一種檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的方法及其裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的方法及其裝置，所述裝置包括底座和與底座相配合的蓋子，底座的頂面凹設(shè)有樣本室、引誘室和對照室，其中，引誘室和對照室之間通過第二通道相連，樣本室與第二通道的中點之間通過第一通道相連，第二通道的長度為8～15cm，第一通道的長度為5～8cm；在第二通道的中點兩側(cè)，所述第二通道內(nèi)均勻設(shè)置有隔欄，隔欄將第二通道分成若干個分隔室，隔欄的高度小于第二通道的高度。通過模擬女性生殖器官的相對解剖學(xué)位置，模擬精子在女性生殖道內(nèi)的自然選擇過程；一方面通過長距離的運動淘汰掉活動力差的精子；另一方面在分隔室內(nèi)填裝化學(xué)引誘劑，對精子的化學(xué)趨向性進行檢測。
【專利說明】一種檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的方法及其裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于輔助生殖【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的方法及其裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]輔助生殖技術(shù)是指對配子、胚胎或者基因物質(zhì)進行體內(nèi)外系統(tǒng)操作而獲得新生命的技術(shù)。采用輔助生殖技術(shù)不僅可以治療玉至不育癥，而且可以通過該技術(shù)觀察胚胎發(fā)育過程，揭示生殖奧秘，從而使生殖醫(yī)學(xué)成為21世紀生命科學(xué)研究的核心。
[0003]輔助生殖技術(shù)中，篩選形態(tài)功能正常、無遺傳缺陷的精子是必需步驟。常規(guī)的精子分離篩選技術(shù)包括上游法、遷移沉淀法、密度梯度離心法、玻璃棉過濾法、玻璃法、交聯(lián)葡聚糖柱法和跨膜遷移法等多種。其原理主要是基于精子活動，粘附或過濾，目的是為了獲得運動的或形態(tài)正常精子，分離出能體外受精的精子。
[0004]但常規(guī)的精子篩選技術(shù)忽視了女性生殖道對精子的自然選擇過程，人類在受精過程中，數(shù)以百萬計的精子經(jīng)過射精儲存在宮頸附近陰道上部，然后精子游出精漿，進入高度水化的宮頸粘液，在此處通過形態(tài)和活力進行精子選擇；隨后，精子通過子宮運輸，并利用其活力和及時獲能的特征進行選擇，功能不良的精子被淘汰；通過競爭激烈角逐的精子最終到達輸卵管峽部；在輸卵管峽部和卵丘位置，精子可利用熱趨向性、化學(xué)趨向性反應(yīng)和DNA完整性進行選擇；最后，精子再經(jīng)過形態(tài)選擇后通過卵丘細胞，在輸卵管的壺腹部與卵母細胞的透明帶結(jié)合受精；此外，精子還可通過透明帶結(jié)合能力和DNA的完整性進行選擇。
[0005]由于沒經(jīng)過在女性生殖道內(nèi)獲得相關(guān)功能或遺傳質(zhì)量的篩選，對DNA損傷或凋亡的精子無法區(qū)分去除，特別在ICSI情況下，正常受精時不會與卵子結(jié)合的精子也可能被注入，從而損傷卵母細胞激活和胚胎核發(fā) 育；由于DNA損傷的精子也可與卵母細胞受精，會導(dǎo)致反復(fù)自然流產(chǎn)?？傊?，常規(guī)分離方法獲得的精子具有明顯的局限性。
[0006]而目前TUNEL檢測、SCSA檢測、COMET測定、Halosperm測定等確定DNA損傷的方法對于用于輔助生殖的精子來說都是侵入性的、破壞性的，即被分析測定的精子不可再用于受精。因而，目前亟需發(fā)展區(qū)分性好、對精子而言相對安全、非侵入性的精子分離篩選方法。
