一種醋酸桿菌及其利用杏皮渣固態(tài)發(fā)酵制備的果醋的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種醋酸桿菌及其利用杏皮渣固態(tài)發(fā)酵制備的果醋，本發(fā)明將醋酸菌株經(jīng)過亞硝基胍和紫外線復(fù)合誘變獲得的醋酸菌突變株，獲得一種遺傳性穩(wěn)定、發(fā)酵性能優(yōu)良的醋酸桿菌突變株Acetobacter?pomorum?AcF1?CCTCC?No：M2013554，在初始酒精度6％，醋酸接種量14％，發(fā)酵時(shí)間25d，發(fā)酵溫度31℃，醋醋酸含量可達(dá)8.16g/100ml，耐酒精性能優(yōu)良和耐高酸性能；采用固態(tài)混合菌種發(fā)酵工藝能生產(chǎn)杏皮渣醋在感官、理化和衛(wèi)生指標(biāo)方面都具備優(yōu)良品質(zhì)，其色澤棕黃清亮、果香和酸味較濃、后甜味舒適、體態(tài)豐滿，豐富了果醋產(chǎn)品品種，具有廣泛的實(shí)用性和產(chǎn)品典型性。
【專利說明】一種醋酸桿菌及其利用杏皮渣固態(tài)發(fā)酵制備的果醋
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及微生物及發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用突變菌種采用固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮渣醋【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，在果醋釀造過程中我國(guó)主要用到的有兩種醋酸菌。一種是果醋液態(tài)發(fā)酵中使用的菌種是Asl.41 (A.rancensL.)惡臭醋酸桿菌渾池變種,另一種是滬釀1.01醋酸桿菌(A.1ovanienseL.)羅旺醋酸桿菌，是上海釀造科學(xué)研究所和上海醋廠從丹東速釀醋中分離的菌種。這兩種醋酸菌最初是用于食醋發(fā)酵工業(yè)，不僅產(chǎn)酸能力和耐酒精能力都有待提高，而且發(fā)酵果醋形成的風(fēng)味也不佳，在果醋發(fā)酵過程中出現(xiàn)產(chǎn)酸能力、耐酒精能力和產(chǎn)香能力不理想的問題。
[0003]經(jīng)檢索現(xiàn)有技術(shù)可知，李湘利、冉旭采用分光光度計(jì)法分別研究了殼聚糖對(duì)金絲棗醋和葡萄醋的澄清作用。結(jié)果表明:殼聚糖可以提高金絲棗醋、葡萄醋的澄清度。周楊使用果膠酶、纖維素和半纖維素復(fù)合酶澄清木瓜果醋發(fā)酵液，效果較好。史經(jīng)略研究了用明膠溶液來解決果醋的非生物返混。張善寶、趙欣宇采用硅藻土分別對(duì)紅棗果醋和金紅蘋果果醋澄清進(jìn)行了研究。李華蘭采用超濾技術(shù)對(duì)桑果醋澄清進(jìn)行了研究。馬永昆對(duì)不同年份鎮(zhèn)江香醋香氣成分及其形成機(jī)理進(jìn)行了研究，采取固相微萃取提取香氣成分，共得到52種風(fēng)味物質(zhì)；解華東對(duì)岐山高粱醋陳化期香氣成分進(jìn)行研究，酸類物質(zhì)為主要風(fēng)味物質(zhì)；魯周民采用不同發(fā)酵方式對(duì)柿果醋香氣成分進(jìn)行研究，共分離揮發(fā)性成分63種；崔濤研究了砂梨及其果醋的香氣成分，共獲得15種果醋香氣成分；王永苓對(duì)沙棘果醋香氣成分進(jìn)行了研究，共分離了 82種香氣成分。
[0004]杏皮渣是加工成杏果漿、杏果汁和飲料后產(chǎn)生的副產(chǎn)品。根據(jù)資料記載，每生產(chǎn)I噸杏濃縮漿約需2.7噸原料杏·，同時(shí)產(chǎn)杏皮渣0.225噸。隨著杏皮渣的大量積累，大部分杏皮渣作為飼料或肥料應(yīng)用，杏皮渣沒有得到充分利用，附加值低，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。我國(guó)對(duì)杏皮渣綜合利用的研究主要集中在新疆，何偉研究了以杏皮渣為原料的釀造杏皮渣白蘭地酒精發(fā)酵階段的主要工藝條件。潘楊、王桓等研究了從杏渣里提取色素的工藝。郭金喜研究了從杏渣中提取不溶性膳食纖維；竇芹、李芳等以乙酸乙酯為浸提溶劑，從杏渣中提取到類胡蘿卜素。李文慧、徐麟等研究了以杏皮渣為原料生產(chǎn)果醋飲料的工藝。
[0005]我國(guó)食醋生產(chǎn)工藝占主導(dǎo)地位的是傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵法和液面靜置發(fā)酵法，深層液體發(fā)酵法占我國(guó)食醋總產(chǎn)量的6%。利用固態(tài)發(fā)酵法和半固-液態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)果醋的研究較少。適宜于固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮渣醋的醋酸菌尚屬空白。杏皮渣醋及其醋飲料的研發(fā)是利用杏皮渣的有效途徑之一。優(yōu)選適合于釀制杏皮渣醋的專用醋酸菌，研究和創(chuàng)新杏皮渣醋發(fā)酵工藝是目前急需解決的問題。杏皮渣醋的開發(fā)對(duì)于提高杏皮渣的附加值，促進(jìn)杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中利用固態(tài)發(fā)酵法和半固-液態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)果醋的研究較少，適宜于固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮渣醋的醋酸菌尚屬空白。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題就在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮渣醋醋酸菌突變株的育種及利用該突變菌種固態(tài)發(fā)酵制備杏皮渣醋的方法，本發(fā)明將醋酸菌株經(jīng)過亞硝基胍和紫外線復(fù)合誘變獲得的醋酸菌突變株，是一種遺傳性穩(wěn)定、發(fā)酵性能優(yōu)良的醋酸菌種，利用該菌株確定的固態(tài)發(fā)酵工藝能生產(chǎn)杏皮渣醋。
[0007]本發(fā)明具體提供一種固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮渣醋的突變株醋酸桿菌，菌種的編號(hào)為AcFl,菌種經(jīng)鑒定名稱為:Acetobacter pomorum AcFl,屬于醋酸單胞菌屬。
[0008]本發(fā)明從中國(guó)新疆巴音郭楞蒙古自治州輪臺(tái)縣杏果園中取土樣，從中優(yōu)選出一批優(yōu)良的醋酸桿菌，以亞硝基胍和紫外線二者交替處理醋酸菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，獲得其中一株菌種編號(hào)為AcFl,經(jīng)鑒定為醋酸單胞菌屬,將該菌種Acetobacter pomorum AcFl應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮渣醋，制備獲得典型性杏皮渣醋。
