一種青藏高原藏羊mtDNA D-loop全序列及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青藏高原藏羊mtDNA?D-loop全序列及檢測(cè)方法，包括以下步驟:（1）綿羊線粒體D-loop全序列的收集及與近緣線粒體D-loop序列的比對(duì)；（2）引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增；（3）PCR產(chǎn)物測(cè)序與序列組裝。本發(fā)明獲得了青藏高原14個(gè)藏羊地方品種636個(gè)個(gè)體的mtDNA?D-loop全序列。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有速度快、成本低、易掌握等優(yōu)點(diǎn)，所獲得的mtDNA?D-loop全序列可應(yīng)用于青藏高原藏羊遺傳資源多樣性評(píng)估、遺傳變異分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、母系起源和系統(tǒng)發(fā)育研究及種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)等領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】—種青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于綿羊基因組學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]家畜遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是畜牧業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)。通過(guò)研究家畜的遺傳多樣性可以進(jìn)一步了解家畜遺傳多樣性的豐富程度和品種遺傳的獨(dú)特性程度，為合理開發(fā)利用家畜遺傳資源提供依據(jù)，還可以為物種多樣性的保護(hù)提供依據(jù)。
[0003]綿羊的線粒體基因組DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)呈典型的閉合環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為15.6kb，能夠自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。線粒體DNA(mtDNA)是核外遺傳物質(zhì)，具有分子量較小、進(jìn)化速度快、無(wú)組織特異性及嚴(yán)格的母系遺傳等特性，在近緣種間和種內(nèi)群體間具有豐富的多態(tài)性，是研究物種起源進(jìn)化、分類的有力工具。根據(jù)堿性氯化銫密度梯度離心中雙鏈密度不同可將mtDNA的兩條鏈分為重鏈(H)和輕鏈(L),兩條鏈都參與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。對(duì)綿羊線粒體基因組的結(jié)構(gòu)分析表明，mtDNA可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)內(nèi)含37個(gè)基因，包括13個(gè)蛋白質(zhì)基因，2個(gè)rRNA基因，22個(gè)tRNA基因。其中13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因分別是細(xì)胞色素b基因(Cytb)、細(xì)胞色素C氧化酶三個(gè)亞基1、II和III基因(Co I ,Co II和Co III)，ATP 合成酶亞基基因(ATPase 6 和 ATPase 8)和 7 個(gè) NADH 酶亞基 ND 1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6和ND4L ；2個(gè)rRNA基因分別是12s rRNA基因和16s rRNA基因，緊緊相鄰；線粒體的12S rRNA和16S rRNA基因位于H鏈的tRNA Phe和tRNA Leu基因之間，以tRNAVal基因?yàn)殚g隔，12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守。22個(gè)tRNA基因位于rRNA和13個(gè)蛋白質(zhì)基因之間。除了 ND6和8個(gè)tRNA基因在L鏈編碼外，其余大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因和2個(gè)rRNA基因都是由H鏈編碼。
[0004]mtDNA控制區(qū)又稱為替代環(huán)區(qū)(D-1oop)或D-環(huán)，位于tRNAPlr°和tRNAPhe基因之間，它是線粒體基因組中最主要的一段非編碼區(qū)，也是線粒體堿基序列和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域，進(jìn)化速度是其他區(qū)段的5倍，具有堿基替換速率快、存在豐富的序列變異等特點(diǎn)，特別適合于檢測(cè)種群內(nèi)及種群間的遺傳多樣性。D-1oop的堿基替換率比mtDNA分子的其他區(qū)域高5~10倍，是核單拷貝基因的25~100倍；它是整個(gè)線粒體基因組中序列和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域。D-1oop是mtDNA分子內(nèi)的高變區(qū)，且為A-T富集區(qū)，依照堿基A的比率，D-1oop可分為左功能區(qū)、中間保守區(qū)、右功能區(qū)三部分。左功能區(qū)和右功能區(qū)在遺傳上為高變區(qū)，且為AT富集區(qū)；保守序列區(qū)(conserved sequence block, CSB)為G堿基富集區(qū),且在不同的物種上結(jié)構(gòu)不盡相同，多數(shù)動(dòng)物的中間保守區(qū)內(nèi)存在不同的重復(fù)序列。不同的物種重復(fù)序列所在的位置及重復(fù)單元序列不同，同種物種不同個(gè)體的單元序列重復(fù)數(shù)也不盡相同，這種差異在個(gè)體間表現(xiàn)為mtDNA分子的長(zhǎng)度差異(molecule size variation),在個(gè)體內(nèi)則表現(xiàn)為異質(zhì)型現(xiàn)象(heteroplasmy)。因控制區(qū)不編碼基因，故產(chǎn)生的突變可以不斷地得到積累而對(duì)線粒體的功能不產(chǎn)生影響，因此具有更大的進(jìn)化速率。由于具有單倍性、低重組率、母系遺傳及進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，mtDNA已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)及物種鑒定等領(lǐng)域。
