能夠感染犬科動物的流感病毒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動物和在犬科動物中引起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明還涉及用于誘導針對本發(fā)明的流感病毒的免疫應答的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于鑒定本發(fā)明的病毒和診斷本發(fā)明病毒對動物的感染的組合物和方法。
【專利說明】能夠感染犬科動物的流感病毒及其用途
[0001]本申請是申請日為2006年10月19日、發(fā)明名稱為“能夠感染犬科動物的流感病毒及其用途”的中國專利申請200680041958.9(國際申請?zhí)朠CT/US2006/041061)的分案申請。
[0002]相關申請的參考
[0003]本申請是2006年4月21日提交的申請美國序列號11/409,416的部分繼續(xù)申請；并且本申請要求2005年10月19日提交的美國序列號60/728，449 ；2005年12月29日提交的美國序列號60/754，881; 2006年I月14日提交的美國序列號60/759，162; 2006年I月23日提交的美國序列號60/761，451;和2006年3月3日提交的美國序列號60/779，080的優(yōu)先權，將它們的公開都完整(包括發(fā)明簡述、詳述、實施例、權利要求、摘要、附圖、表、核酸序列、氨基酸序列和圖)引入本文作為參考。
[0004]發(fā)明背景
[0005]“狗舍咳嗽”或者感染性氣管支氣管炎(ITB)是狗中的急性、傳染性呼吸系統(tǒng)感染，其特征主要是咳嗽(Ford et al, 1998)。犬ITB被認為是世界上狗的最普遍的感染性呼吸系統(tǒng)疾病，并且當狗在高密度群體環(huán)境如狗舍中居住時，爆發(fā)可以達到流行性比例。多數爆發(fā)是由于直接的狗一狗接觸或者呼吸系統(tǒng)分泌物的氣霧化(Ford et al, 1998)。臨床病征由細菌和病毒的一種或者組合感染引起，所述細菌和病毒可以在上呼吸道和下呼吸道的上皮組織中建群。犬科動物副流感病毒(CPiV)和支氣管博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)細菌是從受侵襲的狗分離的最常見的生物，但是幾種其他病毒，如犬科動物瘟熱病毒(CDV)和犬科動物腺病毒一 I和一 2(CAV-1，CAV-2)，以及細菌如鏈球菌(Streptococcus sp.)、Pasteurella multicoda 和大腸桿菌(Escherichiacoli)可以影響臨床過程和結果(Ford et al, 1998)。盡管在高密度群體中爆發(fā)最有效和快速發(fā)生，具有高的發(fā)病率，但是 并發(fā)的呼吸系統(tǒng)感染和死亡是不常見的。盡管可以發(fā)生威脅生命的繼發(fā)性細菌性肺炎，但是多數ITB病例是自身限制性的并且在沒有任何治療下消退(Ford etal, 1998)ο
[0006]在1992年7月，推測為“狗舍咳嗽”的呼吸系統(tǒng)感染在新英格蘭(New England)、佛羅里達(Florida)、西弗吉尼亞(West Virginia)、威斯康辛(Wisconsin)、堪薩斯(Kansas)、
科羅拉多(Colorado)、俄克拉荷馬(Oklahoma)和亞利桑那州(Arizona)的幾個靈‘提.賽場(greyhound track)變得流行。從獸醫(yī)了解到，多數受侵襲的狗具有后來消退的輕
微咳嗽，但是一打以上的靈.襄.患上了急性出血性肺炎，接著快速死亡(Greyhound Daily
News, 1999)。
[0007]在1998年下半年到1999年上半年,在美國的競賽靈提i句舍中發(fā)生了幾次“狗
舍咳嗽”爆發(fā)，導致強制關閉賽場和隔離美國的所有競賽靈.ft數周(GreyhoundDailyNews, 1999)。在佛羅里達的一個賽場(Palm Beach Kennel Club),在一天中幾乎40%的狗群體中記錄到咳嗽(來自William Duggar博士的個人交流)。類似于1992年的爆發(fā),該咳嗽在多數靈員中消退，但是佛羅里達的10只狗死于“狗舍咳嗽”非特征性的出血性肺炎綜合征(Putnam, 1999)。
[0008]在2003年3月一 4月，在美國東部的靈提賽場發(fā)生“狗舍咳嗽”的另一次爆發(fā)。
認為該爆發(fā)在佛羅里達的四個賽場開始，并且因此幾乎三周中止比賽和狗的隔離。在WestPalm Beach的賽場幾乎25%的狗受到侵襲,而St.Petersburg的Derby Lane中1400條狗幾乎50%發(fā)生咳嗽。再一次，多數狗恢復，但是一些狗死于呼吸系統(tǒng)感染。僅在Derby Lane的呼吸爆發(fā)的估計的經濟影響為2百萬美元。
[0009]沒有公開的報導記載在1992、1998-1999或2003年在競賽靈觀《狗舍中“狗舍咳
嗽”流行的病因或者臨床病理。假定該感染是由于CPiV和/或支氣管博德特氏菌:狗舍咳嗽的兩種最常見的病因。未證實的交流，如網站已經將在一些咳嗽的狗中報導的致命的出血性肺炎規(guī)因于β —溶血性馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcus equi subspecieszooepidemicus),并且將該綜合征稱作“犬鏈球菌中毒性休克”。
[0010]病毒從一個宿主物種傳染到另一個是流感病毒的生態(tài)學和流行病學的關鍵特征(Webster, 1998)。流感病毒的物種間傳染的兩個基本機制是可能的(Websteretal.，1992;Lipatov et al.，2004)。一種是基本上未變的病毒從一個物種直接轉移到另一個物種。該機制的實例包括最近的家禽流感病毒的H5N1亞型對人的感染(Subbarao etal., 1998; Peiris et al., 2004; Guan et al., 2004)和可能地 1918 年的大流行,稱作西班牙流感(Reid et al.，2004)。第二種機制是流感病毒基因組的區(qū)段化性質的結果。用來自不同物種的病毒共感染宿主 可以導致區(qū)段化病毒基因的重排列，和產生能夠感染其他物種的重組體。例如，鳥類和人流感病毒之間基因重排列產生的新的病毒在1957和1968年導致人類流感大流行(Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004; Kawaoka et al., 1989)。
[0011]未改變的流感病毒從自然宿主物種向不同物種的多數直接傳播是最終事件，因為在新物種的個體之間的持續(xù)傳播不能發(fā)生。多種病毒一宿主相互作用是復制和水平傳播所必須的并且為流感病毒在新的宿主中的永續(xù)性提供了強大的屏障(Webby et al.，2004)。因此，流感病毒的新的宿主特異性譜系的建立是不常見的并且僅僅在馴養(yǎng)的家禽、豬、馬和人類中發(fā)生(Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004)。
[0012]因為流感病毒感染的嚴重性質，所以仍然需要診斷、預防和治療流感病毒感染的方法。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動物和在犬科動物中引起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明還涉及用于誘導針對本發(fā)明的流感病毒的免疫應答的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于鑒定本發(fā)明的病毒和診斷本發(fā)明的病毒對動物的感染的組合物和方法。
[0015]本發(fā)明的一方面涉及保護犬科動物免于犬科動物流感的疫苗和方法、包含此類疫苗的藥盒，和使用此類疫苗的方法。該保護包括防止流感和/或其一種或多種(通常兩種或多種)癥狀、減輕其危險、延遲其發(fā)作、減少其擴散、將其減輕、抑制和/或消除。認為本發(fā)明的疫苗、藥盒和方法一般適用于犬科動物。犬科動物包括野生的、動物園的和馴養(yǎng)的犬科動物，包括狼、郊狼和狐貍。犬科動物還包括狗，尤其馴養(yǎng)的狗，如純種和/或雜種陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、獵狗、守衛(wèi)狗、警犬、賽犬和/或實驗用狗。[0016]本發(fā)明還部分涉及保護犬科動物免于流感病毒感染(例如，預防、減輕危險、延遲發(fā)作、抑制、減輕或消除流感病毒感染)的方法。該方法包括施用治療有效量的疫苗，其包含至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。
[0017]本發(fā)明還部分涉及保護犬科動物免于犬科動物流感病毒引起的呼吸系統(tǒng)損傷(例如，預防、減輕危險、延遲發(fā)作、抑制、減輕或消除呼吸系統(tǒng)損傷)的方法。該方法包括對犬科動物施用治療有效量的疫苗，其包含至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。
[0018]本發(fā)明還部分涉及保護犬科動物免于犬科動物流感病毒感染引起的在鼻或口分泌物中具有犬科動物流感病毒(例如，預防、減輕危險、延遲發(fā)作、抑制、減輕或消除鼻或口分泌物中的犬科動物流感病毒)的方法。該方法包括對犬科動物施用治療有效量的疫苗，其包含至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。
[0019]本發(fā)明還部分涉及犬科動物流感疫苗。在一些實施方案中，例如，該疫苗包含治療有效量的至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。
[0020]本發(fā)明還部分涉及用于保護犬科動物免于流感病毒感染的藥盒。該藥盒包含治療有效量的疫苗，該疫苗包含至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。此外，所述藥盒包含至少一種下面的:
[0021]用于對犬科動物施用所述疫苗的裝置，
[0022]可藥用賦形劑，其幫助將疫苗施用于犬科動物，
[0023]可藥用賦形劑，其增強犬科動物對所述疫苗的免疫應答，
[0024]將被犬科動物與疫苗同時消費的食物，和/或
[0025]將被犬科動物與疫苗同時消費的飲食(treat)。
[0026] 申請人:的本發(fā)明的其他優(yōu)點將在閱讀該說明書后對本領域技術人員是顯而易見的。
[0027]附圖簡述
