一種奶牛乳房炎疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種奶牛乳房炎疫苗。本發(fā)明提供的一種奶牛乳房炎疫苗，其活性成分為滅活后的菌株EBMO9、滅活后的菌株SACP5-9、滅活后的菌株SACP8-6、滅活后的菌株SACP336-3、滅活后的菌株SAWR-6、滅活后的菌株SDTR-9和滅活后的菌株SURF-5。本發(fā)明提供的疫苗具有高效、通用、安全、穩(wěn)定、劑型多樣等優(yōu)點，將是奶牛乳房炎疫苗發(fā)展的新里程碑。
【專利說明】一種奶牛乳房炎疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種奶牛乳房炎疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧業(yè)發(fā)展、食品安全的重大傳染病,特別是近年來，隨著環(huán)境的改變、抗生素的濫用，產(chǎn)生了多種耐藥菌甚至出現(xiàn)了超級細菌，由細菌感染引發(fā)的奶牛乳房炎發(fā)病率和死亡率逐年攀升，嚴重危害了畜牧業(yè)發(fā)展和食品安全，進而危害了人類健康。因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟損失，美國每年達30億美元、英國4億美元，我國35億元以上。奶牛乳房炎分為臨床型和隱性型。臨床型的癥狀為:乳區(qū)發(fā)熱、腫痛，泌乳量減少，乳清性狀發(fā)生改變，細菌數(shù)增多、體細胞增加，重者并發(fā)多器官衰竭甚至死亡。隱性型沒有特異的臨床表現(xiàn)，通過體細胞、產(chǎn)奶量及質(zhì)量檢測才能檢出，但奶牛罹患率比臨床型高得多，造成病原微生物的進一步播散，在一定條件下會轉(zhuǎn)化成臨床型，實際損失比臨床型聞得多。
[0003]引發(fā)奶牛乳房炎的病原菌均達140余種。據(jù)臨床流行病學資料顯示，我國奶牛乳房炎的病原菌以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌為主，占細菌感染的91.4%，其中大腸桿菌占30%，金黃色葡萄球菌占46%，鏈球菌占40%?；贠抗原大腸桿菌可分為多個血清型，奶牛乳房炎可能由一種血清型的大腸桿菌引起的，也可能是由多個血清型的大腸桿菌的混合物引起的。金黃色葡萄球菌以5型金黃色葡萄球菌(又稱金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型5型)、8型金黃色葡萄球菌(又稱金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型8型)和336型金黃色葡萄球菌(又稱金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型336型)為主(三者占金黃色葡萄球菌感染的95%以上)，與當前國際報道感染菌種、血清型及流行趨勢一致。鏈球菌以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌為主(三者占鏈球菌感染的92%以上)，與當前國際報道感染菌種、血清型及流行趨勢一致。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的是提供一種奶牛乳房炎疫苗。
[0005]本發(fā)明保護菌株EBM09、菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、菌株SAWR-6、菌株SDTR-9和菌株SURF-5在制備奶牛乳房炎疫苗中的應(yīng)用。所述奶牛乳房炎為大腸桿菌和/或金黃色葡萄球菌和/或鏈球菌引起的奶牛乳房炎。所述大腸桿菌具體可為所述菌株EBM09、大腸桿菌重組工程菌株X-10、大腸桿菌重組工程菌株X-89、大腸桿菌重組工程菌株X-326、大腸桿菌重組工程菌株X-2138、大腸桿菌重組工程菌株X-2555、大腸桿菌ATCC31617、大腸桿菌ATCC55235、大腸桿菌ATCC43895或大腸桿菌ATCC25922。所述金黃色葡萄球菌具體可為菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336_3、5型金黃色葡萄球菌ATCC4952U8型金黃色葡萄球菌ATCC49525、336型金黃色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株。所述鏈球菌可為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌或乳房鏈球菌。所述鏈球菌具體可為菌株SAWR-6、菌株SDTR-9、菌株SURF-5、無乳鏈球菌ATCC51487、停乳鏈球菌ATCC43078、乳房鏈球菌ATCC19436、奶牛乳房炎無乳鏈球菌流行優(yōu)勢株、奶牛乳房炎停乳鏈球菌流行優(yōu)勢株或奶牛乳房炎乳房鏈球菌流行優(yōu)勢株。
