脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法及用其生產(chǎn)反式4-羥基-l-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法，具體包括重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法和將L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化體系中助劑的種類、濃度及轉(zhuǎn)化條件，為建立生物轉(zhuǎn)化法工業(yè)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸工藝提供了重要科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法及用其生產(chǎn)反式4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于屬于酶工程和生物催化領(lǐng)域，具體涉及一種重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法和利用脯氨酸羥化酶將L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]輕脯氨酸(Hydroxy pro line, Hyp)不屬于常見20種氨基酸,是脯氨酸羥基化修飾的結(jié)果，羥基通常加在第4或是第3位碳上。由于有兩個不對稱的碳原子，所以羥脯氨酸有4種立體異構(gòu)體。分別為反式-4-羥基-L-脯氨酸，順式-4-羥基-L-脯氨酸，反式-3-羥基-L-脯氨酸和順式-3-羥基-L-脯氨酸。
[0003]反式-4-羥基-L-脯氨酸在哺乳動物細(xì)胞中主要存在于膠原蛋白中，對形成穩(wěn)定的三股螺旋膠原蛋白具十分重要的作用，可使結(jié)締組織的彈性和韌性得到加強(Shibasaki, T.Mori, H.0zaki, A.2000)。體液羥脯氨酸平衡失調(diào)會造成許多疾病，例如營養(yǎng)不良，老年癡呆癥，牙齒、骨骼中的軟骨和韌帶組織的韌性減弱以及組織纖維化疾病等(Rajesh N.Kalaria, Andrea B.Pax.1995)。
[0004]近年來，羥脯氨酸的研究和開發(fā)已引起醫(yī)藥、生化、食品及美容業(yè)等方面的廣泛關(guān)注。在醫(yī)藥方面，由于其具有多種生理功能與獨特的生物活性，可作為各種軟組織疾病的藥物，如結(jié)締組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，又可加快傷口愈合，治療各種皮膚疾病。反式-4-羥基-L-脯氨酸易于衍生化，藥理活性多樣，近年來逐漸被應(yīng)用到原料藥手性中間體領(lǐng)域，用于合成新一代培南類抗生素、抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等多種新創(chuàng)制藥物的合成。由于其具有抗氧化、抗輻射的作用，在美容業(yè)方面，可以作為化妝品添加劑。目前，世界用量為500噸/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趨勢。
[0005]目前，我國反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)主要采用化學(xué)水解提取工藝，以動物膠原蛋白為原料，通過強酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過程制備，“三廢”排放量大、污染嚴(yán)重，能耗高、純度低及生產(chǎn)成本高。因此，利用節(jié)能、污染少的生物催化法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸勢在必行。
[0006]生物轉(zhuǎn)化法是指利用細(xì)菌或真菌細(xì)胞中的酶將底物分子轉(zhuǎn)化為功能產(chǎn)物的過程。反式-4-羥基-L-脯氨酸生物轉(zhuǎn)化法是指利用L-脯氨酸為底物，在Fe2+、α -酮戊二酸和L-抗壞血酸存在的條件下，利用L-脯氨酸羥化酶將L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸。反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因(GenBank ID:D78338.1)長816核苷酸，編碼272個氨基酸殘基，GC含量為66.67%，研究發(fā)現(xiàn)，該酶蛋白主要以包涵體形式出現(xiàn)(ChristianKleina, Wolfgang Huttela.2011)。
[0007] 2011年，德國科學(xué)家Christian Klein對含有伴因子的大腸桿菌工程菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，在37°C下，140 rpm培養(yǎng)重組工程菌為0D600=1.1 - 1.4時，加入0.2禮IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，隨后，再加入6.25mM L-脯氨酸，0.5 mM硫酸亞鐵，8 mM α-酮戊二酸，28°C條件下，140rpm培養(yǎng)72h后，測得的將脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率僅為61%，底物投入量和轉(zhuǎn)化效率都比較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)反式-4-L-脯氨酸。
[0008]另外，對于工程菌株的酶表達(dá)，多采用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)做誘導(dǎo)劑，其誘導(dǎo)效果雖好，但價格昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0009]在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段，可用于高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸。較全長酶，該基因片段編碼酶活性高，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間短，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景(已公布專利號為:CN 103146720A 和 CN 103275998 A)。