[0028]圖1A-1B顯示了血凝素基因之間的系統(tǒng)發(fā)生關系。圖1A顯示了來自代表性犬、人、鳥類、豬和馬分離群，包括作為外類群的A/Budgerigar/Hokkaido/1/77 (H4)的HA基因樹。圖1B顯示了使用A/Duck/Ukraine/63 (H3)作為外類群，犬流感病毒HA基因與同一時期的和較老的馬HA基因的樹。通過近鄰連接方法從核苷酸序列推論出系統(tǒng)樹并且顯示了 >90%的自展分析值。條形表示核苷酸改變數目/水平樹枝的單位長度。
[0029]圖2A — 2B顯示了在肺中流感H3抗原的免疫組織化學檢測。用針對HA血凝素的小鼠單克隆抗體檢測肺組織切片并通過免疫過氧化物酶反應檢測結合(褐色沉淀)。圖2A
顯示了來自具有自發(fā)疾病的靈.提1的支氣管上皮。檢測支氣管上皮細胞細胞質和呼吸道腔和肺泡腔中巨噬細胞中的病毒Η3抗原。圖2Β顯示了用A/canine/Florida/43/2004(H3N8)接種后5天，來自狗的支氣管上皮。在支氣管上皮細胞細胞質中檢測到病毒H3抗原。比例尺，66 μ mD
[0030]圖3顯示了在死于與流感病毒感染有關的出血性肺炎的靈支氣管中特征性組織學改變。對組織用H&E染色。上圖:具有纖毛上皮細胞、粘液細胞和基細胞的正常支氣管。下圖:來自患有自發(fā)性流感的靈.ft的支氣管。支氣管纖毛上皮細胞有壞死和糜爛。比例尺，100 μ m。
[0031]圖4A-4B顯示了在H3血凝素基因中的系統(tǒng)發(fā)生關系。圖4A顯示了犬科動物流感病毒HA基因與同一時期的和較老的馬HA基因的系統(tǒng)樹。圖4B顯示了犬科動物流感病毒HA蛋白質與同一時期的和較老的馬HA基因的系統(tǒng)樹。通過近鄰連接方法從基因或者氨基酸序列推論出系統(tǒng)樹并且顯示了 >80%的自展分析值。條形表示氨基酸改變數目/水平樹枝的單位長度。
[0032]圖5顯示了在死于與流感病毒感染有關的肺炎的狗的肺中支氣管和支氣管腺的上皮細胞中流感病毒H3蛋白質。上圖:支氣管中纖毛上皮細胞的糜爛。組織用H&E染色。下圖:在支氣管(左)和支氣管腺(右)上皮細胞的細胞質中流感病毒H3蛋白質。將組織用針對流感病毒H3的單克隆抗體染色，通過免疫過氧化物酶反應檢測(褐色沉淀)并用蘇木精復染。
[0033]圖6A-6D顯示了從擴增10倍連續(xù)體外稀釋的轉錄的RNA標準得到的H3和基質基因(圖6A和圖6B)的擴增圖。通過起始RNA濃度的對數值對從每次稀釋得到的閾值循環(huán)數(Ct)作圖，構造H3和基質基因(圖6C和圖6D)的標準曲線。
[0034]圖7顯示用10倍連續(xù)稀釋的病毒原種(包括A/Wyoming/3/2003和A/canine/FL/242/2003)測試Directigen Flu A的靈敏性。紫色三角形指示陽性結果。
[0035]序列簡述
[0036]SEQ ID NO:1是可以根據本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質的犬科動物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
[0037]SEQ ID NO: 2是SEQ ID NO:1編碼的氨基酸序列。
[0038]SEQ ID NO: 3是可以根據本發(fā)明使用的編碼PBl蛋白質的犬科動物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
[0039]SEQ ID NO:4是SEQ ID NO: 3編碼的氨基酸序列。
[0040]SEQ ID N0:5是可以根據本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質的犬科動物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
[0041]SEQ ID NO:6是SEQ ID NO: 5編碼的氨基酸序列。
[0042]SEQ ID N0:7是可以根據本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質的犬科動物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
[0043]SEQ ID NO:8是SEQ ID NO: 7編碼的氨基酸序列。
[0044]SEQ ID N0:9是可以根據本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質的犬科動物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
[0045]SEQ ID NO: 10是SEQ ID NO:9編碼的氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NOill是可以根據本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質的犬科動物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
[0047]SEQ ID NO: 12是SEQ ID NO: 11編碼的氨基酸序列。
[0048]SEQ ID NO: 13是可以根據本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質的犬科動物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。[0049]SEQ ID NO: 14是SEQ ID NO: 13編碼的氨基酸序列。
[0050]SEQ ID N0:15是可以根據本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質的犬科動物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
[0051]SEQ ID NO: 16是SEQ ID NO: 15編碼的氨基酸序列。
[0052]SEQ ID NO: 17是可以根據本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質的犬科動物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
[0053]SEQ ID NO: 18是SEQ ID NO: 17編碼的氨基酸序列。
[0054]SEQ ID NO: 19是可以根據本發(fā)明使用的編碼PBl蛋白質的犬科動物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
[0055]SEQ ID NO: 20是SEQ ID NO: 19編碼的氨基酸序列。
[0056]SEQ ID N0:21是可以根據本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質的犬科動物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
[0057]SEQ ID NO: 22是SEQ ID NO: 21編碼的氨基酸序列。
[0058]SEQ ID NO: 23是可以根據本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質的犬科動物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。 [0059]SEQ ID NO: 24是SEQ ID NO: 23編碼的氨基酸序列。
[0060]SEQ ID N0:25是可以根據本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質的犬科動物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
[0061]SEQ ID NO: 26是SEQ ID NO: 25編碼的氨基酸序列。
[0062]SEQ ID NO: 27是可以根據本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質的犬科動物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
[0063]SEQ ID NO: 28是SEQ ID NO: 27編碼的氨基酸序列。
[0064]SEQ ID NO: 29是可以根據本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質的犬科動物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
[0065]SEQ ID NO: 30是SEQ ID NO: 29編碼的氨基酸序列。
[0066]SEQ ID N0:31是可以根據本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質的犬科動物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
[0067]SEQ ID NO: 32是SEQ ID NO: 31編碼的氨基酸序列。
[0068]SEQ ID N0:33是SEQ ID NO: 16中顯示的HA蛋白質的成熟形式，其中已經除去了N-末端16個氨基酸的信號序列。
[0069]SEQ ID N0:34是SEQ ID NO:32中顯示的HA蛋白質的成熟形式，其中已經除去了N-末端16個氨基酸的信號序列。
[0070]SEQ ID NO:35是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0071]SEQ ID NO:36是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0072]SEQ ID NO:37是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0073]SEQ ID NO:38是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0074]SEQ ID NO:39是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0075]SEQ ID NO:40是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0076]SEQ ID N0:41是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。[0077]SEQ ID NO:42是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0078]SEQ ID NO:43是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0079]SEQ ID NO:44是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0080]SEQ ID NO:45是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0081]SEQ ID NO:46是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0082]SEQ ID NO: 47是可以根據本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質的犬科動物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