[0007]在受精過程，卵子通過釋放化學(xué)因子吸引精子，化學(xué)引誘物(化學(xué)因子)的濃度梯度可以指引精子游向卵子，這個過程稱為化學(xué)趨向性(chemotaxis)。利用化學(xué)趨向性篩選精子符合其在女性生殖道內(nèi)的自然選擇過程；由于化學(xué)趨向性涉及到精子生理狀態(tài)的信號傳導(dǎo)過程，而這一過程是否順利又可反映精子各項功能是否正常發(fā)揮，更可能篩選分離出功能正常的精子，更好地區(qū)分出異常的精子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明公開了一種用于檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的裝置，利用該裝置能對人精子的活動力和化學(xué)趨向性進行有效評價，并篩選得到功能正常的精子。[0009]一種用于檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的裝置，包括底座和與底座相配合的蓋子，底座的頂面凹設(shè)有樣本室、引誘室和對照室，其中，引誘室和對照室之間通過第二通道相連，樣本室與第二通道的中點之間通過第一通道相連，第二通道的長度為16~30cm，第一通道的長度為5~8cm ；
[0010]在第二通道的中點兩側(cè)，所述第二通道內(nèi)均勻設(shè)置有隔欄，隔欄將第二通道分成若干個分隔室，隔欄的高度小于第二通道的高度。
[0011]本裝置采用透明、硬度強、耐高溫、耐腐蝕、無毒無熱原的高分子材料制成，整個裝置模擬了女性生殖器官的相對解剖學(xué)位置，其中第一通道模擬女性子宮，第二通道模擬兩條輸卵管，引誘室、對照室則模擬了兩個卵巢。
[0012]本發(fā)明中，第二通道可以是呈水平的直線形，也可以是呈一定弧度的弧形。
[0013]樣本室、引誘室、對照室和第一通道、第二通道均是凹設(shè)在底座頂面的，與凸設(shè)在底座頂面相比，凸設(shè)在底座頂面不僅便于制作加工，而且由于結(jié)構(gòu)較為精細，便于保存，凸設(shè)則易于遭到損傷。
[0014]隔欄的高度小于第二通 道的高度，則分隔室的高度低于第二通道的高度，便于在分隔室上層導(dǎo)入精子培養(yǎng)液，保證精子存活和自由游動。
[0015]樣品室內(nèi)的精子若能在預(yù)定時間內(nèi)穿過第一通道和第二通道到達引誘室或?qū)φ帐?，則說明精子活動力較好；位于引誘室一側(cè)的分隔室用于固定不同濃度的化學(xué)引誘劑，形成濃度梯度，誘使樣品室內(nèi)的精子向引誘室運動，若大部分精子都游向引誘室而不是對照室，則說明精子化學(xué)趨向性較好。
[0016]作為優(yōu)選，第二通道的長度為16cm，第一通道的長度為6cm。如此長度的第二通道正好相當于兩條正常女性輸卵管的長度，以及如此長度的第一通道正好相當于子宮的長度，更好地模擬女性生殖道對精子的自然選擇過程。
[0017]作為優(yōu)選，在第二通道的中點兩側(cè)，所述分隔室均至少有三個。更優(yōu)選為4~5個，便于多設(shè)置幾個引誘劑濃度，更好地引誘精子。
[0018]作為優(yōu)選，所述第一通道或第二通道的高度為I~3cm，所述隔欄的高度為2~4_。更優(yōu)選地，第一通道或第二通道的高度為2cm，隔欄的高度為3_。為精子游動提供更大的空間。
[0019]并且，第二通道的寬度從第二通道的中點至引誘室、對照室逐漸變大，即第二通道呈“中間窄、兩端寬”。其中，最窄處的寬度為0.5~1mm，最寬處的寬度為2~2.5mm。而第一通道的寬度從第二通道的中點至樣品室逐漸變小。樣本室、引誘室和對照室均為圓柱形，圓柱的高為I~2cm，圓柱的底面直徑為5~10_。如此裝置就更逼真地模擬了女性生殖道的形狀，能更好地模擬女性生殖道對精子的自然選擇過程。
[0020]作為優(yōu)選，所述第二通道的兩端均插設(shè)有隔板，隔板的高度不小于第二通道的高度。隔板為可拆卸式，當預(yù)定的精子游動時間結(jié)束后，才插入隔板，對引誘室和對照室內(nèi)的精子濃度進行檢測，避免精子在檢測過程中離開引誘室或?qū)φ帐摇?br> [0021]本發(fā)明還提供了利用所述裝置檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的方法，包括:
[0022](I)將化學(xué)引誘劑固定在位于引誘室一側(cè)的分隔室中，使用單一化學(xué)引誘劑濃度，或使分隔室內(nèi)化學(xué)引誘劑的濃度從第二通道的中點至引誘室依次變大；