[0006]本發(fā)明還保護一種奶牛乳房炎疫苗，其活性成分為滅活后的菌株；所述滅活后的菌株為滅活后的菌株EBM09、滅活后的菌株SACP5-9、滅活后的菌株SACP8-6、滅活后的菌株SACP336-3、滅活后的菌株SAWR-6、滅活后的菌株SDTR-9和滅活后的菌株SURF-5。具體來說，所述疫苗中，所述滅活后的菌株EBM09、所述滅活后的菌株SACP5-9、所述滅活后的菌株SACP8-6、所述滅活后的菌株SACP336-3、所述滅活后的菌株SAWR-6、所述滅活后的菌株SDTR-9和所述滅活后的菌株SURF-5的濃度均為IX 101°個細菌/mL。所述疫苗還可包括佐劑。所述佐劑為SPOl佐劑、鋁佐劑或白花油佐劑。所述疫苗的劑型為乳頭管注射劑型、皮下注射劑型或肌肉注射劑型。所述奶牛乳房炎為大腸桿菌和/或金黃色葡萄球菌和/或鏈球菌引起的奶牛乳房炎。所述大腸桿菌具體可為所述菌株EBM09、大腸桿菌重組工程菌株X-10、大腸桿菌重組工程菌株X-89、大腸桿菌重組工程菌株X-326、大腸桿菌重組工程菌株X-2138、大腸桿菌重組工程菌株X-2555、大腸桿菌ATCC31617、大腸桿菌ATCC55235、大腸桿菌ATCC43895或大腸桿菌ATCC25922。所述金黃色葡萄球菌具體可為菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、5型金黃色葡萄球菌ATCC49521、8型金黃色葡萄球菌ATCC49525、336型金黃色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株。所述鏈球菌可為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌或乳房鏈球菌。所述鏈球菌具體可為菌株SAWR-6、菌株SDTR-9、菌株SURF-5、無乳鏈球菌ATCC51487、停乳鏈球菌ATCC43078、乳房鏈球菌ATCC19436、奶牛乳房炎無乳鏈球菌流行優(yōu)勢株、奶牛乳房炎停乳鏈球菌流行優(yōu)勢株或奶牛乳房炎乳房鏈球菌流行優(yōu)勢株。
[0007]本發(fā)明還保護一種奶牛乳房炎疫苗，其活性成分為滅活后的菌株和莢膜多糖；所述滅活后的菌株為滅活后的菌株EBM09、滅活后的菌株SACP5-9、滅活后的菌株SACP8-6、滅活后的菌株SACP336-3、滅活后的菌株SAWR-6、滅活后的菌株SDTR-9和滅活后的菌株SURF-5 ;所述莢膜多糖為所述`菌株SACP5-9的莢膜多糖、所述菌株SACP8-6的莢膜多糖、所述菌株SACP336-3的莢膜多糖、所述菌株SAWR-6的莢膜多糖、所述菌株SDTR-9的莢膜多糖和所述菌株SURF-5的莢膜多糖。具體來說，所述疫苗中，所述滅活后的菌株EBM09、所述滅活后的菌株SACP5-9、所述滅活后的菌株SACP8-6、所述滅活后的菌株SACP336-3、所述滅活后的菌株SAWR-6、所述滅活后的菌株SDTR-9和所述滅活后的菌株SURF-5的濃度均為IXlO10個細菌/mL，所述菌株SACP5-9的莢膜多糖、所述菌株SACP8-6的莢膜多糖、所述菌株SACP336-3的莢膜多糖、所述菌株SAWR-6的莢膜多糖、所述菌株SDTR-9的莢膜多糖和所述菌株SURF-5的莢膜多糖的濃度均為40 μ g/ml。所述疫苗還可包括佐劑。所述佐劑為SPOl佐劑、鋁佐劑或白花油佐劑。所述疫苗的劑型為乳頭管注射劑型、皮下注射劑型或肌肉注射劑型。所述奶牛乳房炎為大腸桿菌和/或金黃色葡萄球菌和/或鏈球菌引起的奶牛乳房炎。所述大腸桿菌具體可為所述菌株EBM09、大腸桿菌重組工程菌株X-10、大腸桿菌重組工程菌株X-89、大腸桿菌重組工程菌株X-326、大腸桿菌重組工程菌株X-2138、大腸桿菌重組工程菌株X-2555、大腸桿菌ATCC31617、大腸桿菌ATCC55235、大腸桿菌ATCC43895或大腸桿菌ATCC25922。所述金黃色葡萄球菌具體可為菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、5型金黃色葡萄球菌ATCC49521、8型金黃色葡萄球菌ATCC49525、336型金黃色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株。所述鏈球菌可為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌或乳房鏈球菌。所述鏈球菌具體可為菌株SAWR-6、菌株SDTR-9、菌株SURF-5、無乳鏈球菌ATCC51487、停乳鏈球菌ATCC43078、乳房鏈球菌ATCC19436、奶牛乳房炎無乳鏈球菌流行優(yōu)勢株、奶牛乳房炎停乳鏈球菌流行優(yōu)勢株或奶牛乳房炎乳房鏈球菌流行優(yōu)勢株。