[0083]SEQ ID NO: 48是SEQ ID NO: 47編碼的氨基酸序列。
[0084]SEQ ID NO:49是可以根據本發(fā)明使用的編碼PBl蛋白質的犬科動物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
[0085]SEQ ID NO: 50是SEQ ID NO: 49編碼的氨基酸序列。
[0086]SEQ ID N0:51是可以根據本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質的犬科動物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
[0087]SEQ ID NO: 52是SEQ ID NO: 51編碼的氨基酸序列。
[0088]SEQ ID NO: 53是可以根據本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質的犬科動物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
[0089]SEQ ID NO: 54是SEQ ID NO: 53編碼的氨基酸序列。
[0090]SEQ ID N0:55是可以根據本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質的犬科動物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
[0091]SEQ ID NO: 56是SEQ ID NO: 55編碼的氨基酸序列。
[0092]SEQ ID NO: 57是可以根據本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質的犬科動物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
[0093]SEQ ID NO: 58是SEQ ID NO: 57編碼的氨基酸序列。
[0094]SEQ ID NO: 59是可以根據本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質的犬科動物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
[0095]SEQ ID NO: 60是SEQ ID NO: 59編碼的氨基酸序列。
[0096]SEQ ID N0:61是可以根據本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質的犬科動物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
[0097]SEQ ID NO: 62是SEQ ID NO: 61編碼的氨基酸序列。
[0098]SEQ ID NO:63是可以根據本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質的犬科動物流感病毒(JacksonviIIe/2005)的核苷酸序列。
[0099]SEQ ID NO: 64是SEQ ID NO: 63編碼的氨基酸序列。
[0100]SEQ ID NO:65是可以根據本發(fā)明使用的編碼PBl蛋白質的犬科動物流感病毒(JacksonviIIe/2005)的核苷酸序列。
[0101]SEQ ID NO: 66是SEQ ID NO: 65編碼的氨基酸序列。
[0102]SEQ ID N0:67是可以根據本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質的犬科動物流感病毒(JacksonviIIe/2005)的核苷酸序列。
[0103]SEQ ID NO: 68是SEQ ID NO: 67編碼的氨基酸序列。
[0104]SEQ ID N0:69是可以根據本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質的犬科動物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
[0105]SEQ ID NO: 70是SEQ ID NO: 69編碼的氨基酸序列。
[0106]SEQ ID N0:71是可以根據本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質的犬科動物流感病毒(JacksonviIIe/2005)的核苷酸序列。
[0107]SEQ ID NO: 72是SEQ ID NO: 71編碼的氨基酸序列。
[0108]SEQ ID N0:73是可以根據本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質的犬科動物流感病毒(JacksonviIIe/2005)的核苷酸序列。
[0109]SEQ ID NO: 74是SEQ ID NO: 73編碼的氨基酸序列。
[0110]SEQ ID N0:75是可以根據本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質的犬科動物流感病毒(JacksonviIIe/2005)的核苷酸序列。
[0111]SEQ ID NO: 76是SEQ ID NO: 75編碼的氨基酸序列。
[0112]SEQ ID N0:77是可以根據本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質的犬科動物流感病毒(JacksonviIIe/2005)的核苷酸序列。
[0113]SEQ ID NO: 78是SEQ ID NO: 77編碼的氨基酸序列。
[0114]SEQ ID NO:79是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0115]SEQ ID NO:80是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0116]SEQ IDN0:81是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0117]SEQ ID NO:82是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0118]SEQ ID NO:83是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0119]SEQ ID NO: 84是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0120]SEQ ID NO:85是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0121]SEQ ID NO:86是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0122]SEQ ID NO:87是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0123]SEQ ID NO:88是可以根據本發(fā)明使用的寡核苷酸。
[0124]發(fā)明詳述
[0125]本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動物和引起呼吸系統(tǒng)疾病。在一個實施方案中，本發(fā)明的流感病毒包含編碼具有SEQ IDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76 或 78 任一個所示的氨基酸序列的蛋白質或者其功能和/或免疫原性片段或者變體的多核苷酸。在一個特定實施方案中，所述多核苷酸包含 SEQ IDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75 或 77 中任一個所示的核苷酸序列，或者其片段或者變體。本發(fā)明的流感病毒可以具有Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8和H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或 H16 的 HA 亞型或 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 或 N9 的 NA亞型。在特定實施方案中，本發(fā)明的流感病毒是亞型H3。根據本文描述的方法，可以從受感染的狗分離病毒并在細胞或者蛋中培養(yǎng)。在示例的實施方案中，流感病毒是甲型流感病毒。
[0126]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的流感病毒的一種或多種基因或者基因組區(qū)段的全部或者部分的多核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含流感血凝素(HA)基因、神經氨酸酶(NA)基因、核蛋白(NP)基因、基質蛋白(MA或者M)基因、聚合酶堿性(PB)蛋白基因、聚合酶酸性(PA)蛋白基因、非結構(NS)蛋白基因，或者這些基因任一種的功能片段或者變體。在特定實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含血凝素(HA)基因或者其功能片段或者變體。在另一實施方案中，HA基因編碼血凝素蛋白質，其與馬H3共有序列的氨基酸序列相比，具有如下一個或多個:83位的絲氨酸；222位的亮氨酸；328位的蘇氨酸；和/或483位的蘇氨酸。在一個實施方案中，HA基因編碼具有SEQIDN0:16、32、62或78中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或者變體。在一個特定實施方案中，HA基因包含SEQ IDN0:15、31、61或77中所示的核苷酸序列。
