中國葉螨屬常見種的pcr-rflp鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法。該方法通過DNA提取，多聚酶鏈式反應（PCR）擴增出核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列片段（ITS）后經(jīng)過四種限制性內(nèi)切酶酶切得到種特異性的限制性片段長度多態(tài)性圖譜（RFLP），最后對照標準圖譜對中國葉螨屬常見種實現(xiàn)快速準確鑒定。本發(fā)明所述葉螨屬常見種的快速鑒定方法迅速、簡單、可靠，還可用于葉螨批量鑒定。此分子鑒定技術為葉螨屬科研、檢疫和田間防治準確鑒定種提供了保障。
【專利說明】中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法。
【背景技術】
[0002]葉螨是蝶螨亞綱(Acari)、真螨總目(Acariformes)、絨螨目(Trombidiformes)、前氣門亞目(Prostigmata)、異氣門總股(Eleutherengonides)、葉螨科(Tetranychidae)的植食性螨類。葉螨是一種危害果蔬和溫室植物的世界范圍的重要經(jīng)濟害蟲。葉螨屬(Tetranychus)是葉螨科中經(jīng)濟意義最大的一類葉螨。該屬葉螨與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關系密切，爆發(fā)嚴重時常導致作物干枯落葉，生長停滯，嚴重影響產(chǎn)量和質(zhì)量，在經(jīng)濟上造成一定的損失。雖然葉螨屬葉螨經(jīng)濟意義重大，但是由于形態(tài)學特征有限，且這些特征在不同種之間具有高度的相似性，再者同一植株或者同一葉片上葉螨常常會混合發(fā)生，使得葉螨的快速準確鑒定存在較大的困難。
[0003]目前，對于常規(guī)形態(tài)學鑒定較難分辨的物種，通常是采取PCR擴增特定片段如CO1、ITS等然后直接測序，通過與數(shù)據(jù)庫中已知序列對比鑒定物種。然而，此方法存在如下缺陷:1.數(shù)據(jù)庫中的已知序列來源廣泛，提交序列時數(shù)據(jù)庫無法鑒別序列所屬葉螨鑒定的正確性，如已有分析數(shù)據(jù)表明，數(shù)據(jù)庫GenBank中的葉螨分子序列大約30%存在鑒定錯誤；
2.PCR擴增后的ITS片段，需要經(jīng)過純化、克隆、挑斑等步驟，成本較高，若待鑒定葉螨數(shù)量較大，則載體、測序等成本非常高；3.克隆測序整個過程通常需要三天以上，若待鑒定葉螨數(shù)量較大，則工作量巨大，所耗時間更長。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述缺陷，提供一種能區(qū)分中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒別方法，從而在分子水平上迅速高效準確的鑒定葉螨物種。
[0005]一種中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法，包含以下步驟:
[0006]I)提取待鑒定葉螨總DNA ；
[0007]2)使用葉螨中擴增ITS的通用引物PCR擴增ITS序列；
[0008]3)將上述PCR產(chǎn)物作為酶切模板，分別使用Rsa 1、Mbo I1、HpyF31、Hinf 14種酶進行酶切反應，取酶切產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果;
[0009]4)將待鑒定圖譜與標準酶切圖譜比對，通過比較酶切條帶的數(shù)量與位置從而確定待鑒定葉螨的物種。
[0010]其中，所述的葉螨中擴增ITS的通用引物選自SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4。
[0011]所述PCR的反應體系如下:
[0012]
【權(quán)利要求】
1.一種中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于包含以下步驟: 1)提取待鑒定葉螨總DNA； 2)使用葉螨中擴增ITS的通用引物PCR擴增ITS序列； 3)將上述PCR產(chǎn)物作為酶切模板，分別使用Rsa1、Mbo I1、HpyF31、Hinf 14種酶進行酶切反應，取酶切產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果； 4)將待鑒定圖譜與標準酶切圖譜比對，通過比較酶切條帶的數(shù)量與位置從而確定待鑒定葉螨的物種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于所述的葉螨中擴增ITS的通用引物選自SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3和SEQID N0.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于所述PCR的反應體系如下:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于所述的PCR擴增后，取PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并確認是否成功擴增出目的片段，目的片段作為下一步酶切反應的酶切模版。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于所述的標準酶切圖譜是使用通過形態(tài)學進行分類鑒定或經(jīng)測序分類鑒定的常見種葉螨分別按照步驟I)~3)建立的電泳圖譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中國葉螨屬常見種的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于所述的常見種葉螨包括二斑葉螨綠色型、二斑葉螨紅色型、截形葉螨、神澤葉螨、盧氏葉螨、豆葉螨、馬來葉螨和皮氏葉螨。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805708SQ201410057235
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】洪曉月, 葛成, 靳鵬宇 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學