[0009]本發(fā)明提供的菌種Acetobacter pomorum AcFl于申請(qǐng)日前已保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編:430072，保藏日期是2013年11月7日，保藏號(hào)是CCTCC No:M2013554。該菌種易在酸性且含酒精的環(huán)境中生長(zhǎng)，菌落形態(tài)為邊緣整齊、表面光滑、淺黃白色、凸起的圓形菌落，直徑為0.5~Imm;個(gè)體形態(tài)為短桿狀，呈單、對(duì)、堆或鏈狀排列，為革蘭氏陰性菌。菌種Acetobacter pomorum AcFl的生理生化特性經(jīng)觸酶試驗(yàn)、甘油生酮試驗(yàn)、形成5-酮葡萄糖酸鹽試驗(yàn)、葡萄糖酸鹽試驗(yàn)、乙醇氧化試驗(yàn)、水溶性色素試驗(yàn)和乳酸鈣氧化試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，而乙酸鈣氧化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和產(chǎn)纖維素試驗(yàn)結(jié)果呈陰性；通過上述結(jié)果及經(jīng)過16S rDNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，依照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版對(duì)編號(hào)AcFl菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，生理生化特性進(jìn)行了鑒定，將AcFl菌株鑒定為 Acetobacter pomorum AcFl0
[0010]同時(shí)，本發(fā)明提供了杏皮禮:醋醋酸菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554的選育方法，包括下列步驟:
[0011](1)醋酸菌原生質(zhì)體的制備:將篩選常見的醋酸菌活化培養(yǎng)液以2% (v/v)的接種量接入到100mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，300C，120r/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取5ml培養(yǎng)液，3500r/min離心15min，棄上清液留菌體沉淀，分別取5mlHM緩沖液洗滌菌體2次，3500r/min離心15min離心棄上清液，用0.2mg/ml溶菌酶液懸浮菌體沉淀,30°C緩慢震蕩，每隔15min取酶解液涂片，革蘭氏染色后鏡檢，鏡檢原生質(zhì)體生成約80 %后，3500r/min離心15min離心棄酶液，用HM緩沖液洗滌終止酶解備用；HM緩沖液的重量組成為:0.4% NH4Cl,
1.2 % Tris,0.0035 % KCl,0.0058 % NaCU0.03 % Na2SO4.10Η20、0.426 % MgCl2.5Η20、
6.846%蔗糖、ρΗ7.5、余量為水；
[0012](2)原生質(zhì)體復(fù)合誘變:以亞硝基胍和紫外線二者交替處理醋酸菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變。先用8mg/ml亞硝基胍處理原生質(zhì)體20min后，再用照射距離30cm的紫外線處理60s，獲得醋酸菌突變株，所得的復(fù)合誘變?cè)|(zhì)體溶液在暗環(huán)境下，用雙層法復(fù)生培養(yǎng)，30°C條件下培養(yǎng)3-5d ；
[0013](3)醋酸菌原生質(zhì)體的再生:采用雙層平板法，取0.1ml制備好的原生質(zhì)體溶液，涂布在固體再生培養(yǎng)基下層，迅速加入4ml固體再生培養(yǎng)基上層溫度40 V，30 V靜置培養(yǎng)3-5d ；
[0014](4)醋酸菌突變株平板分離純化:取再生出的醋酸菌突變株劃線涂布于3個(gè)碳酸鈣平板和3個(gè)溴甲酚紫平板，在30°C培養(yǎng)至菌落產(chǎn)生透明圈，挑選鈣溶解圈大的單個(gè)菌落采用涂布法進(jìn)一步純化，分離出單個(gè)菌落接種于碳酸鈣分離培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)2d，得到醋酸菌 Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554,在 4°C保藏。
[0015]本發(fā)明中，固體再生培養(yǎng)基上層的重量組成為:0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.5% NaCl、ρΗ7.2、0.8%瓊脂、余量為HM緩沖液。
[0016]本發(fā)明中，固體再生培養(yǎng)基下層的重量組成為:0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.5% NaCl、pH7.2、2%瓊脂、余量為HM緩沖液。
[0017]本發(fā)明中，碳酸鈣分離培養(yǎng)基的重量組成為:葡萄糖1%、酵母浸粉1%、1651:干熱滅菌30min的碳酸鈣2%、無水乙醇3% (v/v)、瓊脂1.8%、余量為水。
[0018]進(jìn)一步,本發(fā)明提供了利用突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCCNo:M2013554固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮渣醋的制備工藝，具體步驟如下:
[0019](I)原料預(yù)處理:選擇無霉變、黃色干杏皮渣，去除雜物，并用清水將杏皮渣上的泥土、雜物洗凈待用；大米用萬能粉碎機(jī)打碎，過40目篩，制成大米粉；稻殼12rC，15min滅菌；
[0020](2)制備杏皮渣汁:將洗凈的干杏皮渣放入50°C的溫水中，按重量份配比為杏皮渣:溫水為1: 5，經(jīng)浸泡、過濾取汁，調(diào)整可溶性固形物為18%，100°C水浴滅菌5min ;
[0021](3)制備杏皮渣漿:采用高壓蒸煮和酶解結(jié)合法，將杏皮渣和水按重量比為1: 6浸泡2h后破碎打漿，在121°C高壓lOmin，冷卻到室溫后加入杏皮渣重量200U/g的果膠酶和150U/g的纖維素酶，在50°C下酶解4h ；
`[0022](4)制備大米糖化醪:取重量份配比為大米粉:溫水為1: 3配制成醪液，將醪液先用12U/g中溫α-淀粉酶，在65°C條件下液化45min，再加入180U/g糖化酶，在70°C條件下糖化180min ；
[0023](5)將步驟(3)制備的杏皮渣漿和步驟(4)制備的大米糖化醪以重量份配比1:1混合獲得混合漿，將獲得混合漿經(jīng)殺菌條件下100°C處理5min ；
[0024](6)釀酒酵母種子液和產(chǎn)酯酵母種子液的制備:將常見的釀酒酵母接種至IOml17%杏皮渣汁中，28 °C培養(yǎng)24h，得到釀酒酵母種子液；取常見的產(chǎn)酯酵母接種至IOml17%杏皮渣汁中28°C培養(yǎng)36h，得到產(chǎn)酯酵母種子液；
[0025](7)固態(tài)酒精發(fā)酵:以4.5% (v/v)接種量將釀酒酵母種子液和以2.25% (v/v)接種量將產(chǎn)酯酵母種子液接入步驟(5)中制備的18%混合漿中，按重量份配比，加入為混合漿:稻殼按照3: I配比的稻殼，密閉發(fā)酵，28°C發(fā)酵6d，得杏皮渣酒精發(fā)酵液；
[0026](8)固態(tài)醋酸發(fā)酵:取斜面保藏的醋酸桿菌突變株Acetobacter pomorum AcFlCCTCC No:M2013554，1環(huán)接種至IOml 3% (v/v)步驟(7)制備的杏皮渣酒精發(fā)酵液中，30°C培養(yǎng) 24h，得到醋酸桿菌突變株 Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 種子液；按14% (v/v)的接種量將醋酸桿菌突變株Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554種子液接入步驟(7)制備的杏皮渣酒精發(fā)酵液中，31°C靜止發(fā)酵25d ;