[0127]在一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸編碼具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、
16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或者變體。在特定實施方案中，編碼 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76 或 78 中所示的氨基酸序列的多核苷酸分別包含 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、
55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75 或77 中所示的核苷酸序列，或者編碼 SEQ IDN0:2、4、
6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或 78的任一項的功能和/或免疫原性片段或者變體的序列。從而，本發(fā)明涉及多核苷酸序列，其包含 SEQ IDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75 或 77 的任一項中所示的核苷酸序列，或者 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、
61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一項的片段或者變體，包括簡并變體。在一個特定實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以包含=SEQ ID NO:3的核苷酸1-2271 ；SEQ ID NO:5的核苷酸 1-2148 ；SEQ ID NO: 7 的核苷酸 1-657 ；SEQ ID N0:9 的核苷酸 1-1494 ；SEQ ID NO: 11 的核苷酸 1-1410 ；SEQ ID NO: 13 的核苷酸 1-756 ；SEQ ID NO: 15 的核苷酸 1-1695 ；SEQ ID NO: 19 的核苷酸 1-2271 ；SEQ ID NO: 21 的核苷酸 1-2148 ；SEQ ID NO: 23 的核苷酸 1-657 ；SEQ ID NO: 25 的核苷酸 1-1494 ；SEQ ID NO: 29 的核苷酸 1-756 ；SEQ ID NO: 31 的核苷酸 1-1695 ； SEQ ID NO:47的核苷酸 1-2277 ；SEQ ID NO:49 的核苷酸 1-2271 ；SEQ ID NO:51 的核苷酸 1-2148 ；SEQ IDNO:53 的核苷酸 1-690 ；SEQ ID NO:55 的核苷酸 1-1494 ；SEQ ID NO:57 的核苷酸 1-1410 ；SEQID NO:59 的核苷酸 1-756 ；SEQ ID NO:61 的核苷酸 1-1695 ；SEQ ID NO:63 的核苷酸 1-2277 ；SEQ ID NO:65 的核苷酸 1-2271 ；SEQ ID NO:67 的核苷酸 1-2148 ；SEQ ID NO:69 的核苷酸1-690 ；SEQ ID NO:71 的核苷酸 1-1494 ；SEQ ID NO:73 的核苷酸 1-1410 ；SEQ ID NO:75 的核苷酸1-756 ;和SEQ ID NO:77的核苷酸1-1695。在本發(fā)明的范圍內預期的病毒多核苷酸和多肽序列的核苷酸和氨基酸序列已經保存在GenBank，檢索號為DQ124147到DQ124161和DQ124190，將其公開引入本文作為參考。
[0128]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的流感病毒的多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及主題多肽的功能和/或免疫原性片段和變體。預期的多肽包括本發(fā)明的流感病毒的HA蛋白、NA蛋白、NS蛋白、核蛋白、聚合酶堿性蛋白、聚合酶酸性蛋白，和基質蛋白。在一個示例的實施方案中，本發(fā)明的多肽具有 SEQ IDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76 或 78 任一項所示的氨基酸序列，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。
[0129]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸序列的多核苷酸表達構建體。在一個實施方案中，本發(fā)明的表達構建體包含多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO: 2、4、6、
8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一項所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。在特定實施方案中，編碼SEQ IDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76 或 78 中所示的氨基酸序列的多核苷酸分別包含 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個中所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個的功能和/或免疫原性片段或變體的序列。從而，本發(fā)明涉及包含多核苷酸序列的表達構建體，所述多核苷酸序列包含SEQ IDN0:1、3、5、
7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73,75或77的任一個中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75 或 77 任一個的片段或者變體，包括簡并變體。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的表達構建體提供了本發(fā)明的有效連接的多核苷酸的過表達。
[0130]本發(fā)明的表達構建體一般包括在預計的宿主細胞中有功能的調節(jié)元件，在所述宿主細胞中將表達該表達構建體。從而，本領域技術人員可以選擇用于例如人類宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、昆蟲宿主細胞、酵母宿主細胞、細菌宿主細胞、和植物宿主細胞的調節(jié)元件。在一個實施方案中，調節(jié)元件是在犬科動物細胞中有功能的調節(jié)元件。調節(jié)元件包括啟動子、轉錄終止序列、翻譯終止序列、增強子、和多聚腺苷酸化元件。如本文所用的，術語“表達構建體”指核酸序列的組合，其提供了有效連接的核酸序列的轉錄。如本文所用的，術語“有效連接”指所述的元件的并列，其中所述元件處于允許它們以它們預期的方式發(fā)揮功能的關系中。通常，有效連接的元件為鄰接的關系。
[0131]本發(fā)明的表達構建體可以包含有效連接到編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列的啟動子序列。使用本領域中已知的標準技術，可以將啟動子摻入多核苷酸中。在本發(fā)明的表達構建體中可以使用啟動子的多個拷貝或者多個啟動子。在優(yōu)選實施方案中，啟動子與表達構建體中轉錄起始位點的距離可以與它與天然遺傳環(huán)境中轉錄起始位點的距離相同。在該距離中允許一定的變化而不實質性降低啟動子活性。在表達構建體中通常包括轉錄起始位點。優(yōu)選地，與本發(fā)明的表達構建體結合的啟動子提供了本發(fā)明的有效連接的多核苷酸的過表達。
[0132]與本發(fā)明的表達構建體用于真核細胞中的啟動子可以是病毒或者細菌來源的。病毒啟動子包括，但不限于，巨細胞病毒(CMV)基因啟動子、SV40早期或者晚期啟動子，或者勞斯肉瘤病毒(RSV)基因啟動子。細胞來源的啟動子包括，但不限于，結蛋白基因啟動子和肌動蛋白基因啟動子。適于與本發(fā)明的表達構建體用于酵母細胞的啟動子包括，但不限于，3-磷酸甘油酸酯激酶啟動子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、金屬硫蛋白啟動子、醇脫氫酶一 2啟動子，和己糖激酶啟動子。
[0133]如果在植物細胞中提供或者向植物細胞中導入表達構建體，那么可以使用植物病毒啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S (包括增強的CaMV35S啟動子(見，例如，美國專利號5，106, 739和An, 1997))或者CaMV 19S啟動子?？梢杂糜谥参镏斜磉_構建體的其他啟動子包括，例如，prolifera啟動子、Ap3啟動子、熱休克啟動子、根癌農桿菌(A.tumefaciens)的T-DNA1’ -或2’ -啟動子、多聚半乳糖醛酸酶啟動子、來自牽?；ǖ牟槎厦窤(CHS-A)啟動子、煙草PR-1a啟動子、泛蛋白啟動子、肌動蛋白啟動子、alcA基因啟動子、pin2啟動子(Xu et al.，1993)、玉米WipI啟動子、玉米trpA基因啟動子(美國專利號5，625，136)、玉米⑶PK基因啟動子、和RUBISCO SSU啟動子(美國專利號5，034，322)。根特異的啟動子，如美國專利號6，455，760或美國專利號6，696，623或公布的美國專利申請?zhí)?0040078841;20040067506; 20040019934; 20030177536; 20030084486;或 20040123349 中描述的任一種啟動子序列可以用于本發(fā)明的表達構建體。組成性啟動子(如CaMV、泛蛋白、肌動蛋白或者NOS啟動子)、發(fā)育調節(jié)的啟動子和誘導型啟動子(如可以通過熱、光、激素或者化學品誘導的那些啟動子)也預期用于本發(fā)明的多核苷酸表達構建體。也可以使用組織特異性啟動子，例如，果實特異性啟動子，如番茄的E8啟動子(檢索號:AF515784;Good et al.(1994))。也可以使用種子特異性啟動子，如來自β_菜豆蛋白基因(例如，菜豆的)或者大豆球蛋白基因(例如，大豆的)的啟動子，和其他啟動子。
[0134]對于在原核系統(tǒng)中表達,本發(fā)明的表達構建體可以包含啟動子，如堿性磷酸酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子、λ Plj啟動子、β 一內酰胺酶啟動子、乳糖啟動子、phoA啟動子、T3啟動子、T7啟動子、或者tac啟動子(de Boer et al.，1983)。