[0010]在前期研究中，采用的轉(zhuǎn)化體系為:200mM L-脯氨酸、200mM α -酮戊二酸、6mM硫酸亞鐵、6mM L-抗壞血酸、80mM pH 6.5 MES緩沖液及1% Nonidet P-40。其中NonidetP-40助劑也存在價格昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題提供一種脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法，同時提供用其生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法，使該方法具備成本低、轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間短，工業(yè)應(yīng)用前景好的優(yōu)點。
[0012]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法，具體采用下述技術(shù)方案為:
一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法，其為將含重組質(zhì)粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株的單克隆接種至下述發(fā)酵培養(yǎng)基直接自誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基為:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L,七水硫酸亞鐵0.1 g/L,乳糖6-10 g/L。
[0013]進(jìn)一步的，所述重組質(zhì)粒的工程菌株采用如下方法構(gòu)建:將反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因的截短片段構(gòu)建到表達(dá)載體PET-M-3C中，獲得重組質(zhì)粒PET-M-SC-Pfflyd1^257,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21_CodonPlus (DE3)中，獲得了重組大腸桿菌工程菌。
[0014]進(jìn)一步的，所述自誘導(dǎo)培養(yǎng)條件如下:溫度24-37°C，轉(zhuǎn)速為140-220 rpm，培養(yǎng)時間為 20-24h。
[0015]進(jìn)一步的，還包括離心收集菌體的步驟。
[0016]本發(fā)明的另一方面提供了一種利用上述脯氨酸羥化酶生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法，其采用如下技術(shù)方案:
一種利用脯氨酸羥化酶生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法，將菌體懸浮于轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中對L-脯氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化,所述菌體與轉(zhuǎn)化液的比例為lg: 8-18mL,轉(zhuǎn)化液包括MES 緩沖液 80-240m M，L-脯氨酸 180_250mM、α -酮戊二酸 180_250mM，F(xiàn)eSO4 6_9mM，L-抗壞血酸l_5mM和助劑，所述助劑選自20-80mg/L的頭孢替安抗生素、0.1-1.0mg/mL SDS、
0.5%_4%(v/v)TritonX-100、或 0.1-1.5mg/mL 溶菌酶中的一種。
[0017]進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)化液ρΗ6.3-6.8，反應(yīng)溫度為24-28°C，轉(zhuǎn)速為140-220 rpm，時間為 60-72h。[0018]進(jìn)一步的，還包括離心去除菌體的步驟。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為:
本發(fā)明通過對重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)條件和將L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化體系中助劑的種類、濃度及轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，本發(fā)明提供的方法不僅成本低、轉(zhuǎn)化效率高，而且轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間短，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1自誘導(dǎo)培養(yǎng)基乳糖濃度的優(yōu)化；
圖2轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中頭孢替胺(TTCT)抗生素濃度的優(yōu)化；
圖3轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中SDS濃度的優(yōu)化；
圖4轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中TritonX-100濃度的優(yōu)化；
圖5轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中溶菌酶濃度的優(yōu)化；
圖6轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件優(yōu)化的響應(yīng)面實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0021]下面將結(jié)合附圖1-6和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0022]實施例1a重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法
將含重組質(zhì)粒的工程菌株的單克隆接種至發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸亞鐵0.1g/L和乳糖8 g/L，直接于28°C、140rpm搖床自誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后，當(dāng)菌液濃度為OD6c?達(dá)到2-2.5時，離心收集菌體。
[0023] 實施例1b重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法