[0005]藏羊主要有高原型(草地型)、山谷型和歐拉型三大類，各地根據(jù)其自然生態(tài)特點(diǎn)又細(xì)分為不同的類型，屬粗毛型綿羊地方品種。藏羊原產(chǎn)于青藏高原，主要分布于西藏自治區(qū)及青海、甘肅、四川、云南、貴州等地，由于各生態(tài)條件差異懸殊，形成了不同的類型。草地型(高原型)藏羊是主體，數(shù)量最多，主要分布于西藏境內(nèi)的網(wǎng)底斯山、念青唐古拉山以北的藏北高原和雅魯藏布江地帶；青海的藏羊主要分布在海北藏族自治州、海南藏族自治州、海西蒙古族哈薩克自治州、黃南藏族自治州、玉樹藏族自治州、果洛藏族自治州六州的廣闊高寒牧區(qū)；甘肅的甘南藏族自治州的各縣市藏羊的主要分布區(qū)域；四川境內(nèi)的藏羊分布在甘孜藏族自治州、阿壩藏族羌族自治州北部牧區(qū)。山谷型藏羊主要分布在青海省南部的班瑪、囊謙兩縣的部分地區(qū)，四川省阿壩藏族羌族自治州南部牧區(qū)，云南的昭通市、曲靖市、麗江市及保山市騰沖縣。歐拉型藏羊是藏系綿羊的一個(gè)特殊生態(tài)類型，中心產(chǎn)區(qū)位于甘肅省甘南藏族自治州的瑪曲縣歐拉鄉(xiāng)及比鄰地區(qū)及青海省河南蒙古族自治縣和久治縣等地。研究藏羊起源和進(jìn)化可以說(shuō)明古今綿羊的關(guān)系，更好的解決育種、改良、選種和保種問(wèn)題。通過(guò)對(duì)藏羊遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化、母系起源的研究和認(rèn)識(shí)，不但可以調(diào)查藏羊品種遺傳資源背景狀況，而且可確定品種遺傳特征，了解各群體間的親緣關(guān)系，準(zhǔn)確區(qū)分品種，進(jìn)而為育種工作提供重要依據(jù)。因此，有必要開展藏羊mtDNA D-1oop全序列研究，從基因水平揭示其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和種群 遺傳多樣性水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提出一種速度快、成本低、易掌握的青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，已解決上述【背景技術(shù)】中提出的問(wèn)題。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及檢測(cè)方法,包括以下步驟:
(1)綿羊mtDNAD-1oop全序列的收集與分析:
收集綿羊mtDNA D-1oop全序列，并與近緣種的mtDNA D-1oop全序列進(jìn)行比對(duì),分析mtDNA D-1oop全序列在近緣種的mtDNA全基因組序列上的相對(duì)位置；
(2)引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增:
根據(jù)mtDNA D-1oop基因在近緣種全基因組序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)上、下游PCR引物，采用PCR方法擴(kuò)增相鄰的兩個(gè)已知序列的未知序列；
(3)PCR產(chǎn)物測(cè)序與序列組裝:
通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)體系對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序、序列分析，將mtDNA D-1oop序列進(jìn)行組裝，獲得mtDNA D-1oop全序列。
[0008]步驟(1)中，所述綿羊mtDNA D-Ιοορ全序列的獲得方法有三種:一種是從測(cè)序獲得的基因組文庫(kù)或轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中查找；另一種是從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的綿羊基因序列中查找；第三種是通過(guò)收集近緣種的mtDNA D-1oop全序列進(jìn)行同源比對(duì)，在保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，然后以藏羊的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序后獲得青藏高原14個(gè)藏羊地方品種636個(gè)個(gè)體mtDNA D-1oop全序列。
[0009]步驟(1)中，所述近緣種為摩弗倫羊、羱羊、盤羊、亞洲A型、歐洲B型。
[0010]步驟⑵中，所述PCR引物和測(cè)序引物I對(duì)，其引物序列為:Forward primer:5’ -GGCTGGGACCAAACCTAT-3J
Reverse primer:5’ -GAACAACCAACCTCCCTAAG-3’。
[0011]步驟⑵中，所述PCR方法中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30uL，包括基因組DNA模板2uLUOXBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA聚合酶0.2 uL、3 pM上下游引物各3 uL、滅菌雙蒸水16.8 uL ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5分鐘、94°C變性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36個(gè)循環(huán)、72°C延伸10分鐘，12°C保存。
