雞新城疫病毒、h9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的三重RT-PCR試劑盒及其應用。該試劑盒中含有用于鑒定或輔助鑒定NDV、AIVH9和APV的引物對組：引物對1（序列1和序列2），引物對2（序列3和序列4），和引物對3（序列5序列6）。實驗證明，本發(fā)明僅需一次PCR就能同時檢測和鑒別NDV、AIVH9和APV三種病原體，具有特異性強、靈敏度高、低成本、高效率等優(yōu)點；且本發(fā)明在引物設計上利用擴增片段長度的不同可直接判定擴增結(jié)果，更簡便、直觀和實用。本發(fā)明最低能同時檢出10pg?NDV?RNA、10pg?AIVH9RNA和10pg?APV?RNA，其敏感性為由這三種病毒引起的早期發(fā)病提供了快速準確的診斷結(jié)果，對預防和控制這三種病具有重要意義，對養(yǎng)雞業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展有重要的現(xiàn)實意義。
【專利說明】雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重RT-PCR試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及一種雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的三重RT-PCR試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002]雞新城疫病毒(NDV)、H9亞型禽流感病毒(Avian Influence virus subtype H9,AIV H9)和禽肺炎病毒(Avian pneumovirus，APV)是危害養(yǎng)雞業(yè)的三種主要病毒。雞新城疫病毒和禽肺炎病毒屬于副黏病毒科，新城疫病毒主要侵害雞上呼吸道，以咳嗽、呼吸啰音為主特征，嚴重時可引起大批死亡。禽肺炎病毒主要引起上呼吸道的癥狀，以噴嚏，眼結(jié)膜潮紅，淚腺腫，頭部出現(xiàn)皮下水腫，俗稱腫頭；產(chǎn)蛋雞感染主要引起產(chǎn)蛋下降2%-40%，孵化率降低；隨著病情的發(fā)展，還表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀。而H9亞型禽流感病毒是A型流感病毒，屬正粘病毒科流感病毒屬，病毒基因組為分節(jié)段的單股負鏈RNA，包含8個基因。H9亞型禽流感病毒感染的雞也會引起上呼吸道的癥狀，以咳嗽、呼吸啰音為特征，支氣管堵塞，嚴重時可引起雞大批死亡。這三種病毒引起雞的呼吸道癥狀在臨床上很相似，有時很難區(qū)分，容易混淆，主要表現(xiàn)在咳嗽，有呼吸啰音，有些雞頭部出現(xiàn)腫脹，流眼淚。
[0003]PCR技術由于具有敏感性高、特異性好、快速簡便等特點，已經(jīng)走進臨床診斷實驗室并廣泛應用于各種禽病病原體的檢測，包括用于NDV、AIV和APV的檢測。三重PCR是一種特殊的PCR形式，其突出特點是，一次PCR反應，能同時檢測并鑒別出三種病原體，在臨床上具有很高的應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的引物對組。
[0005]本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的引物對組(記為引物對組A)，由三個引物對組成，一個引物對是由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述雞新城疫病毒的引物對1，一個引物對是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述H9亞型禽流感病毒的引物對2，另一個引物對是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述禽肺炎病毒的引物對3。
[0006]其中，序列I由19個核苷酸組成；序列2由19個核苷酸組成；序列3由24個核苷酸組成；序列4由23個核苷酸組成；序列5由20個核苷酸組成；序列6由23個核苷酸組成。
[0007]所述引物對組中的所述引物對1、所述引物對2和所述引物對3在PCR反應體系中的摩爾比為1:1:1 ;所述引物對1、所述引物對2和所述引物對3中各引物對的兩條引物均
等摩爾。[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的試劑。
[0009]本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的試劑，由所述引物對組和RT-PCR擴增緩沖液組成。
[0010]所述RT-PCR擴增緩沖液中含有dNTPs、Mg2+、反轉(zhuǎn)錄隨機引物(如大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號:D3802)、反轉(zhuǎn)錄酶(如AMV反轉(zhuǎn)錄酶)、RNA酶抑制劑(如大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號:D2313A)和DNA聚合酶(如Ex Taq HS)。
[0011 ] 所述RT-PCR擴增緩沖液，具體由反轉(zhuǎn)錄緩沖液和PCR緩沖液組成。
[0012]其中，所述反轉(zhuǎn)錄緩沖液中含有所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄隨機引物、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述RNA酶抑制劑；所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄隨機引物、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述RNA酶抑制劑的配比為20nmoI:100nmol:25ymol:2.5U:20U。更加具體的，所述反轉(zhuǎn)錄緩沖液由IOmM dNTPs Mix (四種堿基，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D4030RA),5XRT buffer (含25mM Mg2+，AMV反轉(zhuǎn)錄酶中包含有該buffer，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D2620)，反轉(zhuǎn)錄隨機引物(50 μ mol/μ L，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D3802)，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/yL，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D2620), RNA酶抑制劑(40U/μ L，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D2313A)，按照體積比為2:4:0.5:0.5:0.5的比例混合后所得溶液。當然，使用其他公司的類似產(chǎn)品也可以。
