一種死谷芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種死谷芽孢桿菌（Bacillus?vallismortis）SZ-4，其保藏號(hào)為CGMCC?No.8273。所述菌株在牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落圓形、乳白色、中心稍隆起、表面濕潤(rùn)、透明；鏡檢呈桿狀，具鞭毛，大小為0.7～0.82×1.6～2.2μm，G+，有芽孢；在含有2%～5%的NaCl的牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)；所述的牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂17g，水1000ml，pH6.8～7.2。死谷芽孢桿菌SZ-4對(duì)引起人參根腐病、疫病、菌核病和灰霉病的病原菌均具有顯著拮抗作用。本發(fā)明還提供死谷芽孢桿菌SZ-4在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的應(yīng)用。
【專利說明】一種死谷芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種死谷芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人參(Panax ginsengC.A.Mey)為五加科人參屬多年生宿根陰性雙子葉藥用植物，是我國(guó)的名貴藥材，有“百草之王”的美譽(yù)。人參在中國(guó)、韓國(guó)、朝鮮、俄羅斯等國(guó)家有大面積種植，其中，中國(guó)東北是人參的主產(chǎn)區(qū)，已成為當(dāng)?shù)氐闹匾еa(chǎn)業(yè)之一。人參的長(zhǎng)期人工種植和品種選育難度大導(dǎo)致人參種質(zhì)退化、病害嚴(yán)重、質(zhì)量差、產(chǎn)量低?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，降低了人參藥材的安全性和商品價(jià)值。病害防控問題已成為制約人參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大問題之一。[0003]人參病害約有20~40種，其中，以下4類病原菌是導(dǎo)致人參常見病并限制人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病原菌:由腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)引起的人參根腐病一般發(fā)病率在30%左右，嚴(yán)重時(shí)六年生人參根腐病造成的死亡率可達(dá)50%-80%，主要危害幼苗根部和根莖部(地表以下莖部)，腐爛的參根呈黑褐色濕腐狀，后期糟朽狀，僅存中空的根皮；由惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)引起的人參疫病發(fā)病率可達(dá)70%,其癥狀為發(fā)病輕時(shí)葉片上產(chǎn)生不規(guī)則的暗綠色斑，重者莖葉枯萎，根部腐爛，植株成片枯死，減產(chǎn)嚴(yán)重；由人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)引起的人參菌核病主要危害3年生以上參根，發(fā)病部位為芽苞、根和根莖，參根被害后，初期在表面生少許白色絨狀菌絲體，以后，內(nèi)部迅速腐敗、軟化，細(xì)胞全部被消解殆盡，只留下壞死的外表皮，表皮內(nèi)外形成許多鼠糞狀的菌核；由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的人參灰霉病發(fā)病初期在參根的芽胞上出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，從參根主根的外表上看不出異?，F(xiàn)象，但用手掐時(shí)，參根內(nèi)部的組織已變軟，發(fā)病后期芽孢和主根都表現(xiàn)為軟腐癥狀，并在病部產(chǎn)生灰色的絨毛狀霉層，有時(shí)可在病根上形成黑色的菌核。
[0004]化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到了十分重要的作用。但長(zhǎng)期連續(xù)地使用化學(xué)農(nóng)藥，已造成一系列嚴(yán)重后果，如殺傷害蟲天敵，并造成病菌、害蟲產(chǎn)生抗藥性，環(huán)境嚴(yán)重污染，人類健康受到威脅。而生物防治以生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)控制有害生物，避免了化學(xué)農(nóng)藥使用帶來的一系列植保、環(huán)境和能源方面的問題，避免了農(nóng)藥殘留對(duì)人畜的危害，并促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。利用人參根際土篩選出的大量有益微生物可調(diào)節(jié)改善土壤微環(huán)境，具有拮抗效果的微生物亦可對(duì)人參土傳病害進(jìn)行生物防治。近年來，以拮抗細(xì)菌防治植物病害取得了較大的進(jìn)展。在國(guó)外用放射土壤桿菌k84菌系防治果樹的根癌病是最成功的例子，并且已商品化。美國(guó)報(bào)道，用草生歐氏桿菌防治梨火疫病的效果與鏈霉素相當(dāng)。江蘇省農(nóng)科院植保所利用枯草芽孢桿菌，成功地開發(fā)出防治水稻紋枯病和稻曲病的生物殺菌劑，該項(xiàng)產(chǎn)品已進(jìn)入農(nóng)藥市場(chǎng)，推廣面積累計(jì)超過5000萬畝。其他報(bào)道的細(xì)菌殺菌劑還有用來防治黃瓜及煙草炭疽病菌的地衣芽孢桿菌，防治棉花枯萎病、甘藍(lán)黑腐病的枯草芽孢桿菌，以及防治水稻紋枯病的假單孢菌等。由于細(xì)菌的種類多、數(shù)量大、繁殖速度快，且易于人工培養(yǎng)和控制，因此，細(xì)菌生防殺菌劑的研究和開發(fā)具有較大的前景。