[0012]步驟(3)中，所述PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)體系為5 uL，包括基因組DNA模板(30-50 ng)3 uL、3 pM測(cè)序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、滅菌雙蒸水0.5 uL ;PCR測(cè)序反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性2分鐘、95°C變性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25個(gè)循環(huán)，12°C保存。
[0013]步驟(3)中，所述PCR產(chǎn)物的測(cè)序方法為雙向、直接測(cè)序。
[0014]步驟(3)中，所述mtDNA D-Ιοορ序列組裝方法是:以摩弗倫羊的mtDNA D-1oop全序列為參照物，將所有14個(gè)藏羊地方品種636個(gè)個(gè)體的mtDNA D-1oop序列進(jìn)行拼接，獲得青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列,所述青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列長(zhǎng)度的變化范圍為977-1259bp。
[0015]綜上所述，本發(fā)明有益效果:
1、本發(fā)明的檢測(cè)方法具有速度快、成本低、易掌握等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效檢測(cè)出青藏高原藏羊的mtDNA D-1oop全序列，從而為青藏高原藏羊分子遺傳學(xué)及分子系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)研究提供有效的研究平臺(tái)。
[0016]2、本發(fā)明提供的青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列可應(yīng)用于藏羊遺傳資源多樣性評(píng)估、遺傳變異分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、母系起源和系統(tǒng)發(fā)育研究及種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)等領(lǐng)域。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0018]實(shí)施例1
一種青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及檢測(cè)方法,包括以下步驟:
(1)綿羊mtDNAD-1oop全序列的收集與分析
首先，本發(fā)明從測(cè)序獲得的基因組文庫(kù)中篩選青藏高原藏羊mtDNA D-1oop相關(guān)基因序列，一方面從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索青藏高原藏羊mtDNA D-1oop相關(guān)基因；然后,將收集到的青藏高原藏羊mtDNA D-1oop相關(guān)基因序列與近緣種摩弗倫羊、羱羊、盤羊、亞洲A型、歐洲B型的mtDNA D-1oop全序列進(jìn)行比對(duì),分析相關(guān)基因在近緣種mtDNA D-1oop全序列上的相對(duì)位置；
(2)引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增
根據(jù)藏羊mtDNA D-1oop全序列在近緣種基因組序列上的相對(duì)位置，以藏羊基因組為模板設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法擴(kuò)增相鄰的兩個(gè)已知基因間的未知序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 30uL，包括基因組 DNA 模板 2 uLUO X Buffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA 聚合酶0.2 uL、3 pM上下游引物各3 uL、滅菌雙蒸水16.8 uL ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5分鐘、94 V變性30秒、56 V退火30秒、72 °C延伸90秒、36個(gè)循環(huán)、72 °C延伸10分鐘，最后12 °C保存；PCR反應(yīng)完成后，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的質(zhì)量；
(3)PCR產(chǎn)物測(cè)序與序列組裝
PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)體系為5 uL，包括基因組DNA模板(30-50 ng) 3 uL、3 pM測(cè)序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、滅菌雙蒸水0.5 uL ;PCR測(cè)序反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性2分鐘、95°C變性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25個(gè)循環(huán)，12°C保存。
[0019]將上述PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向、直接測(cè)序。將每個(gè)PCR產(chǎn)物的雙向測(cè)序結(jié)果拼接為一條完整的序列。然后以摩弗倫羊、羱羊、盤羊、亞洲A型、歐洲B型的mtDNA D-1oop全序列為參照序列，將所有的mtDNA基因進(jìn)行組裝。最后組裝獲得藏羊14個(gè)地方綿羊品種636個(gè)個(gè)體mtDNA D-1oop全序列。