[0008]所述“滅活后的菌株”可通過將所述菌株進行甲醛滅活得到。所述“滅活后的菌株”具體通過如下方法得到:取菌株，用PBS緩沖液重懸，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛濃度為0.4%(體積比)，37°C、150rpm振蕩孵育36_48h，離心(離心參數(shù)具體可為:5000r/min, 20min)收集菌體，用滅菌后的PBS緩沖液洗滌菌體，然后用滅菌后的PBS緩沖液懸浮菌體，得到“滅活后的菌株”(含I X IOltl個細菌/mL)。
[0009]所述莢膜多糖的制備方法具體如下:
[0010](1)取菌株，接種于BHI培養(yǎng)基，37°C、150rpm振蕩培養(yǎng)18h。
[0011](2)取步驟(1)得到的菌液，接種至BHI培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐中37°C發(fā)酵(發(fā)酵初始時刻，菌株的菌濃度為2X IO8個/ml，發(fā)酵罐溫度為37°C，發(fā)酵罐的初始轉(zhuǎn)速為198r/min，罐壓保持在0.05MPa,用8%Na0H水溶液或5%鹽酸水溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的pH為7.0-7.2，通過增加發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和/或增加通氣量維持發(fā)酵體系的溶氧量為25-35%，發(fā)酵體系的溶氧量高于35%時停止發(fā)酵)；
[0012](3)取步驟(2)得到的發(fā)酵體系，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛濃度為0.4% (體積比)，25°C、150rpm振蕩孵育24h，然后4°C、3000rpm離心15min，收集上清液；
[0013](4)取步驟(3)得到的上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨并使其濃度為lg/100ml，室溫、120rpm振蕩孵育I小時，然后4°C靜置16小時，然后1000Orpm離心30min，
收集沉淀(復(fù)合多糖)；
[0014](5)取步驟(4)得到的沉淀，溶于2M氯化鈣水溶液(沉淀與氯化鈣水溶液的配比為0.2-0.5g:ml),研磨,然后加入與2M氯化|丐水溶液等體積的水,室溫、120rpm振蕩孵育Ih,然后加入乙醇并使其濃度為25%(體積比)，41:靜置3h，然后4°C、5000rpm離心30min，收集
上清液；
[0015](6)取步驟(5)得到的上清液，加入乙醇并使其濃度為80%(體積比)，4°C靜置3h，然后4°C、1000Orpm離心15min，收集沉淀，依次用乙醇和丙酮洗滌，干燥，得到干物質(zhì)(粗糖)；
[0016](7)取步驟(6)得到的干物質(zhì)，溶于10g/100mL乙酸鈉水溶液(干物質(zhì)與乙酸鈉水溶液的配比為10-20mg:ml)，加入2倍于乙酸鈉水溶液體積的酚溶液(100g結(jié)晶酚溶于 40mlIOg/IOOmL 乙酸鈉水溶液)，4 °C、120rpm 振蕩 20_30min，然后 4 °C、lOOOOrpm、離心20min,取最上層液相；
[0017](8)取步驟(7)得到的液相，加入2倍體積的酚溶液(100g結(jié)晶酚溶于40mll0g/100mL 乙酸鈉水溶液)，4 °C、120rpm 振蕩 20_30min,然后 4 °C、lOOOOrpm、離心20min,取最上層液相；
[0018](9)取步驟(8)得到的液相，在0.1M氯化鈣水溶液中透析；
[0019](10)取步驟(9)得到的溶液，加入乙醇并使其濃度為75% (體積比)，4°C靜置3h，然后4°C、lOOOOrpm離心20min，收集沉淀，依次用乙醇和丙酮洗滌，干燥，得到干物質(zhì)(莢膜
多糖)。[0020]所述SPOl佐劑具體如下:溶劑為水，含2g/100mL角鯊烯、0.lg/100mL聚氧乙烯蓖麻油和0.1g/1OOmL聚醚多元醇。
[0021 ] 所述鋁佐劑具體可為氫氧化鋁。
[0022]所述疫苗具體可為實施例3中制備的疫苗-1、疫苗-11、疫苗-1I1、疫苗-1V、疫苗-V、疫苗-V1、疫苗Vn或疫苗珊。
[0023]以上任一所述奶牛具體可為中國荷斯坦奶牛。
[0024]本發(fā)明還保護菌株ΕΒΜ09、菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、菌株SAWR-6、菌株SDTR-9和菌株SURF-5。當以上三種菌株之間為“和”的關(guān)系時，七個菌株的數(shù)量比具體可為1:1:1:1:1:1:1。