[0023]作為優(yōu)選，化學(xué)引誘劑的固定方法為:配制含不同濃度化學(xué)引誘劑的瓊脂基質(zhì)，加到對應(yīng)的分隔室中，待凝固后即完成固定。待步驟(2)中向各室道中加入精子培養(yǎng)液后，瓊脂中化學(xué)引誘劑分子隨即逸出至精子培養(yǎng)液，若各分隔室中含有相同濃度的化學(xué)引誘劑，則化學(xué)引誘劑濃度梯度的形成較為緩慢，因此優(yōu)選為在各分隔室中加入不同濃度的化學(xué)引誘劑，使化學(xué)引誘劑分子的逸出過程既是化學(xué)引誘劑濃度梯度的形成過程。
[0024]具體地，用人輸卵管液(HTF)無機鹽成分等滲溶液配制2%的瓊脂培養(yǎng)基，滅菌后，等瓊脂培養(yǎng)基冷卻至56°C左右，量取一定體積瓊培養(yǎng)基脂分別置于5個不同試管，加入不同量的化學(xué)引誘劑(已過濾滅菌)，混勻，并迅速將含不同濃度化學(xué)引誘劑的瓊脂培養(yǎng)基分別注滿相應(yīng)的分隔室。所述人輸卵管液(HTF)無機鹽成分等滲溶液的配方為:氯化鈉90mM、氯化鉀5.06mM、碳酸氫鈉25.3mM、氯化鈣1.8mM、磷酸二氫鉀1.17mM、硫酸鎂1.0lmM。
[0025]作為優(yōu)選，所述化學(xué)引誘劑為孕酮、心房鈉尿肽(atrial natriureticpeptide, ANP)、P物質(zhì)、尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)、血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)、趨化因子 RNATES (regulated on Activation NormalT Expressed and Secreted)、腎上腺素、催產(chǎn)素、降鈣素、乙酰膽堿、豬抗凝血酶因子或氣味分子odorant ;更優(yōu)選為孕酮。優(yōu)選地，設(shè)置五個孕酮濃度，依次為0.32 μ Μ、0.63 μ Μ、1.25μΜ、2.50 μ M 和 5.0OyM0
[0026](2)向樣本室、引誘室、對照室和第一通道、第二通道內(nèi)加入精子培養(yǎng)液；
[0027]所述精子培養(yǎng)液可選用人輸卵管液(HTF)培養(yǎng)基，其配方為:氯化鈉90mM、氯化鉀
5.06mM、碳酸氫鈉25.3mM、氯化鈣1.8mM、磷酸二氫鉀1.17mM、硫酸鎂1.01mM、!fepes20mM、丙酮酸鈉0.27mM、乳酸鈉21.6mM、酹紅5 μ g/mL、葡萄糖5.56mM、青霉素60mg/L、牛血清白蛋白4g/L。
[0028]作為優(yōu)選，加入HTF培養(yǎng)基后，裝置內(nèi)HTF培養(yǎng)基的液面高度為2.5mm~4.5mm。
[0029]加入HTF培養(yǎng)基后，分隔室內(nèi)被瓊脂固化的化學(xué)引誘劑分子即緩慢擴散到相應(yīng)分隔室上方的HTF培養(yǎng)基中，完成化學(xué)引誘劑濃度梯度的形成。
[0030](3)將待測獲能精子懸液加到樣本室中，于37°C下孵育60~70min，分別檢測樣本室精子濃度C、引誘室精子濃度A和對照室精子濃度B，并計算A/C比值、B/C比值和A/B比值；
[0031]其中，A/C比值、B/C比值中較大者為精子活動力系數(shù)，A/B比值為精子化學(xué)趨向性系數(shù)。
[0032]獲能精子懸液的制備方法為:精子采集并液化后，與HTF培養(yǎng)基等體積混勻，500g離心5min，棄上層液體；精子用I~1.5mL HTF培養(yǎng)基重新懸浮，置于37°C、5%C02孵箱內(nèi)獲能培養(yǎng)90min ;得獲能精子懸液。
[0033]作為優(yōu)選，獲能精子懸液的添加量為0.5~lmL。
[0034]孵育完成后，在第二通道的兩端插入隔板，避免引誘室和對照室內(nèi)的精子游出，保證計數(shù)的準確性。根據(jù)計算獲得的A/C比值、B/C比值和A/B比值對精子質(zhì)量進行評價:
[0035](I)若A、B均不為O且A/B > 1，或A不為O、B為0，表明精子活動力好(此時A/C比值為精子活動力系數(shù)，A/C比值越大，活動力越好)，化學(xué)趨向性好。
