專利名稱：一種¹³C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定性同位素標(biāo)記化合物生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及采用微生物發(fā)酵制備13c 穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素高分子聚合物的方法。
背景技術(shù)：
自然界的纖維素絕大部分是由植物產(chǎn)生的，少數(shù)微生物也能合成纖維素，微生物 合成的纖維素與天然纖維素結(jié)構(gòu)非常相似，都是由葡萄糖以0-1，4_糖苷鍵連接而成的 高分子化合物。能夠合成纖維素的微生物種類很多，主要有醋酸桿菌屬(AcetobacteR)、 產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、八疊球菌屬(Sarcina)、根瘤菌屬(Rhizobium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、固氮菌屬(Azotobacter)和氣桿菌屬(Aerobacter)。其中比較典型的是醋 酸桿菌屬中的木醋桿菌(Acetobacter xylinus)，它具有很高的纖維素生產(chǎn)能力。通常采用化學(xué)方法合成穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的化合物，利用生物法合成穩(wěn)定性同位 素標(biāo)記化合物的報(bào)道較少，中國(guó)專利公開(kāi)了一種利用生物發(fā)酵法合成15N穩(wěn)定性同位素標(biāo) 記精氨酸(CN 1869244A)、15N標(biāo)記亮氨酸(CN 101235402A)的方法等。但是，還未見(jiàn)有利用 微生物發(fā)酵合成并有效制備13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的專利報(bào)道。利用微生物合成13C 穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素，13c容易標(biāo)記且豐度高，工藝簡(jiǎn)單，制備方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物發(fā)酵合成并制備13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維 素的方法。本發(fā)明所述的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的生產(chǎn)制備方法如下(1)選用菌株選取適用發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的醋酸桿菌屬，以木醋桿菌(Acetobacter xylinus)為代表。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基以13C6葡萄糖為唯一碳源的M9基本培養(yǎng)基，其配方為磷酸氫二鈉5.0 7.0g/l， 磷酸二氫鉀 2. 0 4. 0g/l，氯化鈉 0. 5 1. 0g/l，氯化銨 1. 0 2. 0g/l，MgS04 '7H20 0. 4 0. 5g/l, CaCl2 2H2010 15mg/l，13C6 葡萄糖 10 30g/l。⑶靜置培養(yǎng)取1環(huán)活化好的斜面種子接入液體活化培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)24 36h，搖床轉(zhuǎn)速 為160rpm，作為預(yù)培養(yǎng)的種子。靜置培養(yǎng)前的預(yù)培養(yǎng)將上述種子接種13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng)基，接種量6 8%，28°C 30°C振蕩培養(yǎng)24 36h，搖床轉(zhuǎn)速為160 180rpm，作為靜置培養(yǎng)的種子。靜置培養(yǎng)將13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng)基活化的種子，接種13C6葡萄糖-M9液體培 養(yǎng)基，接種量6 8%，28°C 30°C靜置培養(yǎng)30d左右。靜置培養(yǎng)采用淺層培養(yǎng)的方法，95mm 直徑的滅菌扁燒杯盛有50 80ml 13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng)基，可換氣的培養(yǎng)用膜封口。
⑷分離提純將靜置培養(yǎng)獲得的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素置于已預(yù)熱至60°C 80°C的蒸餾 水中，60°C 80°C振蕩洗滌20min 30min，搖床轉(zhuǎn)速為150 250rpm ；取出13C穩(wěn)定性同 位素標(biāo)記纖維素并置于已預(yù)熱至60°C 80°C的lmol/1的NaOH溶液中，60°C 80°C振蕩洗 滌20min 30min，搖床轉(zhuǎn)速為150 250rpm ；取出13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素并置于已 預(yù)熱至60°C 80°C的lmol/1的HAC溶液中，60°C 80V振蕩洗洚20min 30min，搖床轉(zhuǎn) 速為150 250rpm，重復(fù)三次；最后用雙蒸水沖洗13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素，冷凍真空 干燥獲得產(chǎn)品。所述步驟(3)斜面培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氫二 鈉 10g/l，葡萄糖 20g/l，瓊脂粉 15g/l，HAC 調(diào) pH 6.0。所述液體活化培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10g/l，酵母抽提物7.5g/l，磷酸氫二鈉 10g/l，葡萄糖 20g/l，HAC 調(diào) pH 6.0。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，目的在于幫助讀者更好地理解 本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。實(shí)施例1 使用木醋桿菌(Acetobacter xylinus)為出發(fā)菌株，使用的培養(yǎng)基包括斜面培養(yǎng) 基、液體活化培養(yǎng)基、13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基的配方如下 斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氫二鈉10g/l，葡萄糖20g/l， 瓊脂粉 15g/l，HAC 調(diào) pH 6.0。液體活化培養(yǎng)基蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氫二鈉10g/l，葡萄糖 20g/l，HAC 調(diào) pH 6.0。13C6葡萄糖-M9培養(yǎng)基磷酸氫二鈉6. 8g/l，磷酸二氫鉀3. Og/1，氯化鈉0. 5g/l， 氯化銨 1. Og/1, MgS04 7H20 0. 4 0. 5g/l，CaCl2 2H20 10 15mg/l，13C6 葡萄糖 20g/l。取1環(huán)活化好的斜面種子接入液體活化培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)24 36h，搖床轉(zhuǎn)速 為160rpm，作為預(yù)培養(yǎng)的種子。