(zhuǎn)入重組表達載體上帶有的選擇性標記，將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在含有氨芐霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上或者是在營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基平板上，如果轉(zhuǎn)化成功，酵母細胞將獲得抗生素抗性或者是營養(yǎng)缺陷型抗性，在相應的選擇性培養(yǎng)基上將會長出含有重組子的單菌落。然后，提質(zhì)粒進行PCR擴增，雙酶切進行檢測轉(zhuǎn)化子中是否同時含有三種木聚糖酶基因，最終篩選出同時含有三種木聚糖酶基因的樹干畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子，zkdx-21。
實施例11轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、樹干畢赤酵母混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化玉米秸桿生產(chǎn)乙醇
(1)秸桿預處理
[0009]取玉米秸桿200g，粉碎，過20目篩，汽爆預處理，蒸汽加熱1.5min至壓強達1.45MP，維持7min，冷卻，至壓力為2 bar，取出秸桿原料，用50° C水洗滌5次，過濾，得120g處理后的玉米秸桿，備 用。
(2)菌種培養(yǎng)
[0010]菌株:轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-31、樹干畢赤酵母zkds_3。
斜面培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，20;酵母浸膏，3;瓊脂，20;麥芽汁，3 ； pH 6.5，溫度 30±1。C
種子培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，30;酵母浸膏，I ;玉米漿，2; (NH4)SO4,
7.5; K2HPO4, 3.5; MgSO4.7Η20, 0.75; CaCl2.2H20, IM 檸檬酸緩沖液，pH 6.5 ,38 ° C，培養(yǎng)30 h，轉(zhuǎn)速150 rpm
接種量:按每100ml轉(zhuǎn)化液接種1.0g菌體(以干菌體計)，2種酵母，各自分別培養(yǎng)。
(3)秸桿轉(zhuǎn)化為乙醇
[0011]發(fā)酵液組成(g/Ι):酵母浸膏，0.2;玉米漿，2.5; (NH4)2S04, 7.5; K2HPO4,
3.5;尿素，I ；MgS04.7H20, 0.75; CaCl2.2H20, I;預處理的秸桿，170，0.05M 檸檬酸緩沖液，置250 ml搖瓶中，用2 M NaOH調(diào)pH 6.6。
發(fā)酵液滅菌后，加入轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、樹干畢赤酵母菌種共計l.0g (以干菌體計)，轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-6與樹干畢赤酵母zkds-9之比為1:0.8。0.1 g Tween 80 (g/Ι),發(fā)酵液總體積為100ml，在38 ° C，發(fā)酵48-60h，乙醇濃度達140.7g/L，葡萄糖、木糖利用率>89% ο
由于溫度、pH、秸桿濃度、轉(zhuǎn)基因釀酒酵母與轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母(或休哈塔假絲酵母)的比例，氮源、培養(yǎng)時間等對乙醇產(chǎn)率、發(fā)酵速度均有較大影響，所以，需要用響應面法進行優(yōu)化的試驗設計，以確定較優(yōu)的轉(zhuǎn)化發(fā)酵工藝條件。而且，由于是混合培養(yǎng)，2種酵母對發(fā)酵條件的要求不同，所以，需通過優(yōu)化試驗設計，得到對2種酵母綜合較優(yōu)的工藝條件。
本實施例的條件即為進行大量優(yōu)化試驗后得到的。
實施例12轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、樹干畢赤酵母混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化玉米秸桿生產(chǎn)乙醇
(1)秸桿預處理
[0012]玉米秸桿5噸，粉碎，過20目篩，汽爆預處理，蒸汽加熱1.5min至壓強達1.35MP，維持5.5min,冷卻,至壓力為2 bar,取出稻桿原料備用。
(2)菌種培養(yǎng)
[0013]菌株:轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-6、樹干畢赤酵母zkds_9。
斜面培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，20;酵母浸膏，3;瓊脂，20;麥芽汁，3 ； pH 6.5，溫度 30±1。C
種子培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，50;酵母浸膏，I ;玉米漿:2; (NH4)SO4,
7.5; K2HPO4, 3.5; MgSO4.7Η20, 0.75; CaCl2.2H20, IM 檸檬酸緩沖液，pH 6.5 ,36 ° C，培養(yǎng)30 h，轉(zhuǎn)速150 rpm
接種量:10%，種子液/發(fā)酵液，體積比，多級種子液培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-6與樹干畢赤酵母zkds -9之比為1:1。
(3)秸桿轉(zhuǎn)化為乙醇
[0014]發(fā)酵液組成(g/Ι):酵母浸膏，0.3;玉米漿，3; (NH4)2S04, 7.5; K2HPO4, 3.5;尿素，I ；MgS04.7H20, 0.75; CaCl2.2H20, I;汽爆預處理的秸桿，分批補料投入，保持濃度為 200-230g/L，0.05M 檸檬酸緩沖液，用 2 M NaOH 調(diào) pH 6.6.0。
在30M3工業(yè)發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵液滅菌后，加入轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、樹干畢赤酵菌種，接種量:8%，種子液/發(fā)酵液，體積比，轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-6與樹干畢赤酵母zkds-9之比為1:1。在36° C，發(fā)酵48-55h，乙醇濃度達150.lg/L，葡萄糖、木糖利用率>90%。
本實施例為中試規(guī)模的試驗，由實施例11放大到30M3工業(yè)發(fā)酵罐，是實驗室小試放大到中試規(guī)模，技術(shù)難度很大，經(jīng)歷大量的試驗，不是常規(guī)實驗工作所能解決。
實施例13轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、休哈塔假絲酵母混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化稻草秸桿生產(chǎn)乙醇
(1)秸桿預處理
[0015]取稻草150g，粉碎，過20目篩，汽爆預處理。取出秸桿原料，用50° C水洗滌5次，過濾，得105g處理后的稻草秸桿，備用。
(2)菌種培養(yǎng)
[0016]菌株:轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-6、休哈塔假絲酵母z kdx-10?