[0027](9)杏皮渣醋澄清:按照每100mL杏皮渣醋加入6ml質(zhì)量濃度為4%的皂土，澄清24h,4500r/min離心5min,收集澄清液,得杏皮洛醋；[0028](10)成品殺菌:將杏皮渣醋按照常規(guī)75°C保持3min殺菌。
[0029]在初始酒精度為6% (v/v)的混合漿酒精發(fā)酵醅中接種14% (v/v)的醋酸菌Fl種子液，31°C靜止發(fā)酵25d，可使其產(chǎn)酸量達(dá)到8.16g/100ml，并且杏皮渣醋的感官評(píng)價(jià)非常出色。在初始酒精度為10% (v/v)的杏皮渣汁中接種Fl菌株發(fā)酵7d產(chǎn)酸量可以達(dá)到1.03g/100ml,因此耐酒精性能優(yōu)良，具有耐高酸性能；在28°C -36°C之間可以發(fā)酵杏皮渣酒精發(fā)酵液，因此適應(yīng)溫度范圍大。
[0030]本發(fā)明提供一種通過上述利用突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCCNo:M2013554固態(tài)發(fā)酵制備工藝釀造的杏皮渣醋，得到的杏皮渣醋具備優(yōu)良品質(zhì):
[0031](I)感官指標(biāo):色澤:棕黃色或淺黃色、澄清透明；氣味:具有典型的杏果香氣，有良好的醋味；口感:酸味較濃、余味呈甜、具有杏果典型的風(fēng)味。
[0032](2)理化指標(biāo):原醋產(chǎn)品酸度:8.16g/100ml ;澄清后酸度:6.18-6.56g/100ml ;可溶性固形物含量:4.67% ;氨基酸總量:0.54% ;香氣成分:酯類物質(zhì)鑒定出32種，醇類物質(zhì)21種,醛類物質(zhì)9種，酸類物質(zhì)12種，烯類物質(zhì)5種。
[0033](3)衛(wèi)生指標(biāo):菌落總數(shù):未檢出；大腸菌群:未檢出；致病菌:未檢出。
[0034]本發(fā)明提供杏皮渣醋上述理化指標(biāo)測(cè)試可采用的方法:總糖的測(cè)定:GB/T 15038-2006直接滴定法；酒精度的測(cè)定:GB/T 15038-2006酒精計(jì)法；總酸:GB/T15038-2006電位滴定法；還原糖:GB/T 15038-2006直接滴定法。香氣成分的測(cè)定:同時(shí)蒸餾萃取法，量取杏皮渣原醋200ml置于同時(shí)蒸餾萃取裝置一端的500ml圓底燒瓶中，用電熱套加熱；另取50ml 二氯甲烷放人裝置另一端的250ml圓底燒瓶中，置于45°C恒溫水浴鍋中加熱，同時(shí)蒸餾提取2h后，合并接收液和二氯甲烷，置于分液漏斗中分離并收集二氯甲烷相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，45°C濃縮至3ml，用無水硫酸鈉脫水，待GC-MS分析。GC-MS色譜條件:色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(·30.0mX250 μ mX0.25 μ m);程序升溫:初始溫度40°C，保持
0.5min，以2°C/min的速度升至80°C，保持Omin，以4°C/min的速度升至110°C，再以10°C /min的速度升至190°C后以6°C /min的速度升至225°C，最后以5°C /min的速度升至240°C，保持5min;進(jìn)樣口溫度250°C;載氣為He氣，流量lml/min;進(jìn)樣方式:分流比1: 30，延遲2min,進(jìn)樣量5 μ L。質(zhì)譜條件；離子源溫度為220°C ；電子能量為70eV ；電離方式為EI ;質(zhì)量掃描范圍為33-500amu。氨基酸成分的測(cè)定:GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的測(cè)定；菌落總數(shù)的測(cè)定:GB/T4789.2-2003菌落總數(shù)測(cè)定；大腸菌群的測(cè)定:GB/T4789.3-2003大腸菌群測(cè)定；致病菌的測(cè)定:GB/T4789.22-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)調(diào)味品檢驗(yàn)，這些方法都是本領(lǐng)域常見的方法。
[0035]通過實(shí)施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
可以達(dá)到以下有益效果:
[0036](I)本發(fā)明提供一株釀造杏皮渣醋發(fā)酵性能良好的突變株醋酸桿菌Acetobacterpomorum AcFl CCTCC No:M2013554。接種量在 14% (V/V)，31 °C 發(fā)酵時(shí)，可使酸度達(dá)到8.16g/100mL，具有耐高酸性能。將該菌株接種在酒精度10%的杏皮渣汁中發(fā)酵7d酸度達(dá)到1.03g/100ml，耐酒精性能優(yōu)良；在281: _36°C之間可以發(fā)酵混合漿酒精發(fā)酵醅，彌補(bǔ)了目前固態(tài)發(fā)酵杏皮渣醋專用醋酸菌缺乏的現(xiàn)狀。
[0037](2)本發(fā)明提供一種通過利用提供的突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorum AcFlCCTCC No:M2013554固態(tài)發(fā)酵制備工藝釀造的杏皮渣醋，得到的杏皮渣醋在感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和衛(wèi)生指標(biāo)方面都具備優(yōu)良品質(zhì)，獲得了優(yōu)良的杏皮渣醋產(chǎn)品，其色澤棕黃清亮、果香和酸味較濃、后甜味舒適、體態(tài)豐滿，豐富了目前果醋產(chǎn)品市場(chǎng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1顯示為固態(tài)發(fā)酵制備杏皮渣醋的工藝流程圖。
[0039]圖2 突變株醋酸桿菌 Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 的產(chǎn)酸量圖。
[0040]圖3杏皮渣漿與大米糖化醪混合漿的比例對(duì)酒精度的影響。
[0041]圖4杏皮渣醋揮發(fā)性香氣成分GC-MS總離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。
[0043]主要儀器與設(shè)備:PL202電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HPX_9272數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-40BI高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；GZX-9420電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HHW.21.600電熱恒溫水浴箱，北京永光明醫(yī)療儀器廠；fcycler96孔PCR反應(yīng)儀，Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；GEL Doc2000凝膠成像分析儀，Bio-Rad公司；LHS-250SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；游標(biāo)卡尺，上海工量具有限公司；WHB96微孔板，上海市蔚宏生物科技有限公司；移液槍，上海艾本德生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易有限公司；G4B20C5E1C6B71旋蒸蒸發(fā)儀，日本Eyela公司。BL3100電子天平，德國(guó)Sartorius公司；SCW-CA_650桌上型垂直流潔凈工作臺(tái)，蘇州宏瑞凈化科技有限公司。手持糖度計(jì)，上海天壘儀器儀表有限公司；酒精計(jì)，上海醫(yī)聯(lián)控溫儀器廠。PHS-3B型PH計(jì)，上海紅益儀器儀表有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司。