[0135]本發(fā)明的表達構建體可以任選含有轉錄終止序列、翻譯終止序列、編碼信號肽的序列，和/或增強子元件。轉錄終止區(qū)可以通常從真核生物或者病毒基因序列的3’非翻譯區(qū)得到。轉錄終止序列可以位于編碼區(qū)的下游以提供有效終止。信號肽序列是通常存在于蛋白質的氨基末端的短氨基酸序列，其負責有效連接的成熟多肽重定位到多種不同的翻譯后細胞目的地，從特定細胞器隔室到蛋白質作用部位和細胞外環(huán)境。通過使用有效連接的信號肽序列將基因產物靶向預期的細胞和/或細胞外目的地預期用于本發(fā)明的多肽。典型的增強子是順式作用元件，其增加基因轉錄并且可以包括在表達構建體中。典型的增強子元件是本領域中已知的，并且包括，但不限于，CaMV35S增強子元件、巨細胞病毒(CMV)早期啟動子增強子元件，和SV40增強子元件。增強基因表達的內含子介導的增強子元件也是本領域中已知的。這些元件必須存在于轉錄區(qū)內并且是方向依賴性的。
[0136]指導從表達構建體轉錄的mRNA的多聚腺苷酸化的DNA序列也可以包括在表達構建體中，并且包括，但不限于，章魚堿合酶或者胭脂氨酸合酶信號。
[0137]表達構建體還可以包括一種或多種顯性選擇標記基因，包括，例如，編碼抗生素抗性和/或除草劑抗性用于選擇轉化細胞的基因?？股乜剐曰蚩梢蕴峁σ环N或多種下面的抗生素的抗性:潮霉素、卡那霉素、博來霉素、G418、鏈霉素、巴龍霉素、新霉素和大觀霉素。通過新霉素磷酸轉移酶(NPT II)可以提供卡那霉素抗性。除草劑抗性基因可以提供對膦絲菌素乙酰轉移酶或者草甘膦的抗性。用于細胞轉化篩選的其他標記包括，但不限于，編碼β —葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、β 一半乳糖苷酶、螢光素酶、胭脂氨酸合成酶、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)或者增強的GFP的基因(Yang et al.，1996)。
[0138]本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明的多核苷酸序列的多核苷酸載體。可以在本發(fā)明的表達構建體或者多核苷酸的5’和3’末端包括獨特的限制酶位點以允許插入到多核苷酸載體中。如本文所用的，術語“載體”指任一遺傳元件，包括例如，質粒、粘粒、染色體、噬菌體、病毒等等，其當與適當的控制元件結合時能夠復制并且可以在細胞之間轉移多核苷酸序列。載體含有允許載體在所選的宿主細胞中復制的核苷酸序列。許多載體可以用于表達和/或克隆，并且包括，但不限于，pBR322、pUC系列、Ml3系列、pGEM系列、和pBLUESCRIPT 載體(Stratagene, La Jolla, CA and Promega, Madison, WI)。
[0139]本發(fā)明還涉及寡核苷酸探針和引物，如聚合酶鏈式反應(PCR)引物，其可以與本發(fā)明多核苷酸的編碼或非編碼序列雜交。本發(fā)明的寡核苷酸探針可以用于檢測流感病毒核酸序列的方法中。本發(fā)明的寡核苷酸引物可以用于PCR方法和涉及核酸擴增的其他方法中。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的探針或引物可以與本發(fā)明的多核苷酸在嚴格條件下雜交。本發(fā)明的探針和引物可以任選包含檢測標記或者報道分子，如熒光分子、酶、放射性部分，等等。本發(fā)明的探針和引物對于使用它們的方法或測定法可以是任何合適的長度。通常，本發(fā)明的探針和引物將長為10到500個或者更多核苷酸。在本發(fā)明的范圍內預期長為10 到 20,21 到 30,31 到 40,41 到 50,51 到 60,61 到 70,71 到 80,81 到 90,91 到 100 或 101個或更多核苷酸的探針和引物。在一個實施方案中，探針和引物長為9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸的任一個。本發(fā)明的探針和引物可以與所述多核苷酸序列具有完全(100%)的核苷酸序列同一性，或者序列同一性可以小于100%。例如，探針或引物和序列之間的序列同一性可以為99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%或者任一其他百分數序列同一性，只要該探針或引物可以在嚴格條件下與本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸序列雜交。本發(fā)明的示例的探針和引物包括具有SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46 的任一個中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID NO: 35-46的任一個的功能片段或者變體的那些探針和引物。
[0140]如本文所用的 ，術語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指單鏈或者雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者混合的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，將包括天然核苷酸的已知的類似物，其可以以類似于天然存在的核苷酸的方式發(fā)揮功能。多核苷酸序列包括可以轉錄成RNA的DNA鏈序列和可以翻譯成蛋白質的RNA鏈。本發(fā)明的任一核酸、多核苷酸或者寡核苷酸的互補序列也預期在本發(fā)明的范圍內。多核苷酸序列還包括全長序列以及衍生自全長序列的較短的序列。本發(fā)明還包括序列與本文公開的多核苷酸互補的那些多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以以純化或者分離的形式提供。
[0141]因為遺傳密碼的簡并性，多種不同的多核苷酸序列可以編碼本發(fā)明的多肽。在Lewin (1985)中描述了顯示所有可能的三聯(lián)體密碼子(并且其中U也代表T)和每個密碼子編碼的氨基酸的表格。此外，本領域技術人員完全能夠產生編碼與本發(fā)明的多肽相同或者基本相同的多肽的備選的多核苷酸序列。這些簡并變體和備選多核苷酸序列在本發(fā)明的范圍內。如本文使用的，對“基本上相同”的序列的引用指編碼氨基酸替代、缺失、添加或者插入的序列，其不實質上改變本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的功能和/或免疫原性活性。
[0142]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明的多核苷酸的變體。變體序列包括那些序列，其中該序列的一個或多個核苷酸已經被替代、缺失和/或插入。可以替代DNA的天然核苷酸的核苷酸具有堿基部分，其可以包括，但不限于，次黃苷、5-氟尿嘧啶、5 —溴尿嘧啶、次黃嘌呤、I 一甲基鳥嘌呤、5—甲基胞嘧啶，和三苯甲基化堿基。序列中核苷酸的糖部分還可以是經修飾的并且包括，但不限于，阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，可以用乙?；⒓谆?或硫代基團修飾核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶堿基。使用本領域中已知的標準技術可以制備和測試含有核苷酸替代、缺失、和/或插入的序列。
[0143]本發(fā)明的范圍內還預期與本發(fā)明的多肽中那些特別示例或者天然存在的氨基酸不同的氨基酸替代。例如，非天然氨基酸可以替代多肽的氨基酸，只要具有替代氨基酸的多肽基本上保留與沒有替代的氨基酸的多肽相同的功能活性。非天然氨基酸的實例包括，但不限于，鳥氨酸、瓜氨酸、羥脯氨酸、高絲氨酸、苯基甘氨酸、?；撬?、碘代酪氨酸、2，4- 二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4 一氨基丁酸、2-氨基丁酸、Y-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6—氨基己酸、2 —氨基異丁酸、3 —氨基丙酸、正亮氨酸、正纈氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、τ - 丁基甘氨酸、τ - 丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β 一丙氨酸、氟一氨基酸、設計者氨基酸，如β 一甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、和一般的氨基酸類似物。非天然氨基酸還包括具有衍生的側基的氨基酸。此外，蛋白質中的任一氨基酸可以為D(右旋)型或者L(左旋)型。本發(fā)明的范圍內還包括本發(fā)明多肽的蛋白質序列的等位基因變體。
[0144]氨基酸可以一般以下面的類別分類:非極性的、不帶電的極性的、堿性的和酸性的。保守替代(其中具有一個類別氨基酸的本發(fā)明的多肽用相同類別的另一氨基酸替代)落入本發(fā)明的范圍內，只要具有替代的多肽仍然保留與不具有該替代的多肽基本上相同的功能活性。編碼序列中具有一個或多個氨基酸替代的多肽的多核苷酸包括在本發(fā)明的范圍內。下面的表11提供了屬于每個類別的氨基酸的實例列表。在表12中定義了單字母氨基酸縮寫。
[0145]使用本領域中已知的標準方法可以產生本發(fā)明的流感病毒多肽的片段和變體并且使用本領域中已知的標準技術測試功能或者免疫原性的存在。例如，為了測試本發(fā)明的神經氨酸酶多肽的 片段和/或變體，可以測定酶促活性。從而，普通技術人員可以容易制備和測試本發(fā)明多肽的片段和變體，并確定該片段或變體是否相對于全長或者非變異多肽保持活性。
[0146]本發(fā)明范圍內預期的多核苷酸和多肽也可以按照與本文特別示例的本發(fā)明的那些序列的更具體的同一性和/或相似性范圍定義。序列同一性將通常大于60%，優(yōu)選大于75 %，更優(yōu)選大于80 %，甚至更優(yōu)選大于90 %，并且可以大于95 %。與本文示例的序列相比，序列的同一性和/或相似性可以為49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。除非另外指出，如本文使用的，兩個序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用Karlin和Altschul (1990)的，如在Karlin和Altschul (1993)中改進的算法確定。這種算法整合到Altschul et al.(1990)的NBLAST和XBLAST程序中?？梢杂肗BLAST程序，得分=100，字長=12進行BLAST搜索，以得到具有所希望的百分比序列同一性的序列。為了得到用于比較目的的缺口比對，可以使用如Altschulet al.(1997)的Gapped BLAST。當利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默認參數。見NCBI/NIH網站。