斜面培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，20;酵母浸膏，3;瓊脂，20;麥芽汁，3 ； pH 6.5，溫度 30±1。C
種子培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，50;酵母浸膏，2;玉米漿，2; (NH4)SO4,
7.5; K2HPO4, 3.5; MgSO4.7Η20, 0.75; CaCl2.2Η20, IM 檸檬酸緩沖液，pH 6.5 ,30 。C，培養(yǎng)30 h，轉(zhuǎn)速150 rpm
接種量:按每100ml轉(zhuǎn)化液接種共計1.0g菌體(以干菌體計),轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-6與休哈塔假絲酵母z kdx-10之比為1:0.92。
(3)秸桿轉(zhuǎn)化為乙醇
[0017]發(fā)酵液組成(g/Ι):酵母浸膏，0.5;玉米漿，2.5; (NH4)2S04, 7.5; K2HPO4,3.5;尿素，I ；MgS04.7H20, 0.75; CaCl2.2H20, I;預處理的稻草秸桿，165，0.05M 檸檬酸緩沖液，置250 ml搖瓶中，用2 M NaOH調(diào)ρΗ6.5.0。
發(fā)酵液滅菌后，接壤轉(zhuǎn)基因酵母，接種量:8 %，種子液/發(fā)酵液，體積比，轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-6與休哈塔假絲酵母ζ kdx-ΙΟ之比為1:0.92。0.1 g Tween 80 (g/Ι)，發(fā)酵液總體積為100ml，在30 ° C，有氧發(fā)酵24-48 h,乙醇濃度達138.2g/L，葡萄糖、木糖利用率>92%。
實施例14轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、樹干畢赤酵母混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化玉米秸桿生產(chǎn)乙醇
(1)秸桿預處理
[0018]取玉米秸桿5000噸，粉碎，過20目篩，汽爆預處理，蒸汽加熱1.5min至壓強達
1.35MP,維持5min，冷卻，至壓力為2 bar常壓，取出秸桿原料備用。
(2)菌種培養(yǎng)
[0019]菌株:轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-59、樹干畢赤酵母zkds_75。
斜面培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，20;酵母浸膏，3;瓊脂，20;麥芽汁，3 ； pH 6.5，溫度 30±1。C
種子培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，50;酵母浸膏，I ;玉米漿:2; (NH4)SO4,
7.5; K2HPO4, 3.5; MgSO4.7Η20, 0.75; CaCl2.2Η20, IM 檸檬酸緩沖液，pH 6.5 ,35 。C，培養(yǎng)30 h，轉(zhuǎn)速150 rpm
接種量:10 %，種子液/發(fā)酵液，體積比，轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-59與樹干畢赤酵母zkds-75之比為1:0.9，多級種子液培養(yǎng)。
(3)秸桿轉(zhuǎn)化為乙醇
[0020]發(fā)酵液組成(g/Ι):酵母浸膏，0.3;玉米漿，3; (NH4)2S04, 7.5; K2HPO4, 3.5;尿素，I ；MgS04.7H20, 0.75; CaCl2.2H20, I;預處理的秸桿，分批補料投入，保持濃度為180-210g/L，0.05M 檸檬酸緩沖液，用 2 M NaOH 調(diào) pH 6.60。
在300M3工業(yè)發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵液滅菌后，加入轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、樹干畢赤酵菌種，接種量:8%，種子液/發(fā)酵液,體積比,轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-59與樹干畢赤酵母zkds-75之比為1:0.9。在35 ° C，無氧發(fā)酵40-50h，乙醇濃度達150.3g/L，，葡萄糖、木糖利用率 >93%。
本實施例為工業(yè)規(guī)模的試驗，由實施例12放大到300M3工業(yè)發(fā)酵罐，是從中試放大至批量生產(chǎn)規(guī)模，工作難度很大，經(jīng)歷大量的試驗，不是常規(guī)實驗工作所能解決。
實施例15轉(zhuǎn)基因釀酒酵母和休哈塔假絲酵母混合發(fā)酵轉(zhuǎn)化玉米秸桿生產(chǎn)乙醇
(1)秸桿預處理