將含重組質(zhì)粒的工程菌株的單克隆接種至發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸亞鐵0.1g/L和乳糖8 g/L，直接于24°C、220rpm搖床自誘導(dǎo)培養(yǎng)20小時后，當(dāng)菌液濃度為OD6c?達(dá)到2-2.5時，離心收集菌體。
[0024]實施例1c重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法
將含重組質(zhì)粒的工程菌株的單克隆接種至發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸亞鐵0.1g/L和乳糖8 g/L，直接于37°C、180rpm搖床自誘導(dǎo)培養(yǎng)22小時后，當(dāng)菌液濃度為OD6c?達(dá)到2-2.5時，離心收集菌體。
[0025]試驗例I重組大腸桿菌工程菌中脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)條件的考察
與實施例1不同之處在于培養(yǎng)基中乳糖的濃度不同，分別設(shè)計乳糖濃度為4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L和12 g/L(編號為試驗例la、試驗例lb、實施例la、試驗例lc、試驗例Id)的五組試驗來測量不同自誘導(dǎo)培養(yǎng)基獲得菌體L-脯氨酸羥化酶活性。具體測量方法如下:各組分別稱取Ig菌體懸浮于IOmL轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中[200mM L-脯氨酸、200mM α -酮戊二酸、6mM 硫酸亞鐵、6mM L-抗壞血酸、80mM MES 緩沖液(pH 6.5)、1% Nonidet Ρ-40]，于 28°C、140rpm振蕩反應(yīng)72h，離心去除菌體，通過HPLC檢測上清中反式_4_羥基-L-脯氨酸的生成情況來反映不同自誘導(dǎo)培養(yǎng)基獲得菌體L-脯氨酸羥化酶活性，具體見表1:
表1不同自誘導(dǎo)培養(yǎng)基獲得菌體的L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率
【權(quán)利要求】
1.一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法，其特征在于:其為將含重組質(zhì)粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株的單克隆接種至下述發(fā)酵培養(yǎng)基直接自誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基為:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，氯化鈉2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸亞鐵0.1 g/L，乳糖6-10 g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法，其特征在于:所述重組質(zhì)粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株采用如下方法構(gòu)建:將反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因的截短片段(/7也構(gòu)建到表達(dá)載體pET-M-3C中，獲得重組質(zhì)粒PET-M-SC-Pfflyc^257，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21-CodonPlus (DE3)中，獲得了重組大腸桿菌工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法，其特征在于:所述自誘導(dǎo)培養(yǎng)條件如下:溫度24-37°C，轉(zhuǎn)速為140-220 rpm，培養(yǎng)時間為20-24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的一種重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法，其特征在于:還包括離心收集菌體的步驟。
5.一種利用權(quán)利要求1-3任一項所述重組大腸桿菌工程菌中L-脯氨酸羥化酶高活性自誘導(dǎo)表達(dá)方法得到的脯氨酸羥化酶生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:將菌體懸浮于轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中對L-脯氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述菌體與轉(zhuǎn)化液的比例為lg: 8-18mL,轉(zhuǎn)化液包括MES緩沖液80_240mM，L-脯氨酸180_250mM、α -酮戊二酸.180-250mM, FeSO4 6_9mM，L-抗壞血酸l_5mM和助劑，所述助劑選自20_80mg/L的頭孢替安抗生素、0.1-1.0mg/mL SDS,0.5%_4%(v/v)TritonX-100、或0.1-1.5mg/mL溶菌酶中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用脯氨酸羥化酶生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述轉(zhuǎn)化液PH6.3-6.8，反應(yīng)溫度為24-28°C，轉(zhuǎn)速為140-220 rpm,時間為60-72h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用脯氨酸羥化酶生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的高效轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:還包括離心去除菌體的步驟。
【文檔編號】C12P13/24GK103911355SQ201410029052
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】李瑋, 張金秀, 薛張偉, 王立安, 李存會, 鞠建松, 李天云, 張琳琳, 陳嬌嬌, 張慶 申請人:河北博倫特藥業(yè)有限公司, 石家莊萬尚醫(yī)藥科技有限公司, 河北師范大學(xué)