[0147]本發(fā)明還預期這樣的多核苷酸分子，其具有與本文示例的多核苷酸序列足夠同源的序列，從而允許與該序列在標準的嚴格條件和標準方法(Maniatis et al.，1982)下雜交。如本文使用的，雜交的“嚴格”條件指這樣的條件，其中通常在6x SSPE, 5x Denhardt溶液，0.1%SDS, 0.lmg/ml變性DNA中低于DNA雜交分子的解鏈溫度(Tm) 20-25°C下過夜進行。通過下面的公式描述解鏈溫度Tm(Beltz et al.，1983):
[0148]Tm=81.5C+16.6Log[Na+] +0.41 (%G+C) -0.61 (% 甲酰胺)-600/雙鏈體長度(以堿基對計)。
[0149]通常如下進行洗滌:
[0150](I)在Ix SSPE, 0.1%SDS中室溫下洗滌兩次，每次15分鐘(低嚴格洗滌)。
[0151](2)在0.2x SSPE, 0.1%SDS中Tm_20°C下洗滌一次15分鐘(中等嚴格洗滌)。
[0152]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的流感病毒的基因編碼的病毒蛋白質和肽。在一個實施方案中，病毒蛋白是成熟HA蛋白。在特定實施方案中，成熟的HA蛋白包含下面的一個或多個:82位的絲氨酸；221位的亮氨酸；327位的蘇氨酸；和/或482位的蘇氨酸。在示例的實施方案中，成熟的HA蛋白質具有SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 34中所示的氨基酸序列，或者SEQID NO:33或SEQ ID NO:34的功能和/或免疫原性片段或變體。在另一實施方案中，病毒蛋白是NA蛋白、NS蛋白、PB蛋白、PA蛋白、或者MA蛋白。本發(fā)明的病毒蛋白質和妝可以用于產生特異結合所述蛋白質或肽的抗體。本發(fā)明的病毒蛋白質和肽還可以用作疫苗組合物中的免疫原。
[0153]本發(fā)明還涉及用于誘導針對流感病毒的免疫應答的組合物和方法，所述流感病毒能夠感染易感的宿主動物和引起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明可以用于在易感的宿主動物中誘導針對任一亞型的流感病毒的免疫應答。例如，流感病毒可以是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或 H16 的 HA 亞型，和 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 或N9的NA亞型。在一個實施方案中，HA亞型是H3或者H5。在另一實施方案中，NA亞型是N7或者N8。在特定實施方案中，誘導針對亞型H3N8的流感病毒的免疫應答。在一個實施方案中，宿主動物是犬科動物。犬科動物包括野生的、動物園的和馴養(yǎng)的犬科動物，如狼、郊狼和狐貍。犬科動物還包括狗，尤其馴養(yǎng)的狗，如純種和/或雜種陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、獵狗、守衛(wèi)狗、警犬、賽犬和/或實驗用狗。在特定實施方案中，宿主動物是馴養(yǎng)的
狗，如靈.提β在一個實施方案中，對動物施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物，其足以誘
導針對本發(fā)明的流感病毒的免疫應答。免疫應答可以是體液和/或細胞免疫應答。在特定實施方案中，免疫應答是保護性免疫應答，其能夠在免疫后在一定的時間段內預防或者減小受免疫的宿主動物中的病毒感染。從而，本發(fā)明還涉及疫苗組合物和方法，其為接種的動物提供了針對本發(fā)明病毒的保護性免疫應答。
[0154]如本文所用的，本發(fā)明的疫苗或者免疫原性組合物可以包含無細胞的完整病毒，包括減毒的或者失活的病毒，或者病毒的部分，包括亞病毒顆粒(包括“分尚疫苗”，其中處理病毒體以除去一些或者全部病毒脂類)、病毒蛋白質(包括個體蛋白質和多種蛋白質的大分子復合體)、多肽、和肽，以及病毒感染的細胞系，或者這些任一種的組合。包含病毒感染的細胞系的疫苗或者免疫原性組合物可以包含多種細胞系，每種用不同的病毒毒株感染。
[0155]在本發(fā)明的一個實施方案中，可以用用一種或多種滅活的(例如，殺死的)和/或活的減毒流感病毒疫苗或者包含來自一種或多種病毒隔離群的一種或多種流感病毒抗原的疫苗免疫犬科動物。在一個實施方案中，流感病毒是馬流感病毒。在另一實施方案中，流感病毒是馬流感病毒，其編碼或表達與犬科動物流感病毒多肽具有至少約90 %，或者至少約95%，或至少約96%、或97%、或98%、或99%或更高氨基酸序列同一性的多肽。在一個實施方案中，用于本發(fā)明疫苗中的流感抗原與犬科動物流感病毒的HA抗原和/或NA抗原具有至少約96%序列同一‘丨生。
[0156]滅活疫苗的一個實例是EQUICINE II?,其已經由Intervet Inc.(MiIlsboro,DE, USA)作為液體疫苗上市。EQUICINE II? 含有滅活的 A/Pennsylvania/63流感病毒(〃A/Pa/63〃)和 A/equine/Kentucky/93 流感病毒("A/KY/93")與卡波姆(carbopol)(即 HAYLOdVH) (Intervet Inc.))。更具體地，一劑 EQUICINE II? 含有:106_qEID5q滅活的A/Pa/63、106_7EID5tl滅活的A/KY/93、0.25%體積的卡波姆，和足夠產生總體積Iml的PBS。
[0157]滅活疫苗的另一實例是馬流感病毒A/equine/Oh1/03 (〃0h1 03〃)。在一些實施方案中，這種疫苗含有CARBIGEN?，其是可以通過商業(yè)途徑從MVP Laboratories, Inc.(Ralston，NE)得到的乳化的基于聚合物的佐劑。在這種疫苗中，劑量單位通常包含至少約250HA單位病毒、約250到約12，500HA單位病毒，或約1000到約6200HA單位病毒。CARBIGEN?的推薦濃度為約5到約30%(按質量計)。
[0158]活的減毒疫苗的一個實例是凍干疫苗形式的改性的活的equine/Kentucky/91 ("A/KY/91")流感，其可以用水重構。在一些實施方案中，用足夠將疫苗劑量達到Iml總體積的疫苗級水進行重構。此類疫苗的方面在例如美國專利號6，436，408;6，398，774;和6，177，082中討論，將它們完整引入本專利作為參考。當重構時，這種疫苗的一 個劑量可以例如含有每毫升17 2TCID5tl的A/KY/91、每毫升0.015克N-Z AMINE AS?、每毫升0.0025克明膠，和每毫升0.04克D乳糖。N-Z AMINE AS?是通過酪蛋白的酶促水解產生的氨基酸和肽的精制來源。N-Z AMINE AS?由KerryB1-Science (Norwich, NY, USA)上市。
[0159]在優(yōu)選實施方案中，疫苗包含在HA編碼序列中與Florida/43/2004具有至少約93 %同源性的H3流感抗原，例如equine/New Market/79毒株。優(yōu)選的同源性為至少約 96 %,例如，equine/Alaska/1/91 和 equine/Santiago/85 毒株。在下面的實施例中，將 equine/Kentucky/91、 equine_2/Kentucky/93、 equine-l/Pennsylvania/63 和 equine0h1/03流感抗原摻入疫苗中。優(yōu)選的疫苗還包括包含equine/Wisconsin/03、equine/Kentucky/02、equine/Kentucky/93 和 equine/New Market2/93 的疫苗。在下面的實施例中，使用H3N8病毒。然而，認為根據本發(fā)明也可以使用其他H3流感病毒。
[0160]可以通過常規(guī)手段制備活的減毒疫苗。此類手段一般包括例如，通過體外傳代改變致病毒株、冷適應、通過遺傳操作改變生物的致病性、制備嵌合體、在病毒載體中插入抗原、選擇無毒性野生型毒株，等等。
[0161]在一些實施方案中，通過細胞培養(yǎng)、實驗室動物、非宿主動物或者卵進行野生型病毒的連續(xù)傳代得到活的減毒病毒毒株。在此類傳代中基因突變的積累通常導致生物對最初宿主的毒性的不斷喪失。
[0162]在一些實施方案中，通過用減毒的突變病毒和致病病毒共同感染允許細胞制備活的減毒病毒毒株。期望的所得重組病毒具有減毒病毒的安全性和編碼來自致病病毒的保護性抗原的基因。[0163]在一些實施方案中，通過冷適應制備活的減毒病毒毒株。冷適應的病毒具有僅在上呼吸道中發(fā)現的溫度下復制的優(yōu)點。產生冷適應馬流感病毒的方法已經在美國專利號6，177,082中描述。期望的所得冷適應病毒賦予一種或多種下面的表型:冷適應、溫度敏感性、顯性干涉，和/或減毒。
[0164]在一些實施方案中，通過分子手段制備活的減毒病毒毒株，如點突變、缺失、或插入以將致病病毒轉化為與最初病毒相比不致病或者致病性降低的病毒，而保留最初病毒的保護性質。
[0165]在一些實施方案中，通過將保護性抗原的候選基因克隆到非致病性或致病性降低的病毒或其他生物的基因組中制備活的減毒病毒。
[0166]使用常規(guī)方法失活病毒可以制備失活的(如，“殺死的”)病毒疫苗。通常，此類病毒包括可以增強免疫應答的賦形劑，以及疫苗中常規(guī)使用的其他賦形劑。例如，在下面的實施例中，equicine II?包含HAVLOGEN--通過用滅活化學品(例如，福爾馬林、β丙內酯(〃BPL〃)、溴乙胺(〃BEA〃)、和二元氮丙啶(〃BEI〃))處理病毒或者通過非化學方法(例如，熱、凍/融或聲處理)使得病毒不能復制來完成病毒的滅活。
[0167]在下面的實施例中，用equine/0h1/03用作攻擊病毒。已知其與Florida/43/04隔離群具有約99%同源性，并且表明在狗中誘導感染癥狀和血清轉變。實施例18闡明了馬流感疫苗在狗中的功效，顯示了在用包含CARBIGEN?佐劑的疫苗組合物中滅活的Oh1 03抗原接種的狗中血凝抑制(或〃HI〃或〃ΗΑ )效價。表29顯示了接種前、接種后和二次接種后，以及攻擊后的效價。結果顯示了接種的狗的接種后每個階段的HI效價，對于對照有很小的或者沒有增加。表30闡明了來自相同研究的臨床病征、病毒分離和組織病理學結果。盡管被攻擊的動物不顯示出臨床病征、病毒脫落，或者陽性組織病理學，但是陽性HI效價(表29)表明在經免疫 的動物中顯著的抗體效價。