[0036](2)若A、B均不為O且A/B≤1，表明精子活動力好(此時B/C比值為精子活動力系數(shù)，B/C比值越大，活動力越好)，化學(xué)趨向性差。
[0037](3)若A、B均為0，表明精子活動力差，繼續(xù)孵育30~180min，再檢測樣本室、弓丨誘室和對照室中的精子濃度，對精子質(zhì)量進行評價:
[0038]I)若此時A、B均不為O且A/B > 1，表明精子活動力較差，化學(xué)趨向性好；
[0039]2)若此時A、B均不為O且A/B < 1，表明精子活動力較差，化學(xué)趨向性差；
[0040]3)若此時A、B仍為0，表明精子活動力極差，難以獲得化學(xué)趨向性系數(shù)，無法評估其化學(xué)趨向性。
[0041]“A、B均不為O”表示精子能夠進行長距離的運動到達引誘室和對照室，表明其活動力好；“A/B > 1，或A不為O、B為O”表明大多數(shù)或全部精子集中到引誘室中，說明其化學(xué)趨向性好；“A/B ( I”表明濃度梯度的化學(xué)引誘劑對精子沒有選擇性，說明其化學(xué)趨向性差。
[0042]若在預(yù)定時間內(nèi)均未在引誘室和對照室中檢測到精子，表明精子活動力差，無法在預(yù)定時間內(nèi)達到，此時適當延長孵育時間再對其化學(xué)趨向性進行評價。本發(fā)明還提供了所述裝置在篩選人精子中的應(yīng)用。在預(yù)定時間內(nèi)達到引誘室的精子，其活動力和化學(xué)趨向性均較佳，表明精子質(zhì)量較好；精子活動力系數(shù)和精子化學(xué)趨向性系數(shù)越大的精子樣本，其質(zhì)量也越好；則引誘室內(nèi)的精子即可用于進一步的生殖生物學(xué)研究、輔助生殖應(yīng)用等方面。
[0043]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0044](I)本發(fā)明的裝置模擬女性生殖器官的相對解剖學(xué)位置，模擬精子在女性生殖道內(nèi)的自然選擇過程；一方面通過長距離的運動淘汰掉活動力差的精子，同時檢測精子樣本的活動力系數(shù)；另一方面，在第二通道內(nèi)設(shè)置分隔室，在分隔室內(nèi)加入不同濃度的化學(xué)引誘劑，形成濃度梯度，檢測精子樣本的化學(xué)趨向性系數(shù)，對精子的化學(xué)趨向性進行評價；
[0045](2)本發(fā)明的裝置和方法在檢測精子活動力系數(shù)和化學(xué)趨向性系數(shù)的過程中，對精子具有無損傷、非侵入、安全性高等特點，因此檢測過程也是篩選優(yōu)良精子的過程；并且操作簡便易行，成本低廉，便于實際應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為本實用新型用于檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的裝置的頂面結(jié)構(gòu)示意圖；
[0047]圖2為本實用新型用于檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的裝置的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0048]實施例1用于檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的裝置
[0049]如圖1、圖2所示，本實施例一種用于檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的裝置，本裝置采用透明、硬度強、耐高溫、耐腐蝕、無毒無熱原的高分子材料制成，包括底座I和與底座I相配合的蓋子11，底座I的頂面凹設(shè)有樣本室4、引誘室2和對照室3，其中，引誘室2和對照室3之間通過第二通道7相連，樣本室4與第二通道7的中點之間通過第一通道6相連。
[0050]樣本室4、引誘室2和對照室3均為圓柱形，樣本室4圓柱的底面直徑為10_，引誘室2和對照室3圓柱的底面直徑均為5mm，引誘室2和對照室3模擬女性的兩個卵巢，樣本室4、引誘室2、對照室3以及三向通道的高度均為2cm。其中，第二通道7的長度為16cm，相當于兩條女性輸卵管的長度；第一通道6的長度為6cm，相當于女性子宮的長度。