[0044]本發(fā)明中選用的所有釀酒酵母的菌種和原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)條件和方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％ —般為重量之比，個(gè)別不同之處另作說明。
[0045]實(shí)施例一:醋酸菌原生質(zhì)體的制備與再生
[0046](I)醋酸菌來源:中國(guó)新疆巴州輪臺(tái)縣杏果園土壤從中篩選獲得。
[0047](2)醋酸菌原生質(zhì)體的制備。
[0048]將醋酸菌活化培養(yǎng)液以2% (v/v)的接種量接入到100mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，30°C，120r/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取5ml培養(yǎng)液，3500r/min離心15min，棄上清液留菌體沉淀，分別取5ml HM緩沖液洗漆菌體2次,3500r/min離心15min離心棄上清液,用0.2mg/ml溶菌酶液懸浮菌體沉淀，30°C緩慢震蕩，每隔15min取酶解液涂片，革蘭氏染色后鏡檢，鏡檢原生質(zhì)體生成約80%后，3500r/min離心15min離心棄酶液，用HM緩沖液洗滌終止酶解備用。
[0049]HM 緩沖液的重量組成為:0.4% NH4ClU.2% Tris,0.0035% KC1、0.0058% NaCl、0.03% Na2SO4.IOH2O,0.426% MgCl2.5Η20、6.846%蔗糖、ρΗ7.5、余量為水。
[0050](3)醋酸菌原生質(zhì)體的再生:
[0051]采用雙層平板法，取0.1ml制備好的原生質(zhì)體溶液，涂布在固體再生培養(yǎng)基下層，迅速加入4ml固體再生培養(yǎng)基上層(溫度40°C )，30°C靜置培養(yǎng)3_5d。
[0052]固體再生培養(yǎng)基上層的重量組成為:0.5 %牛肉膏、I %蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.5% NaCl、ρΗ7.2、0.8%瓊脂、余量為HM緩沖液。
[0053]固體再生培養(yǎng)基下層的重量組成為:0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、
0.5%酵母膏、0.5% NaCl、pH7.2、2%瓊脂、余量為HM緩沖液。
[0054]實(shí)施例二:醋酸菌誘變育種試驗(yàn)
[0055](I)原生質(zhì)體紫外線誘變最佳時(shí)間的確定
[0056]將實(shí)施例一中制備好的醋酸菌原生質(zhì)體用HM緩沖溶液稀釋107個(gè)/ml，取4ml注入無菌平皿中，并用功率20W紫外線照射，處理時(shí)間分別為15s、30s、45s、60s、75s、90s，照射的距離為30cm，照射后用HM溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，用雙層法進(jìn)行原生質(zhì)體再生，同時(shí)，未經(jīng)照射的原生質(zhì)體以同樣的倍數(shù)稀釋后用雙層法進(jìn)行原生質(zhì)體再生，作為對(duì)照。30°C條件下避光培養(yǎng)3-5d，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)算原生質(zhì)體致死率及確定最佳誘變時(shí)間。
[0057](2)原生質(zhì)體亞硝基胍誘變最佳條件的確定
[0058]①亞硝基胍處理時(shí)間對(duì)致死率的影響
[0059]亞硝基胍溶液配制:取IOmg亞硝基胍溶于Iml丙酮中，制成濃度10mg/ml的亞硝基胍原液。再用HM緩沖液配制成濃度分別為0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、10mg/ml亞硝基胍溶液備用。
[0060]調(diào)節(jié)原生質(zhì)體懸液濃度:用HM緩沖液調(diào)節(jié)制備好的原生質(zhì)體溶液濃度為IO8個(gè)/ml,吸取1ml, 3500r/min離心15min,收集原生質(zhì)體。
[0061]亞硝基胍誘變?cè)|(zhì)體:將濃度lmg/ml的亞硝基胍溶液注入原生質(zhì)體，分別反應(yīng)5min、lOmin、15min、20min、25min,離心棄誘變劑,將處理過的原生質(zhì)體稀釋100倍終止誘變反應(yīng)，用HM緩沖液10倍稀釋至10_6`，取ΙΟ'ΙΟΛ?Ο—4三個(gè)稀釋度各0.1ml，用雙層法再生原生質(zhì)體。30°C條件下培養(yǎng)3-5d，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)算原生質(zhì)體致死率及確定最佳誘變時(shí)間。
[0062]②亞硝基胍濃度對(duì)致死率的影響
[0063]配制濃度分別0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml、10mg/ml 的亞硝基胍溶液,分別注入處理好的原生質(zhì)體,處理時(shí)間為20min，離心棄清液，將處理過的原生質(zhì)體稀釋100倍終止誘變反應(yīng)，用HM緩沖液10倍稀釋到10_6，取10_6、10_5，10_4三個(gè)稀釋度各0.1ml，用雙層法再生原生質(zhì)體。30°C條件下培養(yǎng)3-5d，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)算原生質(zhì)體致死率及確定亞硝基胍誘變的最佳濃度。
[0064](3)原生質(zhì)體復(fù)合誘變
[0065]以紫外線和亞硝基胍二者的最佳誘變劑量進(jìn)行誘變。先用8mg/ml亞硝基胍處理原生質(zhì)體20min后，再用照射距離30cm的紫外線處理60s，獲得醋酸菌突變株，所得的復(fù)合誘變?cè)|(zhì)體溶液在暗環(huán)境下，用雙層法復(fù)生培養(yǎng)，30°C條件下培養(yǎng)3-5d ;將經(jīng)亞硝基胍誘變處理的原生質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，進(jìn)行紫外線照射誘變。所得的復(fù)合誘變?cè)|(zhì)體溶液在暗環(huán)境下，用雙層法復(fù)生培養(yǎng)，30°C條件下培養(yǎng)3-5d，待長(zhǎng)出菌落后，再接種到鈣平板分離培養(yǎng)基，選擇水解透明圈大的菌落進(jìn)行初篩。再把初篩得到的菌落接入液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，110r/min，3(TC振蕩培養(yǎng)7d后測(cè)醋酸含量，復(fù)篩出醋酸產(chǎn)量提升大的菌落，參見附圖2。