[0168]應該指出本發(fā)明也包括其他H3流感病毒抗原疫苗。提供本說明書中描述的實施例和下面的實施例來闡明本發(fā)明的和它的優(yōu)選實施方案，并且它們不限制要求保護的發(fā)明的范圍。
[0169]還應該指出根據本發(fā)明可以使用不同于H3流感病毒抗原的流感抗原。此類抗原包括例如，來自equine/PA/63的那些抗原，其是馬Al亞型(H7N7)。預期一種或多種此類此類抗原可以與或不與一種或多種H3流感抗原使用。
[0170]通常，以治療有效量施用疫苗?！爸委熡行Я俊笔亲銐蛟谌苿游锘颊咧姓T導針對靶抗原的保護應答的量。通常，如果劑量防止流感或其一種或多種(通常兩種或多種)癥狀、延遲其發(fā)作、減少其擴散、使其減輕、抑制或消除，那么所述劑量是“治療有效的”。典型的流感癥狀包括例如，發(fā)熱(對于狗，通?！?03.0° F;≥39.4°C)、咳嗽、打噴嚏、組織病理學病變、眼分泌物、鼻分泌物、嘔吐、腹瀉、抑郁、體重減輕、作嘔、咯血、和/或聽得見的啰音。其他通常更嚴重的癥狀可以包括例如，肺、縱隔、或胸膜腔中出血；氣管炎；支氣管炎；毛細支氣管炎；支持性支氣管肺炎；和/或肺的上皮層和氣管腔中嗜中性粒細胞和/或巨噬細胞滲入。
[0171]疫苗可以作為組合療法的部分施用，組合療法即包括疫苗自身外，還包括施用一種或多種額外的活性劑、佐劑、療法等等的療法。在該情況中，應該認識到如果將僅僅施用疫苗，那么構成“治療有效”量的疫苗的量可以小于將構成“治療有效”量的疫苗的量。其他療法可以包括本領域中已知的那些，如抗病毒藥療法、鎮(zhèn)痛劑、退熱藥療法、祛痰藥、抗炎藥物、抗組胺藥、治療流感病毒感染引起的細菌感染的抗生素、休息，和/或施用液體。在一些實施方案中，本發(fā)明的疫苗與博德特氏菌疫苗、腺病毒疫苗和/或副流感病毒疫苗組合施用。
[0172]在一些實施方案中，例如，活的減毒疫苗的典型劑量為至少約13Pfu/犬科動物，更典型地約13到約19Pfu/犬科動物。在本專利中，“pfu”指“噬斑形成單位”。在一些實施方案中，活的減毒疫苗的典型劑量為至少約13TCID5tl/犬科動物，更典型地約13到約19TCID5tl/犬科動物。在一些實施方案中，活的減毒疫苗的典型劑量為至少約13EID5tl/犬科動物，更典型的約13到約19EID5tl/犬科動物。在一些實施方案中，被殺死的疫苗的典型劑量為至少約40HA單位，通常約40到約10，000ΗΑ單位，更通常為約500到約6200HA單位。在一些實施方案中，劑量為約6100到約6200HA單位。
[0173]在一些優(yōu)選實施方案中，疫苗包含活的減毒疫苗，其濃度比免疫原性水平高至少約1tl 5Pfu/犬科動物。在一些優(yōu)選實施方案中，疫苗包含活的減毒疫苗，其濃度比免疫原性水平高至少約1ci 5TCID5tl/犬科動物。在一些優(yōu)選實施方案中，疫苗包含活的減毒疫苗，其濃度比免疫原性水平高至少約10°_ TlD5tl/犬科動物。
[0174]通過本領域公知的攻擊劑量滴定研究技術可以通過實驗確定免疫原性水平。此類技術通常包括用不同劑量的疫苗接種許多犬科動物，然后用毒性病毒攻擊所述犬科動物以確定最小保護劑量。
[0175]影響優(yōu)選劑量方案的因素可以包括例如，受試者的類型(例如，物種和品種)、年齡、體重、性別、飲食、活動、肺大小和狀況；施用途徑；使用的具體疫苗的功效、安全性，和免疫力持續(xù)時間分布；是否使用遞送系統(tǒng)；和疫苗是否作為藥物和/或疫苗組合的部分施用。從而，使用的實際劑量可以對于特定動物不同，并且因此，可以偏離上面給出的典型劑量。使用常規(guī)手段，確定此類劑量調整在本領域技術人員能力之內。還應該指出活的減毒病毒通常能夠自身增殖；從而，施用的此類病毒的特定量不一定是關鍵的。
[0176]設想疫苗可以一次施用于犬科動物患者；或者備選地，在幾天、幾周、幾個月或幾年內兩次或多次施用。在一些實施方案中，施用疫苗至少兩次。在一些此類實施方案中，例如，施用疫苗兩次，第二次劑量(例如，加強劑量)在第一次劑量后至少約2周施用。在一些實施方案中，施用疫苗兩次，第二次劑量在第一次劑量后不大于約2周施用。在一些實施方案中，第二次劑量在第一次劑量后約2周到約4年施用、第一次劑量后約2到約8周、或第一次劑量后約3到約4周施用。在一些實施方案中，第二次劑量在第一次劑量后約4周施用。在上面的實施方案中，第一次和隨后的劑量例如可以改變量和/或形式。然而，通常，劑量是相同的量和形式。當僅僅施用一次劑量時，該單次劑量中疫苗的量通常包含治療有效量的疫苗。然而，當施用一次以上的劑量時，那些劑量中疫苗的量可以一起構成治療有效量。
[0177]在一些實施方案中，在流感感染犬科動物受者之前施用疫苗。在此類實施方案中，例如，可以施用疫苗以預防、降低危險或延遲流感發(fā)作或其一種或多種(通常兩種或多種)流感癥狀。
[0178]在一些實施方案中，在流感感染犬科動物受者后施用疫苗。在此類實施方案中，例如，疫苗可以減輕、抑制或消除流感或一種或多種(通常兩種或多種)流感癥狀。[0179]疫苗的優(yōu)選組成取決于例如，疫苗是否是滅活的疫苗、活的減毒疫苗還是兩者。它還取決于施用疫苗的方法。設想疫苗將包含一種或多種常規(guī)的可藥用載體、佐劑、其他免疫應答增強劑、和/或載體(總稱為“賦形劑”)。通常選擇此類賦形劑以與疫苗中的活性成分相容。賦形劑的用途是本領域技術人員公知的。
[0180]術語“可藥用的”以形容詞用于指修飾的名詞適于用于藥品中。當它用于例如描述藥物疫苗中的賦形劑時，它表征該賦形劑與組合物中的其他成分是相容的并且不會不利地損害預期的受者犬科動物。
[0181]可以通過常規(guī)方法施用疫苗，所述方法包括例如，粘膜途徑(如鼻內、經口、氣管內和眼)，和腸胃外施用。粘膜施用對于活的減毒疫苗是尤其有利的。腸胃外施用對于滅活疫苗尤其有利。
[0182]粘膜疫苗可以是例如液體劑型，如可藥用的乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。適于此類疫苗的賦形劑包括例如，常用于本領域中的惰性稀釋劑，如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、淀粉粉末、鏈烷酸的纖維素酯、纖維素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉和鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮，和/或聚乙烯醇。賦形劑還可以包含多種濕潤齊?、乳化齊?、懸浮劑、調味劑(例如，增甜)和/或芳香劑。
[0183]經口粘膜疫苗可以例如被壓片或包膠以方便施用。此類膠囊劑或片劑可以含有控釋制劑。對于膠囊劑、片劑和丸劑的情況，劑型還可以含有緩沖劑，如檸檬酸鈉，或碳酸鎂或鈣或碳酸氫鎂或鈣。還可以用腸包衣制備片劑和丸劑。
[0184]設想可以通過犬科動物患者的飲用水和/或食物施用疫苗。還設想可以以膳食(treat)或玩具的形式施用疫苗。
[0185]“腸胃外施用”包括皮下注射、粘膜下層注射、靜脈內注射、肌內注射、胸骨內注射、經皮注射、和灌注?？勺⑸涞闹苿?例如，無菌可注射的水性或油性混懸劑)可以根據本領域已知的用合適的賦形劑配制，所述賦形劑為如載體、溶劑、分散劑、濕潤劑、乳化劑和/或懸浮劑。這些通常包括例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、1，3-丁二醇、林格液、等滲氯化鈉溶液、溫和的不揮發(fā)油(例如，合成的甘油一酯或二酯)、脂肪酸(例如，油酸)、二甲基乙酰胺、表面活性劑(例如，離子和非離子去污劑)、丙二醇，和/或聚乙二醇。賦形劑還可以包括少量的其他輔助物質，如pH緩沖劑。
[0186]疫苗可以包括增強犬科動物患者免疫應答(其可以包括抗體應答、細胞應答或兩者)，從而增強疫苗有效性的一種或多種賦形劑。此類賦形劑(或“佐劑”)的使用在使用滅活疫苗時可以尤其有益。佐劑可以是對犬科動物患者免疫系統(tǒng)的細胞具有直接影響的物質(例如，細胞因子或卡介苗(“BCG”))或間接影響的物質(脂質體)。通常合適的佐劑的實例包括油(例如，礦物油)、金屬鹽(例如，氫氧化鋁或磷酸鋁)、細菌組分(例如，細菌脂多糖、弗氏佐劑，和/或MDP)、植物組分(例如，Quil A)，和/或一種或多種具有載體作用的物質(例如，皂土、乳膠顆粒、脂質體，和/或Quil A、ISC0M)。如上面提到的，佐劑還包括例如CARBIGEN?和卡波姆。應該認識到本發(fā)明包括包含佐劑的疫苗以及不包含任何佐劑的疫苗。
[0187]設想為了保存可以將疫苗凍干(或者減少液體體積)，然后在施用之前或施用時用液體重構。此類重構可以用如疫苗級水實現。
[0188]本發(fā)明還包括適于用于進行上述方法的藥盒。藥盒包含含有上述疫苗的劑型。藥盒還包含至少一種額外的組分，和通常，關于使用該疫苗和額外組分的說明書。所述額外組分可以是例如，一種或多種額外成份(如一種或多種上面討論的賦形劑、食品，和/或膳食(treat))，其可以在施用前或施用期間與疫苗混合。額外組分可以備選(或額外)包含用于對犬科動物患者施用疫苗的一種或多種裝置。此類裝置可以是例如，注射器、吸入器霧化器、吸管、鑷子，或任何醫(yī)學上可接受的遞送載體。在一些實施方案中，所述裝置適于皮下施用疫苗。在一些實施方案中，所述裝置適于鼻內施用疫苗。
[0189]也可以使用藥學或生物領域中已知的其他賦形劑和施用方式。
[0190]本發(fā)明的疫苗或者免疫原性組合物還包含重組的基于病毒載體的構建體，其可以包含例如編碼本發(fā)明的流感病毒的HA蛋白、NA蛋白、核蛋白、聚合酶堿性蛋白、聚合酶酸性蛋白，和/或基質蛋白的基因。可以用于制備重組載體/病毒構建體的任何合適的病毒載體預期用于本發(fā)明。例如，來自腺病毒、禽痘、皰疹病毒、牛痘、金絲雀痘、昆蟲痘、豬痘、西尼羅病毒和本領域已知的其他病毒的病毒載體可以用于本發(fā)明的組合物和方法中。可以使用本領域中已知的標準遺傳工程技術構建編碼和表達組分的重組多核苷酸載體。此外，本文描述的多種疫苗組合物可以單獨使用和相互組合使用。例如，動物的初次免疫可以使用重組的基于載體的構建體，其具有單個或者多個毒株組分，然后用包含失活病毒或者失活的病毒感染的細胞系的疫苗組合物二次加強。使用本發(fā)明的疫苗組合物的其他免疫方案是本領域技術人員顯而易見的并且預計在本發(fā)明的范圍內。 [0191]本發(fā)明還涉及重排列病毒，其包含本發(fā)明的流感病毒的至少一種基因或者基因組區(qū)段和來自本發(fā)明的不同的流感病毒或者來自不同于本發(fā)明病毒的流感病毒的病毒基因或者基因組區(qū)段的剩余部分。通過本發(fā)明的供體流感病毒的核酸與受體流感病毒的核酸的遺傳重排列，然后選擇包含供體病毒的核酸的重排列病毒，可以產生重排列病毒。產生和分離重排列病毒的方法是本領域中公知的(Fields et al.，1996)。在一個實施方案中，本發(fā)明的重排列病毒包含人類、鳥類、豬或者馬流感病毒的基因或者基因組區(qū)段。本發(fā)明的重排列病毒可以包括來自供體和受體流感病毒的核酸的任一組合，只要重排列病毒包含來自本發(fā)明的供體流感病毒的至少一個基因或者基因組區(qū)段。在一個實施方案中，受體流感病毒可以是馬流感病毒。