[0051]第二通道7的寬度從第二通道7的中點至引誘室2、對照室3逐漸變大，即第二通道7呈“中間窄、兩端寬”。其中，最窄處的寬度為0.5mm，最寬處的寬度為2mm。而第一通道6的寬度從第二通道7的中點至樣品室2逐漸變小。
[0052]由圖1、圖2可見，第二通道7內(nèi)設(shè)有隔欄9，本實施例中，在第二通道7的中點兩偵牝均有五個分隔室8，隔欄9的高度小于第二通道7的高度；本實施例中，隔欄9的高度為3mm ο
[0053]并且，第二通道7的兩端均設(shè)有卡槽，卡槽內(nèi)插設(shè)有隔板10，隔板10的高度不小于第二通道7的高度。本實施例中，隔板10的高度為2.5cm。
實施例2精子樣本的活動力與化學(xué)趨向性評價
[0054]I試驗準備
[0055](I)將實施例1的裝置進行121°C，15min高壓滅菌、去熱原處理。
[0056](2)試劑配制
[0057]①人輸卵液(HTF)培養(yǎng)基(也購買商業(yè)化產(chǎn)品)，其成份:氯化鈉90mM、氯化鉀5.06mM、碳酸氫鈉25.3mM、氯化鈣1.8mM、磷酸二氫鉀1.17mM、硫酸鎂1.01mM、!fepes20mM、丙酮酸鈉0.27mM、乳酸鈉 21.6mM、酹紅5μ g/mL、葡萄糖5.56mM、青霉素60mg/L、牛血清白蛋白4g/L。
[0058]②人輸卵管液(HTF)無機鹽成分等滲溶液，其成份:氯化鈉90mM、氯化鉀5.06mM、碳酸氫鈉25.3mM、氯化鈣1.8mM、磷酸二氫鉀1.17mM、硫酸鎂1.0lmM。
[0059]③取人輸卵管液(HTF)無機鹽成分等滲溶液，加入2%瓊脂，獲得瓊脂基質(zhì)，滅菌后冷卻至56°C左右，量取一定體積的瓊脂基質(zhì)置入五個試管中，并向試管中加入孕酮(已過濾滅菌)，獲得化學(xué)引誘劑瓊脂基質(zhì)；化學(xué)引誘劑瓊脂基質(zhì)中，孕酮的終濃度依次為:0.32 μ M,
0.63 μ Μ、1.25 μ Μ、2.50 μ M和5.00μΜο充分混勻后迅速將不同濃度的化學(xué)引誘劑瓊脂基質(zhì)位于引誘室一側(cè)的分隔室中(分隔室內(nèi)化學(xué)引誘劑的濃度從第二通道的中點至引誘室逐漸變大；在位于對照室一側(cè)的分隔室中只注入瓊脂基質(zhì))，待凝固后蓋上蓋子，置于4°C下保存，待用。
[0060]2人精子活動力和化學(xué)趨向性檢測
[0061](I)采集精子樣本并液化后，與HTF培養(yǎng)基等體積混勻，500g離心5min，棄上層液體；沉淀的精子用1.1mL HTF培養(yǎng)基重新懸浮，置于37°C、5%C02孵箱內(nèi)獲能培養(yǎng)90min ；
[0062](2)在操作步驟(1)期間，在實施例1的裝置各室道內(nèi)注入總共3mL的HTF培養(yǎng)基，將該裝置置入37°C、5%C02孵箱內(nèi)平衡(約30min)；
[0063](3)獲能培養(yǎng)時間結(jié)束，取0.9mL獲能精子懸液緩慢輕柔地加在樣本室中，加上蓋子，并小心地將裝置放置孵箱內(nèi)培養(yǎng)，60min后將兩塊隔板分別插入對應(yīng)的卡槽內(nèi)，分別吸取樣本室、引誘室及對照室內(nèi)的培養(yǎng)物各10μ 1，分別檢測樣本室、引誘室及對照室中的精子濃度。計數(shù)結(jié)果顯示，樣本室內(nèi)的精子濃度為82.0X 106/mL，引誘室內(nèi)的精子濃度A為4.4\106/1^，對照室內(nèi)精子濃度8為4.0父106/1^。由于A、B均不為O且A/B=l.1O 1)，表明該精子樣本活動力好(孵育60min時，精子活動力系數(shù)A/C為0.054)，化學(xué)趨向性好(精子化學(xué)趨向性系數(shù)A/B為1.1)。引誘室內(nèi)的精子即為篩選出的質(zhì)量優(yōu)良的精子，可收集于另一潔凈無菌無熱原的培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，可供研究、輔助生殖中的體外受精和ICSI等使用。[0064]實施例3精子樣本的活動力與化學(xué)趨向性評價
[0065]I試驗準備
[0066]與實施例2的第I部分相同。