[0025]大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)EBM09，簡稱菌株 EBM09，已于 2013 年 12 月 09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8532。
[0026]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) SACP5-9,簡稱菌株 SACP5-9,已于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8529。
[0027]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) SACP8-6,簡稱菌株 SACP8-6,已于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8530。
[0028]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) SACP336-3,簡稱菌株SACP336-3,已于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8531。
[0029]無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae) SAWR-6,簡稱菌株 SAWR-6,已于 2013 年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8533。
[0030]停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae) SDTR-9,簡稱菌株 SDTR-9,已于 2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8534。
[0031]乳房鏈球菌(Streptococcusuberis) SURF-5,簡稱菌株 SURF-5,已于 2013 年 12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8535。
[0032]對于奶牛乳房炎來說，最理想的防控手段為通過接種疫苗，其目的就是增強機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是乳腺組織的免疫應(yīng)答反應(yīng)來阻止、中和、殺滅外界進入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特點給有效免疫力的產(chǎn)生帶來了了一系列特殊的挑戰(zhàn)。第一，乳腺中的牛奶會稀釋抗感染的嗜中性粒細胞的濃度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中性粒細胞的殺菌能力。第二，奶牛飼養(yǎng)有大量可引起乳房炎的微生物的環(huán)境中，而且奶汁本身給病原菌生長提供了溫床。因此，使奶牛乳腺產(chǎn)生有效的免疫力，降低乳房炎的發(fā)生率，需要攻克的難題較多，給奶牛乳房炎疫苗研發(fā)提出比其它傳染病疫苗更高的要求。
[0033]疫苗是通過增強機體免疫系統(tǒng)的功能從而使機體獲得天然的抗病能力，并且疫苗具有安全、穩(wěn)定、有效等特點，因此研制安全、有效的奶牛乳房炎疫苗成為防控乳房炎的必由選擇。研發(fā)適宜本國流行代表菌株和環(huán)境的疫苗勢在必行。
[0034]本發(fā)明提供的疫苗具有高效、通用、安全、穩(wěn)定、劑型多樣等優(yōu)點，本發(fā)明為安全、高效、全面有效預(yù)防細菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保證，將是奶牛乳房炎疫苗發(fā)展的新里程碑。
【具體實施方式】
[0035]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例中的PBS緩沖液，如無特殊說明均為pH7.2,0.01M的無熱源PBS緩沖液。
[0036]大腸桿菌重組工程菌株X-10、大腸桿菌重組工程菌株X-89、大腸桿菌重組工程菌株X-326、大腸桿菌重組工程菌株X-2138和大腸桿菌重組工程菌株X-2555均記載于如下文獻:奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法(申請?zhí)?201010550056.6 ;申請
【發(fā)明者】楊鵬輝, 王林葉, 孫治華, 王歡, 孫科, 孫藝萍, 段躍強, 李敏 申請人:內(nèi)蒙古華希生物科技有限公司