一種重組高溫普魯蘭酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組高溫普魯蘭酶及其制備方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，其特征在于將編碼高溫普魯蘭酶的基因裝載在pHsh表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主中進(jìn)行含高溫普魯蘭酶的工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，通過超聲破碎、加熱除去大腸桿菌自主表達(dá)的大部分雜蛋白、親和層析分離純化得到高溫普魯蘭酶，重組高溫普魯蘭酶最適反應(yīng)溫度高達(dá)70℃，能在70～80℃的高溫均能發(fā)揮良好的催化活性，其適應(yīng)pH值的范圍較寬，使得該酶非常適合在淀粉制糖工業(yè)中與淀粉酶、糖化酶配合使用，降低糖化時間，提高糖化效率；本發(fā)明的重組高溫普魯蘭酶可廣泛應(yīng)用于食品、釀酒、飼料、醫(yī)藥、造紙、紡織等工業(yè)中。
【專利說明】—種重組高溫普魯蘭酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001]本發(fā)明涉及一種重組高溫普魯蘭酶及其制備方法，屬生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】：
[0002]普魯蘭多糖是麥芽三糖通過α-1，6_糖苷鍵連接而成的線性多糖。普魯蘭酶(EC3. 2. I. 41)是一種能夠?qū)Ｒ恍运馄蒸斕m多糖、糖原、淀粉、支鏈淀粉和其它低聚糖中α -1，6糖苷鍵的脫枝酶(脫枝淀粉酶)。根據(jù)底物特異性和水解產(chǎn)物的不同，普魯蘭酶通常被分為四種類型：1型普魯蘭酶，可以水解普魯蘭多糖和支鏈寡糖中的α-1，6糖苷鍵生成麥芽三糖和直鏈寡糖；11型普魯蘭酶，既能水解普魯蘭多糖中的α-I，6糖苷鍵也能同時水解其他多糖中的α-I，4糖苷鍵；新普魯蘭酶和異普魯蘭酶，作用于普魯蘭多糖中的α-1，4糖苷鍵分別產(chǎn)生潘糖和異潘糖。
[0003]在淀粉制糖工業(yè)中，普魯蘭酶與淀粉酶、淀粉酶和糖化酶混合使用能最大限度地利用淀粉，因此，普魯蘭酶在以淀粉為原料的食品加工、釀造工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。普魯蘭酶與糖化酶并用時，可以大大降低糖化酶的用量，使DE值上升至98%，從而顯著提高原料的利用率和葡萄糖的收率。普魯蘭酶與β_淀粉酶混合使用時，幾乎可以全部將淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖，從而生產(chǎn)出80%以上超高麥芽糖漿。在啤酒生產(chǎn)的糖化工藝中，添加普魯蘭酶可以有效地提高麥芽汁中可發(fā)酵性糖的含量、提高麥汁的利用率和縮短糖化時間。普魯蘭酶還可以用來生產(chǎn)具有穩(wěn)定的凝膠性能、良好的韌性和增稠作用的直鏈淀粉，進(jìn)而利用直鏈淀粉生產(chǎn)出可生物降解的薄膜，或作為添加劑和輔料用于食品工業(yè)和紡織工業(yè)中。此外，普魯蘭酶在酒精、食品、環(huán)保領(lǐng)域中也有重要作用，它有可能和淀粉酶、糖化酶一樣成為一個重要的工業(yè)酶制劑品 種。
[0004]迄今為止，全世界只有諾維信和杰能科兩個國際公司具備普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)能力，國內(nèi)企業(yè)均依靠進(jìn)口，價格昂貴。在傳統(tǒng)的酶法淀粉制糖工藝中，液化時淀粉酶的反應(yīng)條件為pH值6. O~6. 5，溫度是65~90°C，糖化時糖化酶反應(yīng)的最佳pH值為4. O~4. 5之間，溫度是60~65°C，因此，為了配合淀粉酶或糖化酶使用，理想的普魯蘭酶應(yīng)該具備上述工藝特點(diǎn)所要求的特性，其中最重要的特性是要求酶的最適反應(yīng)溫度要在60°C以上，于是研究者們把注意力轉(zhuǎn)移到在高溫下生存的極端高溫微生物，并分離出許多能夠產(chǎn)生高溫性普魯蘭酶的極端微生物，如高溫厭氧菌、嗜熱古細(xì)菌、深海古菌等極端微生物。由于這些極端微生物的生長溫度較高，生長條件苛刻，目標(biāo)酶的自然表達(dá)量都很低，所以很難直接利用這些微生物來工業(yè)化生產(chǎn)普魯蘭酶。