[0013]所述PCR緩沖液中含有所述dNTPs、所述Mg2+和所述DNA聚合酶；所述dNTPs、所述Mg2+和所述DNA聚合酶的配比為IOnmol:25nmol:5U。更加具體的，所述的PCR緩沖液，為Premix Ex Taq Hot Start Version (2X )(內(nèi)含 IOmM dNTP Mixture, 25mM Mg2+, 5U/μ LTakara Ex Taq HS，大連`寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:R028A)。當然，使用其他公司的類似產(chǎn)品也可以。
[0014]本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的試劑盒。
[0015]本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的試劑盒，具體可含有下述a)和b):
[0016]a)作為陽性對照的雞新城疫病毒cDNA、H9亞型禽流感病毒cDNA和禽肺炎病毒cDNA ；
[0017]b)所述引物對組，或所述試劑。
[0018]所述試劑盒中還可以包括作為陰性對照的無RNA酶的水。
[0019]本發(fā)明的第四個目的是提供所述引物對組的制備方法。
[0020]本發(fā)明所提供的所述制備方法，包括將所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0021]本發(fā)明的第五個目的是提供如下c)或d)的應用:
[0022]c)所述引物對組在制備所述試劑，或所述試劑盒中的應用；
[0023]d)所述引物對組、或所述試劑，或所述試劑盒，在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有雞新城疫病毒、和/或H9亞型禽流感病毒、和/或禽肺炎病毒的產(chǎn)品中的應用。
[0024]在d)所述應用中，所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有雞新城疫病毒、和/或H9亞型禽流感病毒、和/或禽肺炎病毒為:用所述引物對組，或所述試劑，或所述試劑盒對所述待測樣品進行RT-PCR反應，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小確定所述待測樣品中是否含有雞新城疫病毒、和/或H9亞型禽流感病毒、和/或禽肺炎病毒。
[0025]所述進行RT-PCR反應的退火溫度可為50°C -60°C，最佳退火溫度為55°C。
[0026]進一步，進行所述RT-PCR反應的程序具體可為:首先進行反轉(zhuǎn)錄:42°C 60min ；95 V 5min, 4 °C 結(jié)束反應；然后進行 PCR 擴增:95 V 變性 5min ；95 V Imin, 55 V Imin,720C lmin，共進行35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，于8°C結(jié)束反應。
[0027]在d)所述應用中，所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有雞新城疫病毒、和/或H9亞型禽流感病毒、和/或禽肺炎病毒時，所述引物對組中的六條引物在反應體系中的終濃度均可為0.5 μ mol/ μ L。
[0028]在本發(fā)明中，進行所述的RT-PCR反應的體系，具體為如下反轉(zhuǎn)錄體系和PCR擴增體系: [0029]反轉(zhuǎn)錄體系(20yL):AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/yL，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D2620) 0.5yL;RNA酶抑制劑(40U/yL，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D2313A) 0.5μ L ;隨機引物(50μΜ/μ L，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D3802)0.5μ L5IOmM dNTPs Mix (四種堿基，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D4030RA)2μ L ；5XRT buffer (含25mM Mg2+，AMV反轉(zhuǎn)錄酶中包含有該buffer，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:D2620) 4μ L ;模板(RNA) 2μ L (約20yg) ;DEPC水補足20 μ L。
[0030]PCR 擴增體系(25 μ L):Premix Ex Taq Hot Start Version (2X )(內(nèi)含 IOmMdNTP Mixture, 25mM Mg2+, 5U/ μ L Takara Ex Taq HS，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號:R028A) 12.5 μ L ;模板(反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA或DNA)2 μ L (約20 μ g);所述引物對組中的六條引物在反應體系中的終濃度均為0.5 μ mol/μ L ;超純水補足25 μ L。