[0020]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0021]此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他 實(shí)施方式。
【權(quán)利要求】
1.一種青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列及檢測(cè)方法,其特征是,包括以下步驟: (1)綿羊mtDNAD-1oop全序列的收集與分析: 收集綿羊mtDNA D-1oop全序列，并與近緣種的mtDNA D-1oop全序列進(jìn)行比對(duì),分析mtDNA D-1oop全序列在近緣種的mtDNA全基因組序列上的相對(duì)位置； (2)引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增: 根據(jù)mtDNA D-1oop基因在近緣種全基因組序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)上、下游PCR引物，采用PCR方法擴(kuò)增相鄰的兩個(gè)已知序列的未知序列； (3)PCR產(chǎn)物測(cè)序與序列組裝: 通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)體系對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序、序列分析，將mtDNA D-1oop序列進(jìn)行組裝，獲得mtDNA D-1oop全序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，其特征是，步驟(1)中，所述綿羊mtDNA D-1oop全序列的獲得方法有三種:一種是從測(cè)序獲得的基因組文庫(kù)或轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中查找；另一種是從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的綿羊基因序列中查找；第三種是通過(guò)收集近緣種的mtDNA D-1oop全序列進(jìn)行同源比對(duì)，在保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，然后以藏羊的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序后獲得青藏高原14個(gè)藏羊地方品種636個(gè)個(gè)體mtDNA D-1oop全序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，其特征是，步驟(1)中，所述近緣種為摩弗倫羊、羱羊、盤羊、亞洲A型、歐洲B型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，其特征是，步驟⑵中，所述PCR引物和測(cè)序引物I對(duì)，其引物序列為:`
Forward primer:5’ -GGCTGGGACCAAACCTAT-3’
Reverse primer:5’ -GAACAACCAACCTCCCTAAG-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，其特征是，步驟(2)中，所述PCR方法中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30uL，包括基因組DNA模板2 uL、IOXBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA 聚合酶 0.2 uL、3 pM 上下游引物各 3 uL、滅菌雙蒸水16.8 uL ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5分鐘、94°C變性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36個(gè)循環(huán)、72°C延伸10分鐘；最后12°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，其特征是，步驟(3)中，所述PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)體系為5 uL，包括基因組DNA模板(30-50 ng) 3uL、3 pM測(cè)序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、滅菌雙蒸水0.5 uL ;PCR測(cè)序反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性2分鐘、95°C變性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25個(gè)循環(huán)、12°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，其特征是，步驟⑶中，所述PCR產(chǎn)物的測(cè)序方法為雙向、直接測(cè)序。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，其特征是，步驟(3)中，所述mtDNA D-1oop序列組裝方法是:以摩弗倫羊的mtDNA D-1oop全序列為參照物，將所有14個(gè)藏羊地方品種636個(gè)個(gè)體的mtDNA D-1oop序列進(jìn)行拼接，獲得青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種青藏高原藏羊mtDNAD-1oop全序列及檢測(cè)方法，其特征是，所述青藏高原藏羊mtDNA D-1oop全序列長(zhǎng)度的變化范圍為977_1259bp。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103865924SQ201410057019
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】劉建斌, 孫曉萍, 曾玉峰, 王凡, 郭健, 楊博輝, 岳耀敬, 張萬(wàn)龍, 郎俠, 馮瑞林, 郭婷婷, 牛春娥, 王宏博 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所