[0021]玉米秸桿5000噸，粉碎，過20目篩，汽爆預處理，蒸汽加熱1.5min至壓強達
1.35MP,維持5min，冷卻，至壓力為2 bar常壓，取出秸桿原料備用。
(2)菌種培養(yǎng)
[0022]菌株:轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-31、休哈塔假絲酵母z kdx_13。
斜面培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，20;酵母浸膏，3;瓊脂，20;麥芽汁，3 ； pH 6.5，溫度 30±1。C
種子培養(yǎng)基組成(g/L)及培養(yǎng)條件:葡萄糖，50;酵母浸膏，I ;玉米漿:2; (NH4)SO4,
7.5; K2HPO4, 3.5; MgSO4.7Η20, 0.75; CaCl2.2Η20, IM 檸檬酸緩沖液，pH 6.5，353。C，培養(yǎng)30 h，轉(zhuǎn)速150 rpm
接種量:10 %，種子液/發(fā)酵液，體積比，轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-59與樹干畢赤酵母zkds-75之比為1:0.8。多級種子液培養(yǎng)。
(3)秸桿轉(zhuǎn)化為乙醇
[0023] 發(fā)酵液組成(g/Ι):酵母浸膏，0.3;玉米漿，3; (NH4)2S04, 7.5; K2HPO4, 3.5;尿素，I ；MgS04.7H20, 0.75; CaCl2.2H20, I;預處理的秸桿，分批補料投入，保持濃度為150-180g/L，0.05M 檸檬酸緩沖液，用 2 M NaOH 調(diào) pH 6.2。
在300M3工業(yè)發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵液滅菌后，加入轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、樹干畢赤酵菌種，接種量:8%，種子液/發(fā)酵液,體積比,轉(zhuǎn)基因釀酒酵母zkdn-59與樹干畢赤酵母zkds-75之比為1:0.8。在33° C，有氧發(fā)酵35-45h，乙醇濃度達150.3g/L，葡萄糖、木糖利用率>92%。
由實施例14到本實施例，實驗規(guī)模沒有變化，只是菌株改變了，所以，工作難度相對較小。
【權(quán)利要求】
1.一種利用轉(zhuǎn)基因酵母混合發(fā)酵生產(chǎn)秸桿乙醇的方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因酵母可以將秸桿的纖維素、木聚糖分別降解為葡萄糖、木糖并將它們原位發(fā)酵為乙醇，不需要另外提供纖維素酶、木聚糖酶，纖維素、木聚糖降解與發(fā)酵同步進行。
2.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因酵母為轉(zhuǎn)基因釀酒酵母、轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母、轉(zhuǎn)基因休哈塔假絲酵母；轉(zhuǎn)基因釀酒酵母同時轉(zhuǎn)入了葡聚糖內(nèi)切酶、纖維二糖水解酶和葡聚糖苷酶基因，可以分泌葡聚糖內(nèi)切酶、纖維二糖水解酶和葡聚糖苷酶；轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母、轉(zhuǎn)基因休哈塔假絲酵母均同時轉(zhuǎn)入了外切β -1,4-木聚糖酶內(nèi)切β-1, 4-木聚糖酶和木聚糖苷酶基因，可以分泌外切β -1, 4-木聚糖酶內(nèi)切β -1, 4-木聚糖酶和木聚糖苷酶，轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母、轉(zhuǎn)基因休哈塔假絲酵母可以利用木糖發(fā)酵乙醇。
3.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于將轉(zhuǎn)基因釀酒酵母與轉(zhuǎn)基因樹干畢赤酵母，或者與轉(zhuǎn)基因休哈塔假絲酵母混合發(fā)酵，發(fā)酵條件為:轉(zhuǎn)基因釀酒酵母與樹干畢赤酵母或轉(zhuǎn)基因休哈塔假絲酵母為之比為1:0.8-1，發(fā)酵溫度為30-38 ° C，發(fā)酵時間為24-60h，汽爆預處理的稻桿分批補料投入發(fā)酵罐，保持稻桿濃度為150_230g/L, pH為6.2-6.6 ;發(fā)酵液組成(g/Ι):酵母浸膏，0.3 ;玉米漿，2.5-3; (NH4)2S04, 7.5; K2HPO4, 3.5;尿素，I ；MgSO4.7H20, 0.75; CaCl2.2H20, I。
【文檔編號】C12R1/84GK103805673SQ201410071176
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月1日
【發(fā)明者】張媛媛, 劉均洪, 宿烽 申請人:青島科技大學