將上述種子接種13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng)基，接種量6%， 30°C振蕩培養(yǎng)24 36h，搖床轉(zhuǎn)速為160rpm，作為靜置培養(yǎng)的種子。將13C6葡萄糖-M9液 體培養(yǎng)基活化的種子，接種13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng)基，接種量6%，30°C靜置培養(yǎng)30d。靜 置培養(yǎng)采用淺層培養(yǎng)的方法，95mm直徑的滅菌扁燒杯盛有80ml 13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng) 基，可換氣的培養(yǎng)用膜封口。培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)細(xì)菌纖維素膜厚度達(dá)5mm左右時(shí)，適度搖動(dòng)培 養(yǎng)基，使細(xì)菌纖維素膜微浸入液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。將靜置培養(yǎng)獲得的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素置于已預(yù)熱至70°C的蒸餾水中， 70°C振蕩洗滌20min，搖床轉(zhuǎn)速為160rpm ；取出13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素并置于已預(yù)熱 至70°C的lmol/1的NaOH溶液中，70°C振蕩洗滌20min，搖床轉(zhuǎn)速為160rpm ；取出13C穩(wěn)定 性同位素標(biāo)記纖維素并置于已預(yù)熱至70°C的lmol/1的HAC溶液中，70°C振蕩洗滌20min， 搖床轉(zhuǎn)速為160rpm，重復(fù)三次；最后用雙蒸水沖洗13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素，冷凍真空 干燥獲得產(chǎn)品。經(jīng)同位素比率質(zhì)譜儀分析得到的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素產(chǎn)品，13C的 豐度達(dá)99%。
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實(shí)施例2 使用的菌種、培養(yǎng)基培養(yǎng)方式基本同實(shí)施例1。靜置培養(yǎng)采用淺層培養(yǎng)的方法， 95mm直徑的滅菌扁燒杯盛有50ml13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng)基，可換氣的培養(yǎng)用膜封口。培 養(yǎng)過(guò)程中保持靜置培養(yǎng)狀態(tài)不變。將靜置培養(yǎng)獲得的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素置于已 預(yù)熱至80°C的蒸餾水中，80°C振蕩洗滌30min，搖床轉(zhuǎn)速為220rpm ；取出13C穩(wěn)定性同位素 標(biāo)記纖維素并置于已預(yù)熱至80°C的lmol/1的NaOH溶液中，80°C振蕩洗滌30min，搖床轉(zhuǎn)速 為220rpm ；取出13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素并置于已預(yù)熱至80°C的lmol/1的HAC溶液 中，80°C振蕩洗滌30min，搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，重復(fù)三次；最后用雙蒸水沖洗13C穩(wěn)定性同位 素標(biāo)記纖維素，冷凍真空干燥獲得產(chǎn)品。經(jīng)同位素比率質(zhì)譜儀分析得到的13C穩(wěn)定性同位素 標(biāo)記纖維素產(chǎn)品，13C的豐度達(dá)99%。
權(quán)利要求
一種13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的制備方法，其特征在于，利用微生物發(fā)酵合成并制備13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的方法。
2.權(quán)利要求1所述的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的制備方法，其特征在于，使用的微 生物為醋酸桿菌屬，木醋桿菌(Acetobacter xylinus)及突變菌株，使用菌株為常規(guī)菌種， 各菌種保藏中心均有保藏。
3.權(quán)利要求1所述的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng) 基配方，13C6葡萄糖-M9培養(yǎng)基磷酸氫二鈉5. 0 7. Og/1，磷酸二氫鉀2. 0 4. Og/1，氯 化鈉 0. 5 1. Og/1，氯化銨 1. 0 2. Og/1, MgS04 7H20 0. 4 0. 5g/l, CaCl2 2H20 10 15mg/l，13C6 葡萄糖 10 30g/l。
4.權(quán)利要求1所述的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的制備方法，其特征在于，28°C 30°C條件下靜置培養(yǎng)30d，培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)細(xì)菌纖維素膜5mm左右厚時(shí)，適度搖動(dòng)培養(yǎng)基，使 細(xì)菌纖維素膜微浸入液體培養(yǎng)基。靜置培養(yǎng)的種子需要經(jīng)過(guò)13C6葡萄糖-M9液體培養(yǎng)基活 化預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C 30°C。
5.權(quán)利要求1所述的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的制備方法，其特征在于，60°C 80°C酸堿交替洗滌，每次作用20min 30min，搖床轉(zhuǎn)速為150 250rpm。提純的13C穩(wěn)定 性同位素標(biāo)記纖維素經(jīng)冷凍干燥得到最終產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素的制備方法，該方法包括以下步驟(1)選用細(xì)菌纖維素高產(chǎn)木醋桿菌為出發(fā)菌株；(2)13C6葡萄糖-M9培養(yǎng)基用作發(fā)酵培養(yǎng)基；(3)30℃左右靜置培養(yǎng)30d；(4)80℃左右酸堿交替洗滌、分離提純細(xì)菌纖維素，最后經(jīng)冷凍干燥得到13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備要求不高，方便在實(shí)驗(yàn)室條件下制備13C高豐度的13C穩(wěn)定性同位素標(biāo)記纖維素產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12P19/04GK101824445SQ20091007930
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者呂迪, 呼慶, 莊國(guó)強(qiáng), 白志輝, 馬安周 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心