[0005]隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，將這些來源于嗜熱微生物中的普魯蘭酶編碼基因插入到表達(dá)質(zhì)粒后，然后導(dǎo)入到培養(yǎng)簡單、生長迅速的中溫宿主菌如大腸桿菌、酵母菌中表達(dá)，這樣就能高效地生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的普魯蘭酶。
[0006]目前，用于外源基因表達(dá)最成熟的首選是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在表達(dá)載體中選擇最多的是具有T7啟動子的質(zhì)粒，如已經(jīng)商業(yè)化的pET系列；但是，很多重組酶在T7啟動子下誘導(dǎo)表達(dá)時，由于基因的轉(zhuǎn)錄速度太快，新合成的蛋白質(zhì)來不及折疊成具有正確構(gòu)象的成熟蛋白。雖然目標(biāo)蛋白的總表達(dá)量不少，但是很多是以不溶解和無活性的沉淀形式存在。
[0007]本
【發(fā)明者】構(gòu)建的pHsh這一表達(dá)載體，完全不同于具有T7啟動子的載體，它獨(dú)特的熱激啟動子是根據(jù)E. coli中熱休克蛋白基因啟動子的保守序列設(shè)計而成，與具有T7啟動子的載體在對重組蛋白的表達(dá)效果方面相比，具有重組細(xì)胞密度高、不易形成不溶解的、無活性的重組蛋白的優(yōu)勢，從而使得最終的總活性重組蛋白的產(chǎn)量提高。同時，通過熱激方式來誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，避免了 IPTG (T7載體常用的誘導(dǎo)劑）等有毒化學(xué)誘導(dǎo)劑的使用。
[0008]Thermus scotoductus SA-01是在某南非金礦的三千米地下的熱環(huán)境中分離得到的一個極端高溫、耐鹽的需氧、嚴(yán)格異養(yǎng)的微生物，其最適生長溫度為75°C，由它產(chǎn)生的普魯蘭酶具有良好的熱穩(wěn)定性，非常適合淀粉加工工業(yè)之用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種重組高溫普魯蘭酶及其制備方法，將編碼高溫普魯蘭酶的基因裝載在PHsh表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主中進(jìn)行含高溫普魯蘭酶的工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，通過超聲破碎、加熱除去大腸桿菌自主表達(dá)的大部分雜蛋白、親和層析分離純化得到高溫普魯蘭酶，重組高溫普魯蘭酶最適反應(yīng)溫度高達(dá)70°C，能在70~80°C的高溫均能發(fā)揮良好的催化活性，其適應(yīng)pH值的范圍較寬，使得該酶非常適合在淀粉制糖工業(yè)中與淀粉酶、糖化酶配合使用，降低糖化時間，提高糖化效率。
[0010]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的的。
[0011]本發(fā)明所提供的一種重組高溫普魯蘭酶及其制備方法，包括如下步驟：
[0012](I)引物設(shè)計及用PCR法獲取高溫普魯蘭酶的目的基因
[0013]引物設(shè)計如下：
【權(quán)利要求】
1.一種重組高溫普魯蘭酶，其特征在于所述的高溫普魯蘭酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示；所述的高溫普魯蘭酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一種重組高溫普魯蘭酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (O引物設(shè)計及用PCR法獲取高溫普魯蘭酶的目的基因 引物設(shè)計如下： 上游引物：5 ’ ATGCCATGGCCTGGTACGAGGGCGCTTTCTT3 ’，下劃線部分為Nco I的酶切位占. 下游引物：5’ CCGCTCGAGGACCTCCACCCAGATGGCCACG3，，下劃線部分為Xho I的酶切位占. 