[0067]2人精子活動力和化學(xué)趨向性檢測
[0068]與實施例2的第2部分相同，但評價的是不同來源的人精子樣本，且獲能培養(yǎng)結(jié)束后，取0.6mL獲能精子懸液緩慢輕柔地加在樣本室中，加上蓋子，并小心地將裝置放置孵箱內(nèi)孵育，60min后將兩塊隔板分別插入對應(yīng)的卡槽內(nèi)，分別吸取樣本室、引誘室及對照室內(nèi)的培養(yǎng)物各10 μ I，分別檢測樣本室、引誘室及對照室中的精子濃度。計數(shù)結(jié)果顯示，樣本室內(nèi)的精子濃度C為74.0 X IOVmL,引誘室內(nèi)的精子濃度A為2.0 X 106/mL,對照室內(nèi)的精子濃度B為2.0X 106/mL。由于A、B均不為O且A/B=l，表明該精子樣本活動力好(孵育60min時，精子活動力系數(shù)A/C或B/C為0.027)，但化學(xué)趨向性差(精子化學(xué)趨向性系數(shù)A/B為I)。
[0069]實施例4精子樣本的活動力與化學(xué)趨向性評價
[0070]I試驗準備
[0071 ] 與實施例2的第I部分相同。
[0072]2人精子活動力和化學(xué)趨向性檢測
[0073]與實施例2的第2部分相同，但評價的是不同來源的人精子樣本，且獲能培養(yǎng)結(jié)束后，取0.7mL獲能精子懸液緩慢輕柔地加在樣本室中，加上蓋子，并小心地將裝置放置孵箱內(nèi)孵育，60min后將兩塊隔板分別插入對應(yīng)的卡槽內(nèi)，分別吸取樣本室、引誘室及對照室內(nèi)的培養(yǎng)物各10 μ I，分別檢測樣本室、引誘室及對照室中的精子濃度。計數(shù)結(jié)果顯示，樣本室內(nèi)的精子濃度為54.0X 106/mL，引誘室內(nèi)的精子濃度為0，對照室內(nèi)的精子濃度為0，表明該精子樣本的活動力差。為評價其化學(xué) 趨向性，繼續(xù)孵育30min，再檢測樣本室、引誘室及對照室中的精子濃度。第二次計數(shù)的結(jié)果為:引誘室內(nèi)的精子濃度A為1.8X106/mL，對照室內(nèi)的精子濃度B為1.6X106/mL。由于A、B均不為O且A/B=l.125 O I)，表明該精子樣本的活動力較差(孵育時間延長了 30min)，化學(xué)趨向性好(精子化學(xué)趨向性系數(shù)A/B為1.125)。
[0074]實施例5精子樣本的活動力與化學(xué)趨向性評價
[0075]I試驗準備
[0076]與實施例2的第I部分相同。
[0077]2人精子活動力和化學(xué)趨向性檢測
[0078]與實施例2的第2部分相同，但評價的是不同來源的人精子樣本，且獲能培養(yǎng)結(jié)束后，取0.SmL獲能精子懸液緩慢輕柔地加在樣本室中，加上蓋子，并小心地將裝置放置孵箱內(nèi)孵育，60min后將兩塊隔板分別插入對應(yīng)的卡槽內(nèi)，分別吸取樣本室、引誘室及對照室內(nèi)的培養(yǎng)物各10 μ I，分別檢測樣本室、引誘室及對照室中的精子濃度。計數(shù)結(jié)果顯示，樣本室內(nèi)的精子濃度為68.0X 106/mL，引誘室內(nèi)的精子濃度為0，對照室內(nèi)的精子濃度為0，表明該精子樣本的活動力差。為評價其化學(xué)趨向性，繼續(xù)孵育30min，再檢測樣本室、引誘室及對照室中的精子濃度。第二次計數(shù)的結(jié)果為:引誘室內(nèi)的精子濃度A為0.8X106/mL，對照室內(nèi)的精子濃度B為0.8X 106/mL。由于A、B均不為O且A/B=l，表明該精子樣本的活動力較差(時間延長了 30min)，化學(xué)趨向性差(精子化學(xué)趨向性系數(shù)A/B為I)。
[0079]實施例6精子樣本的活動力與化學(xué)趨向性評價
[0080]I試驗準備[0081 ] 與實施例2的第I部分相同。
[0082]2人精子活動力和化學(xué)趨向性檢測