[0066](4)突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0067]將復(fù)篩后的菌株在液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接20代，30°C、120r/min震蕩培養(yǎng)5d，重復(fù)發(fā)酵3次，測(cè)定其發(fā)酵液醋酸含量，計(jì)算其平均值，確定誘變菌株產(chǎn)酸性能是否穩(wěn)定。
[0068]結(jié)論:參見附圖2，突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorum AcFl產(chǎn)酸量為
3.336g/100ml,且遺傳穩(wěn)定性較好,將突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorum AcFl可作為一種優(yōu)良的固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)的試驗(yàn)菌種。
[0069]實(shí)施例三:菌種的篩選、分離、純化和鑒定
[0070]1、菌種篩選分離與純化:
[0071]本發(fā)明從新疆杏樹產(chǎn)地中取樣，篩選出一批優(yōu)良的醋酸桿菌，以亞硝基胍和紫外線二者交替處理醋酸菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，獲得其中一株菌種編號(hào)為AcFl，經(jīng)鑒定為醋酸單胞菌屬，將該菌種Acetobacter pomorum AcFl應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮洛醋,制備獲得典型性杏皮渣醋。
[0072]同時(shí)，本發(fā)明提供了杏皮禮:醋醋酸菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554的選育方法，包括下列步驟:
[0073](I)醋酸菌原生質(zhì)體的制備:將醋酸菌活化培養(yǎng)液以2% (v/v)的接種量接入到100mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，30°C，120r/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取5ml培養(yǎng)液，3500r/min離心15min,棄上清液留菌體沉淀,分別取5ml HM緩沖液洗漆菌體2次,3500r/min離心15min離心棄上清液，用0.2mg/ml溶菌酶液懸浮菌體沉淀，30°C緩慢震蕩，每隔15min取酶解液涂片，革蘭氏染色后鏡檢，鏡檢原生質(zhì)體生成約80%后,3500r/min離心15min離心棄酶液，用HM緩沖液洗滌終止酶解備用緩沖液的重量組成為:0.4% NH4ClU.2% Tris,
0.0035 % KCl、0.0058 ·% NaCU0.03 % Na2SO4.10Η20、0.426 % MgCl2.5Η20、6.846 % 蔗糖、ρΗ7.5、余量為水。
[0074](2)原生質(zhì)體復(fù)合誘變:以亞硝基胍和紫外線二者交替處理醋酸菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變。先用8mg/ml亞硝基胍處理原生質(zhì)體20min后，再用照射距離30cm的紫外線處理60s，獲得醋酸菌突變株，所得的復(fù)合誘變?cè)|(zhì)體溶液在暗環(huán)境下，用雙層法復(fù)生培養(yǎng)，30°C條件下培養(yǎng)3-5d。
[0075](3)醋酸菌原生質(zhì)體的再生:采用雙層平板法，取0.1ml制備好的原生質(zhì)體溶液，涂布在固體再生培養(yǎng)基下層，迅速加入4ml固體再生培養(yǎng)基上層(溫度40°C )，30°C靜置培養(yǎng) 3-5d。
[0076](4)醋酸菌突變株平板分離純化:取再生出的醋酸菌突變株劃線涂布于3個(gè)碳酸鈣平板和3個(gè)溴甲酚紫平板，在30°C培養(yǎng)至菌落產(chǎn)生透明圈，挑選鈣溶解圈大的單個(gè)菌落采用涂布法進(jìn)一步純化，分離出單個(gè)菌落接種于碳酸鈣分離培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)2d，得到醋酸菌 Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554,在 4°C保藏。
[0077]本發(fā)明中，固體再生培養(yǎng)基上層的重量組成為:0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.5% NaCl、ρΗ7.2、0.8%瓊脂、余量為HM緩沖液。
[0078]本發(fā)明中，固體再生培養(yǎng)基下層的重量組成為:0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.5% NaCl、pH7.2、2%瓊脂、余量為HM緩沖液。
[0079]本發(fā)明中，碳酸鈣分離培養(yǎng)基的重量組成為:葡萄糖1%、酵母浸粉1%、1651:干熱滅菌30min的碳酸鈣2%、無水乙醇3% (v/v)、瓊脂1.8%、余量為水。
[0080]2、菌種的形態(tài)學(xué)鑒定:[0081]菌落形態(tài)觀察J^fAcetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 在碳酸|丐分離培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)ld，觀察其菌落形態(tài)。
[0082]個(gè)體形態(tài)觀察J^fAcetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 在碳酸|丐分離培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)ld，挑取單個(gè)菌落，革蘭氏染色，顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài)。
[0083]3、生理生化鑒定:
[0084]依據(jù)菌種醋酸菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 的特性進(jìn)行生
理生化鑒定。
[0085]選擇接觸酶試驗(yàn)J^1Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 在碳酸鈣分離培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)ld，向平板上滴加3%的H2O2，觀察有無氣泡產(chǎn)生。
[0086]甘油生麗試驗(yàn):將Acetobacterpomorum AcFl CCTCC No:M2013554在培養(yǎng)基成分為3 %酵母膏、2 %瓊脂、3 %甘油的固體培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)24h，將費(fèi)林液注滿平板，觀察菌落周圍有無紅色沉淀產(chǎn)生。
[0087]形成5_ 麗葡萄糖酸鹽試驗(yàn):將 Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554在培養(yǎng)基成分為3 %葡萄糖、I %酵母膏、2 %無水乙醇、2 %瓊脂的固體培養(yǎng)基上劃線，32 °C培養(yǎng)24h，觀察菌落周圍有無白色不透明圈。
[0088]葡萄糖酸鹽試驗(yàn)^^Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 接種于葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基中(lml)，3(TC培養(yǎng)48h，加入班式試劑，于水浴中煮沸IOmin并迅速冷卻，觀察有無黃到磚紅色沉淀。