[0031]在d)所述應用中，所述根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小確定所述待測樣品中是否含有雞新城疫病毒、和/或H9亞型禽流感病毒、和/或禽肺炎病毒，具體如下:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為247bp (序列表中序列7的第891-1137位)的DNA片段，則所述待測樣品中含有或候選含有雞新城疫病毒，反之則所述待測樣品中不含有或候選不含有雞新城疫病毒；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為569bp (序列表中序列8的第518-1086位)的DNA片段，則所述待測樣品中含有或候選含有H9亞型禽流感病毒，反之則所述待測樣品中不含有或候選不含有H9亞型禽流感病毒；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為424bp (序列表中序列9的第753-1176位)的DNA片段，則所述待測樣品中含有或候選含有禽肺炎病毒，反之則所述待測樣品中不含有或候選不含有禽肺炎病毒。
[0032]在d)所述應用中，所述待測樣品可來自健康的動物或死亡的動物，可為RNA和/或 DNA。
[0033]本發(fā)明的第六個目的是提供用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的引物對組或用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的引物對2。
[0034]本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的引物對組(記為引物對組B)，由兩個引物對組成，一個引物對是由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述雞新城疫病毒的引物對1，另一個引物對是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述H9亞型禽流感病毒的引物對2。
[0035]本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的引物對2，由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成。
[0036]所述引物對組中的所述引物對I和所述引物對2在PCR反應體系中的摩爾比為1:1 ;所述引物對I和所述引物對2中各引物對的兩條引物均等摩爾。所述引物對2中的兩條引物等摩爾。
[0037]本發(fā)明的第七個目的是提供如下e)或f)的應用:
[0038]e)所述引物對組B在制備鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有雞新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應用。
[0039]f )所述引物對2在制備鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有H9亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應用。
[0040]在所述應用中，所述待測樣品可來自健康的動物或死亡的動物，可為RNA和/或DNA。
[0041]在本發(fā)明中，以上所有的所述雞新城疫病毒均具體可為雞新城疫病毒Lasota株、雞新城疫病毒F48E9株或雞新城疫病毒GX7/02 ；以上所有的所述H9亞型禽流感病毒均具體可為H9H2亞型禽流感病毒；所述H9N2亞型禽流感病毒具體可為A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)、A/Duck/Guangxi/RX/2009(H9N2)、A/Chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)或A/Chicken/Guangxi/066C10/2010 (H9N2)。以上所有的所述禽肺炎病毒均具體可為禽肺炎病毒APV/MN株。
`[0042]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0043]針對目前缺乏同時對雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒進行區(qū)分鑒別檢測和診斷的有效可靠的技術，發(fā)明人研究設計了三對特異性引物，據(jù)此建立了雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的的三重RT-PCR檢測方法，并制備了相應的檢測試劑盒。實驗證明，應用本發(fā)明所提供的試劑盒僅需一次PCR反應就能同時檢測和鑒別雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒三種病原體，具有特異性強、靈敏度高、低成本、高效率等優(yōu)點；而且本發(fā)明在引物設計上利用擴增片段長度的不同可直接判定擴增結(jié)果，更簡便、直觀和實用。本發(fā)明的待測樣品可來自健康動物或死亡動物，可為RNA和/或DNA，最低能同時檢出IOpg雞新城疫病毒RNA、10pgH9亞型禽流感病毒的RNAUOpg禽肺炎病毒RNA，這為由這三種病毒引起雞的疾病(尤其是發(fā)病早期)提供了準確的診斷結(jié)果，對切斷其傳播途徑有重要意義，具有廣闊的應用前景，對養(yǎng)雞業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要的現(xiàn)實意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1為三重RT-PCR的靈敏度試驗結(jié)果電泳圖。圖中:M為分子量標準IOObp DNAladder ；1 為 IOOng NDVUOOng AIV H9 和 IOOng APV RNA ;2 為 IOng NDVUOng AIVH9 和IOng APV RNA ;3 為 Ing NDVUng AIV H9 和 Ing APV RNA ;4 為 IOOpg NDVUOOpg AIV H9 和IOOpg APV RNA ；5 為 IOpg NDVUOpg AIV H9 和 IOpg APV RNA ；6 為 Ipg NDVUpg AIV H9和 Ipg APV RNA ；7 為 IOOfg NDVUOOfg AIV H9 和 IOOfg APV RNA。