[0005]拮抗細(xì)菌是否發(fā)揮其生防作用，主要取決于是否能有效的定殖。[0006]芽孢桿菌由于具有抑制植物病害的能力，又是自然界中廣泛存在的非致病細(xì)菌，對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境，因而備受關(guān)注。目前，已應(yīng)用的生防細(xì)菌芽孢桿菌主要有枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽抱桿菌(Bacillus methylotrophicus)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)等。國(guó)內(nèi)已開發(fā)成功并投入生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌商品制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、依天得、根腐消等。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)共同研制的微生物農(nóng)藥百抗(10億個(gè)/g活芽孢枯草芽孢桿菌可濕性粉劑)獲得農(nóng)業(yè)部登記注冊(cè)，已在多個(gè)省推廣使用，推廣面積約4667hm2，主要防治水稻紋枯病、三七根腐病、煙草黑脛病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢桿菌B908，百抗對(duì)水稻紋枯病防效70%以上，其抑菌機(jī)制為營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、位點(diǎn)占領(lǐng)等。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的麥豐寧是由枯草芽孢桿菌菌株B3制成的活體生物殺菌劑，對(duì)小麥紋枯病田間防效達(dá)50%~80%，其防病機(jī)制主要表現(xiàn)在產(chǎn)生抑制小麥紋枯病病菌菌絲生長(zhǎng)、菌核形成和菌核萌發(fā)的抗菌物質(zhì)。
[0007]芽孢桿菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其種類多分布廣，是土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)種群。該類微生物通過分泌抗生物質(zhì)和生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)，在防治植物病害方面發(fā)揮多種有益作用。目前尚未見利用死谷芽孢桿菌防治人參真菌性病害專利報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在 于，針對(duì)人參生產(chǎn)上的主要真菌性病害，尤其是人參土傳病害發(fā)生面積日益擴(kuò)大，化學(xué)藥劑防治除易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留外，防效也不理想的實(shí)際情況，提出一種死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株SZ-4及其在防控人參根腐病(由腐皮鐮孢菌Fusarium solani引起)、人參疫病(由惡疫霉菌Phytophthora cactorum引起)、人參菌核病(由人參核盤菌Sclerotinia schinseng引起)和人參灰霉病(由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起)上的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明提供了一種防控上述人參根腐病、疫病、菌核病和灰霉病的死谷芽孢桿菌SZ-4，該菌株的保藏名稱為死谷芽孢桿菌SZ-4，分類命名為Bacillus vallismortis SZ-4,保藏單位為:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期:2013年9月25日，保藏編號(hào):CGMCC N0.8273，其16SrDNA序列長(zhǎng)度為1454bp，具體如SEQ ID No:1所示。應(yīng)用BLAST軟件和DNAMAN軟件等進(jìn)行分析，將所測(cè)16SrDNA序列通過BLAST比對(duì)，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與SZ-4菌株相似性最高的是Bacillus vallismortis,同源性達(dá)到99%。根據(jù)MEGA5.10Beta2軟件以UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),SZ-4與Bacillus vallismortis同屬一個(gè)遺傳分枝，親緣關(guān)系十分接近，親源性達(dá)到了 99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化性狀的鑒定結(jié)果，可以確認(rèn)本發(fā)明的菌株SZ-4為死谷芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)。
SEQ ID No:1 如下:
CGGGGGCTGC GTGCTAATAA TGCAAGTCGA GCGGACAGAT
GGGAGCTTGC TCCCTGATGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA
ACACGTGGGT AACCTGCCTG TAAGACTGGG ATAACTCCGG
GAAACCGGGG CTAATACCGG ATGGTTGTTT GAACCGCATG
【權(quán)利要求】
1.一種死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)SZ-4,其特征在于,其保藏號(hào)為CGMCCN0.8273。
2.如權(quán)利要求1所述的死谷芽孢桿菌SZ-4，其特征在于， 該菌株在牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落圓形、乳白色、中心稍隆起、表面濕潤(rùn)、透明；鏡檢呈桿狀，具鞭毛，大小為0.7~0.82 X 1.6~2.2μ m，G+，有芽孢。其能在25°C~40°C的溫度下生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為32°C ;其生長(zhǎng)pH范圍為6.5~7.5，最適生長(zhǎng)pH為6.8 ; 需氧生長(zhǎng)。硝酸鹽還原反應(yīng)生成紅色化合物；接觸酶測(cè)定、脂肪酶反應(yīng)為陰性；酪蛋白、酪氨酸反應(yīng)呈陽性；能利用D-葡萄糖、D-木糖；淀粉水解試驗(yàn)鏡檢有糊精生成；明膠液化試驗(yàn)呈陽性。檸檬酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)基呈堿性(藍(lán)色)。V-P (pH7.0)測(cè)定生成紅色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇檢測(cè)呈陽性；在含有2%~5%的NaCl的牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。 所述的牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基的配方為:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0gJlC月旨 17g，水 1000mL, ρΗ6.8 ~7.2。