以高溫細(xì)菌Thermus scotoductus SA-Ol菌株的基因組DNA溶液為模版，在上述上游引物和下游引物的參與下進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后再對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化的PCR產(chǎn)物，最后用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切，得到高溫普魯蘭酶的目的基因； (2)構(gòu)建重組表達(dá)載體 以pHsh為表達(dá)載體，對載體用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切，然后用DNA連接酶與步驟I所得的高溫普魯蘭酶的目的基因片段進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)載體； 所述的PHsh是一種新型大腸桿菌表達(dá)載體，它獨(dú)特的熱激啟動子是根據(jù)E. coli中熱休克蛋白基因啟動子的保守序列設(shè)計而成的，同時它還有一個來源于PUC19的高拷貝復(fù)制子序列； (3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中 將步驟2中得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到含有高溫普魯蘭酶基因的基因工程菌，并在基因工程菌的生長過程中進(jìn)行熱激誘導(dǎo)，使普魯蘭酶得到表達(dá)； (4)收集細(xì)胞，破壁并離心獲得粗酶液 當(dāng)誘導(dǎo)結(jié)束后，用高速離心機(jī)對含有高溫普魯蘭酶基因工程菌的培養(yǎng)液進(jìn)行離心、收集細(xì)胞、重懸細(xì)胞和細(xì)胞通過超聲波進(jìn)行破壁處理，得上清為粗酶液，沉淀為細(xì)胞不可溶性蛋白及細(xì)胞碎片； (5)對步驟4中得到的粗酶液中的重組酶進(jìn)行純化得到純化的重組高溫普魯蘭酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組高溫普魯蘭酶的制備方法，其特征在于所述高溫普魯蘭酶目的基因來源于高溫細(xì)菌Thermus scotoductus SA-Ol。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組高溫普魯蘭酶的制備方法，其特征在于所述步驟3中的大腸桿菌是大腸桿菌菌株K12或其衍生菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重 組高溫普魯蘭酶的制備方法，其特征在于所述的在基因工程菌的生長過程中進(jìn)行熱激誘導(dǎo)，使普魯蘭酶得到表達(dá)是將工程菌在LB培養(yǎng)基中于30°C下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，當(dāng)工程菌的細(xì)胞密度0D_達(dá)到O. 6 — O. 8時，將培養(yǎng)溫度迅速上升到42°C，誘導(dǎo)重組普魯蘭酶表達(dá)，誘導(dǎo)時間6~8小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種重組高溫普魯蘭酶的制備方法，其特征在于所述當(dāng)誘導(dǎo)結(jié)束后，用高速離心機(jī)對含有高溫普魯蘭酶基因工程菌的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，離心速度為8000g，時間為20min ;收集細(xì)胞，然后用2倍于細(xì)胞體積的緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞通過超聲波進(jìn)行破壁，超聲破碎的工作條件為：150W，工作10s，間隔10s，共30min，破碎液為全細(xì)胞蛋白，全細(xì)胞蛋白經(jīng)12000g離心IOmin后，其上清為粗酶液，沉淀為細(xì)胞不可溶性蛋白及細(xì)胞碎片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種重組高溫普魯蘭酶的制備方法，其特征在于所述的對重組酶進(jìn)行純化是對步驟4得的粗酶液在70°C下熱處理lh，20000g離心30min，除去不耐熱的雜蛋白，然后利用重組高溫普魯蘭酶的N-末端含有His-tag，通過鎳離子親和層析Ni-NTA-affinity (：011111111對重組蛋白進(jìn)行純化，用201111、401111、601111、801111和 IM 咪唑梯度洗脫與層析柱結(jié)合 的目的蛋白，得到純化的重組高溫普魯蘭酶。
【文檔編號】C12N9/44GK103834629SQ201410005810
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】吳華偉, 蔚鑫鑫, 吳光旭, 陳麗冰, 高立瓊 申請人:長江大學(xué)