[0045]圖2為三重RT-PCR的特異性試驗結(jié)果電泳圖。圖中:M為分子量標準IOObp DNAladder ; I 為 NDV(Lasota)RNA ;2 為 APV RNA ;3 為 AIV(A/Chicken/Guangxi/LF/2007 (H9N2))RNA ；4為NDV (Lasota) RNA和APV RNA的混合模板(模板摩爾比1:1) ;5為AIV CA/Chicken/Guangxi/LF/2007 (H9N2) ) RNA 和 APV RNA 的混合模板(模板摩爾比 1:1) ;6 為 NDV(Lasota) RNA、AIV (A/Duck/Guangxi/RX/2009 (H9N2) ) RNA 和 APV RNA 的混合模板(模板摩爾比 1:1:1) ;7 為 NDV (F48E9) RNA、AIV (A/Chicken/Guangxi/067C4/2010 (H9N2) ) RNA和 APV RNA 的混合模板(模板摩爾比 1:1:1) ;8 為 NDV (GX7/02) RNA、AIV (A/Chicken/Guangxi/066C10/2010 (H9N2) ) RNA 和 APV RNA 的混合模板(模板摩爾比 1:1:1) ;9 為雞傳染性支氣管炎病毒(Mass41)RNA ；10為禽腦脊髓炎病毒(AE Van) RNA ；11為禽呼腸孤病毒(Reo SI 133) RNA ；12為雞傳染性喉氣管炎病毒(北京株)DNA ；13為雞馬立克氏病(MDV)疫苗毒DNA ；14為雞毒霉形體(MG) DNA ；15為禽大腸桿菌(E.coli 02)DNA。
[0046]圖3為三重RT-PCR對臨床樣品檢測結(jié)果電泳圖。圖中:M為分子量標準IOObp DNAladder ;1 為 NDV (Lasota) RNA ；2 為 APV/MN RNA ；3 為 AIV H9N2 (A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA ;4 為 NDV Lasota RNA.APV/MN RNA和AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA的混合模板(模板摩爾比1:1:1) ;5為陰性對照(正常雞肺、氣管組織RNA) ；6為臨床樣品C20120427RNA ；7為臨床樣品C20120820RNA ；8為臨床樣品C20130504RNA ；9為臨床樣品C20130516RNA ; 10為臨床樣品C20130727RNA ;11為臨床樣品C20120314RNA ;12為臨床樣品C2013081IRNA ; 13為臨床樣品C20130715RNA ;14為臨床樣品C20130928RNA ;15為臨床樣品C20131016RNA ；15 為臨床樣品 C20131018RNA。
【具體實施方式】
[0047]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049]下述實施例中所用一些材料和試劑如下:
[0050]PCR儀為Bio-rad公司產(chǎn)品；DNA片斷膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；RT-PCR試劑、pMD18-T試劑盒購自大連寶生物工程(TaKaRa)公司；TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。
[0051]禽肺炎病毒APV/MN株:記載于“謝志勤等，環(huán)介導等溫可視擴增(LAMP)檢測禽肺炎病毒方法的建立.中國動物檢疫，2013，30 (3):48-51” 一文，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0052]雞新城疫病毒(Lasota)、雞新城疫病毒(F48E9):記載于“唐小飛等，多重RT-PCR快速檢測鑒別新城疫病毒強毒株和弱毒疫苗株方法的建立.中國獸醫(yī)科技，2005，35 (11):888-891” 一文，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0053]雞新城疫病毒分離株GX7/02:記載于“唐小飛等，新城疫病毒廣西分離株F基因的克隆和序列分析，中國獸醫(yī)科技，2005，35 (5):333-340" 一文，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0054]H9 亞型禽流感病毒的四種分離株，即 A/Chicken/Guangxi/LF/2007(H9N2)、A/Duck/Guangxi/RX/2009 (H9N2)、A/Chicken/Guangxi/067C4/2010 (H9N2)、A/Chicken/Guangxi/066C10/2010 (H9N2):均記載在 “Peng Yi (彭宜)等，Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay, Virology Journal,2011Jul5;8:337，，一文，公眾可從廣
西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0055]禽腦脊髓炎病毒(AE Van)、雞傳染性支氣管炎病毒(Mass41)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV，北京株)、禽呼腸孤病毒(Reo S1133)、禽大腸桿菌(E.coli 02)、雞毒霉形體(MG):記載于 “Zhiqin Xie (謝志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chainreaction to detect avian Encephalomyelitis virus.Avian Disease (美國禽病雜志)，2005，49:227-230”、“謝志勤等，應用二溫式多重PCR技術鑒別雞傳染性支氣管炎病毒和雞傳染性喉氣管炎病毒.廣西科學，2001，8 (2):152-153”和“何士軍，黃燁，唐順發(fā).雞毒霉形體病(MG)免疫防治對策.2005年23期”中，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。