[0089]乙醇氧化試驗(yàn):將Acetobacterpomorum AcFl CCTCC No:M2013554在培養(yǎng)基成分為I %葡萄糖、3 %無水乙醇、2 %瓊脂的固體培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)24h，觀察其是否可以生長(zhǎng)。
[0090]產(chǎn)纖維素試驗(yàn)J^fAcetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554在培養(yǎng)基成分為30 %葡萄糖、I %酵母膏、2 %瓊脂、2 %碳酸鈣的固體培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)24h，向平板中加入Lugol碘液和60%硫酸，觀察菌落周圍有無變化。
[0091]水溶性色素試驗(yàn)J^fAcetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 在培養(yǎng)基成分為10 %葡萄糖、5 %酵母膏、2 %瓊脂、2.5 %碳酸鈣的固體培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)24h，觀察是否產(chǎn)生棕色水溶性色素。
[0092]乙酸鈣氧化試驗(yàn):將Acetobacterpomorum AcFl CCTCC No:M2013554在培養(yǎng)基成分為I %葡萄糖、I %酵母膏、2 %瓊脂、I %乙酸鈣的固體培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)48h，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生乳白色的暈圈。
[0093]淀粉水解試驗(yàn)J^fAcetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554接種于淀粉瓊脂平板，30°C培養(yǎng)48h，加入革蘭碘液數(shù)滴，觀察有無藍(lán)色產(chǎn)生。
[0094]乳酸鈣氧化試驗(yàn)J^1Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 在培養(yǎng)基成分為I %葡萄糖、I %酵母膏、2 %瓊脂、2 %乳酸鈣的固體培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)48h，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生乳白色的暈圈。
[0095]鑒定結(jié)果:經(jīng)觸酶試驗(yàn)、甘油生酮試驗(yàn)、形成5-酮葡萄糖酸鹽試驗(yàn)、葡萄糖酸鹽試驗(yàn)、乙醇氧化試驗(yàn)、水溶性色素試驗(yàn)和乳酸鈣氧化試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，而乙酸鈣氧化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和產(chǎn)纖維素試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。
[0096]本發(fā)明提供的菌種Acetobacter pomorum AcFl于申請(qǐng)日前已保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編:430072，保藏日期是2013年11月7日，保藏號(hào)是CCTCC No:M2013554。該菌種易在酸性且含酒精的環(huán)境中生長(zhǎng)，菌落形態(tài)為邊緣整齊、表面光滑、淺黃白色、凸起的圓形菌落，直徑為0.5~Imm;個(gè)體形態(tài)為短桿狀，呈單、對(duì)、堆或鏈狀排列，為革蘭氏陰性菌。菌種Acetobacter pomorum AcFl的生理生化特性經(jīng)觸酶試驗(yàn)、甘油生酮試驗(yàn)、形成5-酮葡萄糖酸鹽試驗(yàn)、葡萄糖酸鹽試驗(yàn)、乙醇氧化試驗(yàn)、水溶性色素試驗(yàn)和乳酸鈣氧化試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，而乙酸鈣氧化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和產(chǎn)纖維素試驗(yàn)結(jié)果呈陰性；通過上述結(jié)果及經(jīng)過16S rDNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，依照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版對(duì)AcFl菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，生理生化特性進(jìn)行了鑒定，將菌種編號(hào)為AcFl菌株鑒定為 Acetobacter pomorum AcFl0
[0097]4、16S rDNA序列分析鑒定:
[0098](I) 16S rDNA 的提取:
[0099]采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)提取。
[0100](2) 16S rDNA PCR 擴(kuò)增:
[0101]選擇細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增試驗(yàn):
[0102]引物I 序列為 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，
[0103]引物2 序列為 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
[0104]PCR 擴(kuò)增體系選擇 25 μ L 體系:2.5 μ L 含鎂離子 lOXbuffer，2 μ L2.5mmol/LdNTP, I μ LTemplate, 0.5 μ L10mmol/L 引物 27F, 0.5 μ L
[0105]10mmol/L 引物 1492R，I μ L`5U/y L Taq DNA 聚合酶，17.5 μ L 的重蒸水。
[0106]PCR擴(kuò)增程序:預(yù)變性的條件為94°C 5min ;變性的條件為94°C 30s,退火條件為550C 30s，延伸條件為72°C lmin，從變性到延伸30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min ;保溫4min ;降至16°C取出PCR產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳，EB染色后由熒光-可見光凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)。
[0107](3)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序和序列分析:
[0108]16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純度檢測(cè)后，委托北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)及相似性分析。
[0109](4)醋酸菌AcFl鑒定結(jié)果