[0083]與實施例2的第2部分相同，但評價的是不同來源的人精子樣本，且獲能培養(yǎng)結(jié)束后，取ImL獲能精子懸液緩慢輕柔地加在樣本室中，加上蓋子，并小心地將裝置放置孵箱內(nèi)孵育，60min后將兩塊隔板分別插入對應(yīng)的卡槽內(nèi)，分別吸取樣本室、引誘室及對照室內(nèi)的培養(yǎng)物各10 μ 1，分別檢測樣本室、引誘室及對照室中的精子濃度。計數(shù)結(jié)果顯示，樣本室內(nèi)的精子濃度為24.0X 106/mL，引誘室內(nèi)的精子濃度為0，對照室內(nèi)的精子濃度為0，表明該精子樣本的活動力差。為評價其化學(xué)趨向性，繼續(xù)孵育90min，再檢測樣本室、引誘室及對照室中的精子濃度。第二次計數(shù)的結(jié)果為:引誘室內(nèi)的精子濃度A為0，對照室內(nèi)的精子濃度B為O。由于A、B仍為0， 表明該精子樣本的活動力極差，無法評估其化學(xué)趨向性。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的裝置，包括底座和與底座相配合的蓋子，其特征在于，底座的頂面凹設(shè)有樣本室、引誘室和對照室，其中，引誘室和對照室之間通過第二通道相連，樣本室與第二通道的中點之間通過第一通道相連，第二通道的長度為16~30cm,第一通道的長度為5~8cm ； 在第二通道的中點兩側(cè)，所述第二通道內(nèi)均勻設(shè)置有隔欄，隔欄將第二通道分成若干個分隔室，隔欄的高度小于第二通道的高度。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，在第二通道的中點兩側(cè)，所述分隔室均至少有三個。
3.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述第一通道或第二通道的高度為I~3cm,所述隔欄的高度為2~4mm。
4.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，樣本室、引誘室和對照室均為圓柱形，圓柱的高為I~2cm,圓柱的底面直徑為5~10mm。
5.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述第二通道的兩端均插設(shè)有隔板，隔板的高度不小于第二通道的高度。
6.利用如權(quán)利要求1~5任一所述裝置檢測人精子活動力和化學(xué)趨向性的方法，包括: (1)將化學(xué)引誘劑固定在位于引誘室一側(cè)的分隔室中，使用單一化學(xué)引誘劑濃度，或使分隔室內(nèi)化學(xué)引誘劑的濃度從第二通道的中點至引誘室依次變大； (2)向樣本室、引誘室、對照室和第一通道、第二通道內(nèi)加入精子培養(yǎng)液； (3)將待測獲能精子懸液加到樣本室中，于37°C下孵育60~70min，分別檢測樣本室精子濃度C、引誘室精子濃度A和對照室精子濃度B，并計算A/C比值、B/C比值和A/B比值； 其中，A/C比值、B/C比值中較大者為精子活動力系數(shù)，A/B比值為精子化學(xué)趨向性系數(shù)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)引誘劑為孕酮、心房鈉尿肽、P物質(zhì)、尿激酶型纖溶酶原激活因子、血小板活化因子、趨化因子RNATES、腎上腺素、催產(chǎn)素、降鈣素、乙酰膽堿、豬抗凝血酶因子或氣味分子odorant。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)引誘劑為孕酮。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，化學(xué)引誘劑的固定方法為:配制含不同濃度化學(xué)引誘劑的瓊脂基質(zhì)，加到對應(yīng)的分隔室中，待凝固后即完成固定。
10.如權(quán)利要求1~5任一所述裝置在篩選人精子中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12M1/00GK103773672SQ201410045455
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月8日
【發(fā)明者】李坤, 薛亞梅, 倪崖, 陳愛君, 石其賢, 謝海鋒, 邱楓 申請人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院