[0056]雞馬立克氏病(MDV)疫苗毒購自南京梅里亞動物保健品公司。
[0057]實施例1、引物的設計與合成
[0058]根據(jù)GenBank中雞新城疫病毒F基因(GenBank:JX840454.1，序列表中序列7)H9亞型禽流感病毒HA基因(GenBank JF715045.1，序列表中序列8)和禽肺炎病毒F基因(GenBank:AF187154，序列表中序列9)的保守序列，應用DNAStar引物設計軟件進行引物設計，設計的引物在GenBank中通過Blast比對進行驗證，最后確定并合成了 3對分別擴增AIV H9和APV的特異性引物(表1)。
[0059]表1鑒定NDV、AIV H9和APV的引物寡核苷酸序列
【權(quán)利要求】
1.用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的引物對組，其特征在于:所述引物對組由三個引物對組成，一個引物對是由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述雞新城疫病毒的引物對1，一個引物對是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述H9亞型禽流感病毒的引物對2，另一個引物對是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述禽肺炎病毒的引物對3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對組，其特征在于:所述引物對組中的所述引物對1、所述引物對2和所述引物對3在PCR反應體系中的摩爾比為1:1:1 ;所述引物對1、所述引物對2和所述引物對3中各引物對的兩條引物均等摩爾。
3.用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的試劑，由權(quán)利要求I或2所述的引物對組和RT-PCR擴增緩沖液組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于:所述RT-PCR擴增緩沖液中含有dNTPs、Mg2+、反轉(zhuǎn)錄隨機引物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和DNA聚合酶。
5.用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒的試劑盒，含有下述a)和b): a)作為陽性對照的雞新城疫病毒cDNA、H9亞型禽流感病毒cDNA和禽肺炎病毒cDNA； b)權(quán)利要求1或2所述引物對組，或權(quán)利要求3或4所述的試劑。
6.權(quán)利要求1或2所述引物對組的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括將權(quán)利要求I或2所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
7.如下c)或d)的應用: c)權(quán)利要求1或2所述引物對組在制備權(quán)利要求3或4所述試劑，或權(quán)利要求5所述試劑盒中的應用； d)權(quán)利要求1或2所述引物對組、或權(quán)利要求3或4所述試劑，或權(quán)利要求5所述試劑盒，在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有雞新城疫病毒、和/或H9亞型禽流感病毒、和/或禽肺炎病毒的產(chǎn)品中的應用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于:d)所述應用中，所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有雞新城疫病毒、和/或H9亞型禽流感病毒、和/或禽肺炎病毒為:用權(quán)利要求I或2所述的引物對組，或權(quán)利要求3或4所述的試劑，或權(quán)利要求5所述的試劑盒對所述待測樣品進行RT-PCR反應，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小確定所述待測樣品中是否含有雞新城疫病毒、和/或H9亞型禽流感病毒、和/或禽肺炎病毒； 所述進行RT-PCR反應的退火溫度為50°C -600C。
9.用于鑒定或輔助鑒定雞新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的引物對組，由兩個引物對組成，一個引物對是由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述雞新城疫病毒的引物對1，另一個引物對是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的用于鑒定或輔助鑒定所述H9亞型禽流感病毒的引物對2 ;或 用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的引物對2，由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成。
10.權(quán)利要求9所述的引 物對組在制備鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有雞新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中的應用；或權(quán)利要求9所述引物對2在制備鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有H9亞型禽流感病毒的產(chǎn)品中 的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103805719SQ201410057222
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】謝芝勛, 謝志勤, 劉加波, 龐耀珊, 鄧顯文, 謝麗基, 范晴, 羅思思 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所