[0110]通過《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》測(cè)定，Acll序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)得出:醋酸菌AcFl和Acetobacter pomorumstrain LMG 18848 進(jìn)化位置相同，所以菌株 AcFl 為 Acetobacter pomorum strain。
[0111]16S rDAN是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的基因。長(zhǎng)度約為1500pb，是細(xì)菌分類學(xué)研究中最常用、最有用的分子鐘，16S rRNA其大小在1500bp左右，所代表的信息量適中，因此是進(jìn)行分類研究的理想材料。利用16S rDNA兩端的引物PCR擴(kuò)增未知菌株的16S rRNA基因，并進(jìn)行DNA測(cè)序，與已知序列進(jìn)行同源性比較后，判定細(xì)菌種類，將細(xì)菌劃分到屬或種，結(jié)合醋酸菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554菌落形態(tài)、生理生化特性及上述分子水平鑒定，確定本發(fā)明提供的醋酸菌AcFl CCTCC No:M2013554 為 Acetobacter pomorum。本發(fā)明醋酸菌 AcFl CCTCC No:M2013554 的序列1012pb，具體參見附后的序列表SEQUENCE LISTING。[0112]實(shí)施例四:利用突變株醋酸桿菌Acetobacterpomorum AcFl CCTCC No:M2013554固態(tài)發(fā)酵釀造工藝制備杏皮渣醋
[0113]參見附圖1，利用突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554固態(tài)發(fā)酵制備杏皮渣醋的詳細(xì)釀造工藝步驟如下:
[0114](I)原料預(yù)處理:選擇無霉變、黃色干杏皮渣，去除雜物，并用清水將杏皮渣上的泥土、雜物洗凈待用；大米用萬能粉碎機(jī)打碎，過40目篩，制成大米粉；稻殼12rC，15min滅菌。
[0115](2)制備杏皮渣汁:將洗凈的干杏皮渣放入50°C的溫水中，按重量份配比為杏皮渣:溫水為1: 5，浸泡4h，過濾取汁，調(diào)整可溶性固形物為18%，100°C水浴滅菌5min。
[0116](3)制備杏皮渣漿:采用高壓蒸煮和酶解結(jié)合法，將杏皮渣和水按重量比為1: 6浸泡2h后破碎打漿，在121°C高壓lOmin，冷卻到室溫后加入杏皮渣重量200U/g的果膠酶和150U/g的纖維素酶，在50°C下酶解4h。
[0117](4)制備大米糖化醪:取重量份配比為大米粉:溫水為1: 3配制成醪液，將25%的醪液先用12U/g中溫α-淀粉酶，在65°C條件下液化45min，再加入180U/g糖化酶，在70°C條件下糖化180min。
[0118](5)將步驟(3)制備的杏皮渣漿和步驟(4)制備的大米糖化醪以重量份配比1:1混合獲得混合漿，將獲得混合漿經(jīng)殺菌條件下100°C處理5min。
[0119](6)釀酒酵母種子液和產(chǎn)酯酵母種子液的制備:將常見的釀酒酵母接種至IOml17Brix杏皮渣汁中，28°C培養(yǎng)24h，得到釀酒酵母種子液；取常見的產(chǎn)酯酵母接種至IOml17Brix杏皮渣汁中28°C培養(yǎng)36h，得到產(chǎn)酯酵母種子液。
[0120](7)固態(tài)酒精發(fā)酵 :以4.5% (v/v)接種量將釀酒酵母種子液和以2.25% (v/v)接種量將產(chǎn)酯酵母種子液接入步驟(5)中制備的18%混合漿中，按重量份配比，加入為混合漿:稻殼按照3: I配比的稻殼，密閉發(fā)酵，28°C發(fā)酵6d，得杏皮渣酒精發(fā)酵液。
[0121](8)固態(tài)醋酸發(fā)酵:取斜面保藏的醋酸桿菌突變株Acetobacter pomorum AcFlCCTCC No:M2013554，1環(huán)接種至IOml 3% (v/v)步驟(7)制備的杏皮渣酒精發(fā)酵液中，30°C培養(yǎng) 24h，得到醋酸桿菌突變株 Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 種子液；按14% (v/v)的接種量將醋酸桿菌突變株Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554種子液接入杏皮渣酒精發(fā)酵液步驟(J)制備的杏皮渣酒精發(fā)酵液中，31°C靜止發(fā)酵 25d。
[0122](9)杏皮渣醋澄清:按照每100mL杏皮渣醋加入6ml質(zhì)量濃度為4%的皂土，澄清24h, 4500r/min離心5min,收集澄清液,得杏皮洛醋。
[0123](10)成品殺菌:將杏皮渣醋采用常見的75°C保持3min殺菌。
[0124]在初始酒精度為6% (v/v)的混合漿酒精發(fā)酵醅中接種14% (v/v)的醋酸菌Fl種子液，31°C靜止發(fā)酵25d，可使其產(chǎn)酸量達(dá)到8.16g/100ml，并且杏皮渣醋的感官評(píng)價(jià)非常出色。在初始酒精度為10% (v/v)的杏皮渣汁中接種Fl菌株發(fā)酵7d產(chǎn)酸量可以達(dá)到
1.03g/100ml,因此耐酒精性能優(yōu)良，具有耐高酸性能；在28°C -36°C之間可以發(fā)酵杏皮渣酒精發(fā)酵液，因此適應(yīng)溫度范圍大。
[0125]本發(fā)明提供一種通過上述利用突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCCNo:M2013554固態(tài)發(fā)酵制備工藝釀造的杏皮渣醋，得到的杏皮渣醋具備優(yōu)良品質(zhì):[0126](I)感官指標(biāo):色澤:棕黃色或淺黃色、澄清透明；氣味:具有典型的杏果香氣，有良好的醋味；口感:酸味較濃、余味呈甜、具有杏果典型的風(fēng)味。
[0127](2)理化指標(biāo):原醋產(chǎn)品酸度:8.16g/100ml ;澄清后酸度:6.18-6.56g/100ml ;可溶性固形物含量:4.67% ;氨基酸總量:0.54% ;香氣成分:酯類物質(zhì)鑒定出32種，醇類物質(zhì)21種,醛類物質(zhì)9種，酸類物質(zhì)12種，烯類物質(zhì)5種。
[0128](3)衛(wèi)生指標(biāo):菌落總數(shù):未檢出；大腸菌群:未檢出；致病菌:未檢出。
[0129]實(shí)施例五:利用突變株醋酸桿菌Acetobacterpomorum AcFl CCTCC No:M2013554固態(tài)釀造杏皮渣醋工藝參數(shù)的確定
[0130](I)大米糖化醪制備試驗(yàn):
[0131]大米醪液化的最佳工藝參數(shù)為:中溫α -淀粉酶的酶用量為12U/g，大米漿底物濃度為25%，液化時(shí)間為45min，液化溫度為65°C。
[0132]大米醪糖化的最佳工藝參數(shù)為:糖化酶的酶用量為180U/g，糖化時(shí)間為180min，糖化溫度為70°C。
[0133](2)混合漿滅菌條件試驗(yàn):
[0134]混合漿在處理過程中存在大量微生物，在酒精發(fā)酵前需進(jìn)行滅菌。以營(yíng)養(yǎng)瓊脂、孟加拉紅為培養(yǎng)基測(cè)定菌落總數(shù)和酵母菌，見表1。
[0135]表1:混合漿滅菌試驗(yàn)處理及結(jié)果
[0136]
【權(quán)利要求】
1.一種用于杏皮洛醋固態(tài)發(fā)酵的醋酸菌突變株Acetobacter pomorum AcFl,其特征在于，醋酸菌突變株 Acetobacter pomorum AcFl 的保藏號(hào)為 CCTCC No:M2013554。