3.如權(quán)利要求1或2所述的死谷芽孢桿菌SZ-4在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為人參。 優(yōu)選地，所述真菌為引起人參根腐病的腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、引起人參疫病的惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)、引起人參菌核病的人參核盤菌(Sclerotiniaschinseng)和引起人參灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中的一種或多種。
5.一種微生物制劑，其特征在于，含有死谷芽孢桿菌SZ-4的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物和死谷芽孢桿菌SZ-4的孢子。
6.如權(quán)利要求5所述的微生物制劑，其特征在于，其是通過以下制備方法制備得到的: (O將如權(quán)利要求1所述的死谷芽孢桿菌SZ-4試管種接種于用1000mL三角瓶裝的300mL肉膏蛋白胨酵母膏(BPY)培養(yǎng)液中，在180r/min，32°C下培養(yǎng)24小時(shí)，獲得發(fā)酵菌液； (2)將發(fā)酵菌液在以種子罐體積15%接種于種子罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，種子罐的溫度30~34°C，接種發(fā)酵菌液4小時(shí)后，每隔2小時(shí)對(duì)種子罐中的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測(cè)，直到發(fā)酵液菌體生長(zhǎng)比較飽滿即將出現(xiàn)芽孢時(shí)，獲得發(fā)酵菌種，種子罐中的發(fā)酵時(shí)間為12~16小時(shí)； (3)將種子罐中發(fā)酵菌種的10%接種于發(fā)酵罐中的BPY培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵罐的溫度30~34°C，接種發(fā)酵菌種4小時(shí)后，每隔2小時(shí)對(duì)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測(cè)，觀察菌含量，直到發(fā)酵罐中發(fā)酵液中的最終培養(yǎng)物(包含菌和芽孢)生物量為109cfu/mL以上、芽孢含量大于或等于90%時(shí)，立即將發(fā)酵液出罐進(jìn)行分裝，獲得SZ-4微生物制劑；發(fā)酵罐中的發(fā)酵時(shí)間為24~36小時(shí)。
7.如權(quán)利要求6所述的微生物制劑，其特征在于，所述的BPY培養(yǎng)液的配方為:牛肉膏5g,蛋白胨IOg,酵母浸膏5g，葡萄糖5g, NaC15g,蒸懼水1000mL, pH6.8~7.0 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的配方以重量百分比計(jì)為:豆餅粉2.0%，淀粉1.5%，酵母浸膏0.5%，玉米漿0.5%，NaCl0.5%, KH2PO40.2%，MgSO4.7H200.2%, MgSO4.H2O0.5%，Ca (HCO3) 20.2%，余量為水，ρΗ6.5 ~7.0。優(yōu)選地，所述的BPY培養(yǎng)液通過如下方法配制:稱取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl放入1000mL蒸餾水中，充分混勻后將pH調(diào)整至6.8~7.0, 1000mL三角瓶中裝量為300mL，用雙層封口膜封好三角瓶口，121°C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后備用。 優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液通過如下方法配制:在種子罐中加入所需的水，按比例加入豆餅粉、淀粉、酵母浸膏、玉米漿、NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H20、MgSO4.H2O, Ca(HCO3)2，充分?jǐn)嚢瑁瑢l(fā)酵培養(yǎng)液PH調(diào)整到6.5~7.0，密封加料孔，用高溫蒸汽滅菌2小時(shí)，冷卻后立即接種。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的微生物制劑，其特征在于， 在種子罐或發(fā)酵罐的發(fā)酵中，當(dāng)出現(xiàn)較多泡沫時(shí)，加入消泡劑，所述的消泡劑為有機(jī)娃，加入量以種子--或發(fā)酵--中的泡沫不&出為準(zhǔn)；發(fā)酵中發(fā)酵完成后，在發(fā)酵te中加入占罐中液體總體積萬分之二的苯甲酸防腐劑，攪拌均勻，任選地，再出罐進(jìn)行分裝。
9.如權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的微生物制劑在防治人參真菌病害中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述真菌為引起人參根腐病的腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、引起人參疫病的惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)、引起人參菌核病的人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)和引起人參灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)中的一種或多種。 優(yōu)選地，在人參真菌性病害發(fā)病初期，將所述微生物制劑的稀釋液均勻地施加到土壤中，所述的稀釋液中微 生物制劑與水的稀釋體積比為1:200。 更優(yōu)選地，所述的稀釋液中還添加了助劑有機(jī)硅，所述助劑有機(jī)硅與稀釋液的體積比為 1:5000。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK103952329SQ201410045778
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月8日
【發(fā)明者】楊利民, 孫卓, 韓梅, 韓忠明 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)