2.如權(quán)利要求1所述的菌種保藏號(hào)為CCTCCNo:M2013554用于杏皮渣醋固態(tài)發(fā)酵的醋酸菌突變株Acetobacter pomorum AcFl的選育方法,其特征在于,包括下列步驟: (1)醋酸菌原生質(zhì)體的制備:將篩選常見的醋酸菌活化培養(yǎng)液以2%(v/v)的接種量接入到100mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，30°C，120r/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取5ml培養(yǎng)液，3500r/min離心15min，棄上清液留菌體沉淀，分別取5mlHM緩沖液洗滌菌體2次，3500r/min離心15min離心棄上清液，用0.2mg/ml溶菌酶液懸浮菌體沉淀,30 °C緩慢震蕩，每隔15min取酶解液涂片，革蘭氏染色后鏡檢，鏡檢原生質(zhì)體生成約80 %后，3500r/min離心15min離心棄酶液，用HM緩沖液洗滌終止酶解備用；HM緩中液的重量組成為:0.4% NH4Cl,1.2 % Tris,0.0035 % KCl,0.0058 % NaCU0.03 % Na2SO4.10Η20、0.426 % MgCl2.5Η20、6.846%蔗糖、ρΗ7.5、余量為水； (2)原生質(zhì)體復(fù)合誘變:以亞硝基胍和紫外線二者交替處理醋酸菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變；先用8mg/ml亞硝基胍處理原生質(zhì)體20min后，再用照射距離30cm的紫外線處理60s，獲得醋酸菌突變株，所得的復(fù)合誘變?cè)|(zhì)體溶液在暗環(huán)境下，用雙層法復(fù)生培養(yǎng)，30°C條件下培養(yǎng)3-5d ； (3)醋酸菌原生質(zhì)體的再生:采用雙層平板法，取0.1ml制備好的原生質(zhì)體溶液，涂布在固體再生培養(yǎng)基下層，迅速加入4ml固體再生培養(yǎng)基上層溫度40°C，30°C靜置培養(yǎng)3-5d ； (4)醋酸菌突變株平板分離純化:取再生出的醋酸菌突變株劃線涂布于碳酸鈣平板和溴甲酌 紫平板得到醋酸菌 Acetobacter pomorum AcFlCCTCC No:M2013554,在 4°C保藏。
3.如權(quán)利要求2所述`的菌種保藏號(hào)為CCTCCNo:M2013554用于杏皮渣醋固態(tài)發(fā)酵的醋酸菌突變株Acetobacter pomorum AcFl的選育方法,其特征在于,所述的固體再生培養(yǎng)基上層的重量組成為:0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.5% NaCl,PH7.2,0.8%瓊脂、余量為HM緩沖液。
4.如權(quán)利要求2所述的菌種保藏號(hào)為CCTCCNo:M2013554用于杏皮渣醋固態(tài)發(fā)酵的醋酸菌突變株Acetobacter pomorum AcFl的選育方法,其特征在于,所述的固體再生培養(yǎng)基下層的重量組成為:0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.5% NaCl,PH7.2、2%瓊脂、余量為HM緩沖液。
5.如權(quán)利要求2所述的菌種保藏號(hào)為CCTCCNo:M2013554用于杏皮渣醋固態(tài)發(fā)酵的醋酸菌突變株Acetobacter pomorum AcFl的選育方法,其特征在于,所述的碳酸鈣分離培養(yǎng)基的重量組成為:葡萄糖I %、酵母浸粉I %、165°C干熱滅菌30min的碳酸鈣2%、無水乙醇3% (v/v)、瓊脂L 8%、余量為水。
6.一種利用菌種保藏號(hào)為CCTCC No:M2013554突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorumAcFl CCTCC No:M2013554固態(tài)發(fā)酵釀造杏皮渣醋的制備工藝，其特征在于，所述的固態(tài)發(fā)酵釀造具體步驟如下: (1)原料預(yù)處理:選擇無霉變、黃色干杏皮渣，去除雜物，并用清水將杏皮渣上的泥土、雜物洗凈待用；大米用萬能粉碎機(jī)打碎，過40目篩，制成大米粉；稻殼121°C，15min滅菌； (2)制備杏皮渣汁:將洗凈的干杏皮渣放入50°C的溫水中，按重量份配比為杏皮渣:溫水為1: 5，浸泡4h，過濾取汁，調(diào)整可溶性固形物為18%，100°C水浴滅菌5min ; (3)制備杏皮渣漿:采用高壓蒸煮和酶解結(jié)合法，將杏皮渣和水按重量比為1: 6浸泡2h后破碎打漿，在121°C高壓lOmin，冷卻到室溫后加入杏皮渣重量200U/g的果膠酶和150U/g的纖維素酶，在50°C下酶解4h ； (4)制備大米糖化醪:取重量份配比為大米粉:溫水為1: 3配制成醪液，將醪液先用12U/g中溫α -淀粉酶，在65°C條件下液化45min，再加入180U/g糖化酶，在70°C條件下180min ； (5)將步驟(3)制備的杏皮渣漿和步驟(4)制備的大米糖化醪以重量份配比1:1混合獲得混合漿，將獲得混合漿經(jīng)殺菌條件下100°C處理5min ； (6)釀酒酵母種子液和產(chǎn)酯酵母種子液的制備:將常見的釀酒酵母接種至IOml17%杏皮渣汁中，28°C培養(yǎng)24h，得到釀酒酵母種子液；取常見的產(chǎn)酯酵母接種至IOml 17%杏皮渣汁中28°C培養(yǎng)36h，得到產(chǎn)酯酵母種子液； (7)固態(tài)酒精發(fā)酵:以4.5% (v/v)接種量將釀酒酵母種子液和以2.25% (v/v)接種量將產(chǎn)酯酵母種子液接入步驟(5)中制備的18%混合漿中，按重量份配比，加入為混合漿:稻殼按照3: I配比的稻殼，密閉發(fā)酵，28°C發(fā)酵6d，得杏皮渣酒精發(fā)酵液； (8)固態(tài)醋酸發(fā)酵:取斜面保藏的醋酸桿菌突變株Acetobacterpomorum AcFl CCTCCNo:M2013554，1環(huán)接種至IOml 3% (v/v)步驟(7)制備的杏皮渣酒精發(fā)酵液中，30°C培養(yǎng)24h,得到醋酸桿菌突變株Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554種子液；按 14%(v/v)的接種量將醋酸桿菌突變株 Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554 種子液接入步驟(J)制備的杏皮`渣酒精發(fā)酵液中，31°C靜止發(fā)酵25d; (9)杏皮渣醋澄清:按照每100mL杏皮渣醋加入6ml質(zhì)量濃度為4%的皂土，澄清24h，4500r/min離心5min,收集澄清液,得杏皮洛醋； (10)成品殺菌:將杏皮渣醋按照75°C保持3min殺菌。
7.一種利用權(quán)利要求1提供的菌種保藏號(hào)為CCTCC No:M2013554突變株醋酸桿菌Acetobacter pomorum AcFl CCTCC No:M2013554和權(quán)利要求6提供的固態(tài)發(fā)酵制備工藝釀造制備的杏皮渣醋。
【文檔編號(hào)】C12N15/01GK103865841SQ201410037460
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年1月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月19日
【發(fā)明者】傅力, 吳越 申請(qǐng)人:韓山師范學(xué)院