[0192]病毒蛋白質的天然的、重組的或者合成的多肽，和其肽片段也可以用作根據本發(fā)明方法的疫苗組合物。在一個實施方案中，疫苗組合物包含犬科動物流感病毒的多核苷酸或多肽。在一個實施方案中，疫苗組合物包含編碼具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76 或78任一個中所示氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或變體的多核苷酸。在特定實施方案中，編碼 SEQ IDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76 或 78 中所示氨基酸序列的多核苷酸分別包含 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75 或 77 中所示核苷酸序列，或者編碼 SEQ ID N0:2、4、6、
8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個的功能和/或免疫原性片段或變體的序列。在另一特定實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以包含:SEQ ID NO: 3的核苷酸1-2271 ；SEQ ID NO: 5的核苷酸1-2148 ；SEQ ID NO: 7 的核苷酸 1-657 ；SEQ ID NO:9 的核苷酸 1-1494 ；SEQ ID NO: 11 的核苷酸1-1410 ；SEQ ID NO: 13 的核苷酸 1-756 ；SEQ ID NO: 15 的核苷酸 1-1695 ；SEQ ID NO: 19 的核苷酸 1-2271 ；SEQ ID NO:21 的核苷酸 1-2148 ；SEQ ID NO:23 的核苷酸 1-657 ；SEQ ID NO:25 的核苷酸 1-1494 ；SEQ ID NO: 29 的核苷酸 1-756 ；SEQ ID NO: 31 的核苷酸 1-1695 ；SEQ ID NO:47的核苷酸 1-2277 ；SEQ ID NO:49 的核苷酸 1-2271 ；SEQ ID NO:51 的核苷酸 1-2148 ；SEQ IDNO:53 的核苷酸 1-690 ；SEQ ID NO:55 的核苷酸 1-1494 ；SEQ ID NO:57 的核苷酸 1-1410 ；SEQID NO:59 的核苷酸 1-756 ；SEQ ID NO:61 的核苷酸 1-1695 ；SEQ ID NO:63 的核苷酸 1-2277 ；SEQ ID NO:65 的核苷酸 1-2271 ；SEQ ID NO:67 的核苷酸 1-2148 ；SEQ ID NO:69 的核苷酸1-690 ；SEQ ID NO:71 的核苷酸 1-1494 ；SEQ ID NO:73 的核苷酸 1-1410 ；SEQ ID NO:75 的核苷酸1-756 ；SEQ ID NO:77的核苷酸1-1695。在另一實施方案中，疫苗組合物包含具有SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、 60、
62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個所示氨基酸序列的多肽或其功能和/或免疫原性片段或變體。在另一實施方案中，疫苗組合物包含馬流感病毒的多核苷酸或多肽，其中所述多核苷酸或多肽與犬科動物流感多核苷酸或多肽具有至少約90%、或者至少約95%、或至少約96%、或97%、或98%、或99%或更高序列同一性。在一個實施方案中，來自多種毒株的病毒多肽可以組合在疫苗組合物中并且用于接種宿主動物。例如，基于來自至少兩種不同毒株的本發(fā)明的流感 病毒的病毒HA蛋白質的多肽可以組合在疫苗中。該多肽可以與一種毒株同源或者可以包含“雜合”或“嵌合”多肽，其氨基酸序列來自結合或者連接來自至少兩種不同毒株的多肽。制備病毒多肽的步驟是本領域公知的。例如，使用固相合成方法(Merrifield, 1963)可以合成病毒多肽和肽。使用重組DNA技術也可以產生病毒多肽和肽，其中編碼病毒蛋白質或者肽的多核苷酸分子在宿主細胞，如細菌、酵母或者哺乳動物細胞系中表達，并且使用本領域的標準技術純化表達的蛋白質。
[0193]本發(fā)明的疫苗組合物還包括裸核酸組合物。在一個實施方案中，核酸可以包含編碼本發(fā)明的流感病毒的HA和/或NA蛋白質的核苷酸序列。核酸接種的方法是本領域中已知的并且描述于例如美國專利號6，063，385和6，472，375。核酸可以為質?；蛘呋虮磉_盒的形式。在一個實施方案中，將核酸包裹在脂質體中提供，將所述脂質體施用于動物。
[0194]可以為根據本發(fā)明使用的疫苗組合物和免疫原，如多肽和核酸提供可藥用載體或者稀釋劑?？梢愿鶕苽渌帉W上有用的組合物的已知方法配制用于本發(fā)明的化合物和組合物。在本領域技術人員公知和容易得到的許多來源中詳細描述了制劑。例如，E.ff.Martin, Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed., 1995 的Remington’ s Pharmaceutical Science描述了可以用于本發(fā)明的制劑。通常，將配制本發(fā)明的組合物使得有效量的免疫原與合適的載體組合以便促進組合物的有效施用。用于本發(fā)明方法中的組合物還可以為多種形式。這些包括例如，固體、半固體和液體劑型，如片劑、丸齊?、粉劑、液體溶液劑或混懸劑、栓劑、注射液和灌注液，和噴霧劑。優(yōu)選的形式取決于預期的施用方式和治療應用。組合物還優(yōu)選包括本領域技術人員已知的常規(guī)的可藥用載體和稀釋劑。用于本發(fā)明肽模擬物的載體或稀釋劑的實例包括，但不限于，水、鹽水、油，包括礦物油、乙醇、二甲基亞砜、明膠、環(huán)糊精、硬脂酸鎂、葡萄糖、纖維素、糖、碳酸鈣、甘油、氧化鋁、淀粉和等同的載體和稀釋劑，或者這些任一種的混合物。本發(fā)明免疫原的制劑還可以包含懸浮劑、保護劑、潤滑劑、緩沖劑、防腐劑和穩(wěn)定劑。為了提供施用此類劑量用于所希望的治療性治療，本發(fā)明的藥物組合物將有利地包含基于包括載體或稀釋劑的總組合物的重量按重量計約0.1%到45%，特別I到15%的一種或多種免疫原。[0195]通過本領域公知的方法可以制備本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物。例如，通常將疫苗或者免疫原制備為注射劑，例如，液體溶液劑或者混懸劑。以與劑量制劑相容的方式和在受體中治療有效和免疫原性的量施用疫苗或者免疫原。本領域技術人員可以容易地確定具體疫苗或者免疫原制劑的最佳劑量和施用模式。
[0196]還可以以多抗原肽(MAP)構建體的形式提供本發(fā)明的肽和/或多肽。已經在Tam(1988)描述了 MAP構建體的制備。MAP構建體利用賴氨酸殘基的核心基質，其上合成多個拷貝的免疫原(Posnett et al.，1988)。可以根據本發(fā)明的方法制備并在疫苗組合物中施用多種MAP構建體，每種含有相同或者不同的免疫原。在一個實施方案中，為MAP構建體提供一種或多種佐劑和/或與一種或多種佐劑一起施用。還產生了本發(fā)明的流感多肽并且作為包含一種或多種多肽的大分子蛋白質結構施用。公布的美國專利申請US2005/0009008描述了產生作為流感病毒疫苗的病毒樣顆粒的方法。
[0197]根據本發(fā)明的方法，將本文描述的疫苗和免疫原性組合物施用于易感宿主，通常犬科動物，并且更通常為馴養(yǎng)的狗，以誘導保護性免疫以抵抗病毒對宿主隨后的攻擊或者感染的有效量和方式施用。在一個實施方案中，宿主動物是犬科動物。犬科動物包括野生的、動物園的和馴養(yǎng)的犬科動物，如狼、郊狼和狐貍。犬科動物還包括狗，尤其馴養(yǎng)的狗，如純種和/或雜種陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、獵狗、守衛(wèi)狗、警犬、賽犬和/或實驗用
狗。在特定實施方案中，宿主動物是馴養(yǎng)的狗，如靈觀8通常腸胃外、通過注射，例如皮下、腹膜內或者肌內注射施用疫苗或者免疫原。其他合適的施用方式包括經口或者經鼻施用。通常，將疫苗或者免疫原施用于動物至少兩次，每次施用之間為一周或多周的間隔。然而，設想用于初次和加強施用疫苗或者免疫原的其他方案，并且該方案可以取決于從業(yè)醫(yī)生的判斷和被治療的具體宿主動物。
[0198]使用本領域中已知的方法，可以將疫苗制劑中的病毒和病毒感染的細胞失活或者減毒。例如，通過暴露于低聚甲醛、福爾馬林、丙內酯(BPL)、溴乙胺(BEA)、二元氮丙啶(BEI)、苯酚、紫外線、高溫、凍融、聲處理(包括超聲處理)等可以失活或者減毒完整病毒和受感染的細胞。疫苗劑量中無細胞的完整病毒的量將通常為約0.1mg到約5mg，更通常約
0.2mg到約2mg。包含病毒感染的細胞系的疫苗制劑的劑量將通常含有每劑約16到約18個細胞，更通常每劑約5xl06到約7.5xl07個細胞。用于動物的劑量中蛋白質或肽免疫原的量可以從約0.1 μ g到10000 μ g,或約I μ g到5000 μ g,或約10 μ g到1000 μ g,或約25 μ g到750 μ g,或約50 μ g到500 μ g,或100 μ g到250 μ g，取決于接受劑量的動物的大小、年齡等等。
[0199]本發(fā)明的免疫原性或者疫苗組合物，如病毒或者病毒感染的細胞或者病毒蛋白質或肽可以與佐劑組合，通常剛好在施用前組合。設想用于疫苗制劑的佐劑包括蘇氨?；谒岫y(MDP) (Byars et al., 1987)、阜苷、Cornebacterium parvum、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、鋁，或者這些任一種的混合物。適于用于本發(fā)明的方法和疫苗的多種其他佐劑，如明礬，是本領域中公知的，并且設想用于本發(fā)明。
[0200]本發(fā)明還涉及特異結合本發(fā)明的蛋白質或者肽的抗體。本發(fā)明的抗體包括單克隆和多克隆抗體組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明中設想完整抗體和其抗原結合片段。從而，例如，合適的抗原結合片段包括Fab2、Fab和Fv抗體片段。本發(fā)明的抗體可以用可檢測部分，如熒光分子標記(例如，螢光素或者酶)。[0201]本發(fā)明還涉及用于檢測和鑒定本發(fā)明的流感病毒和診斷本發(fā)明的流感病毒對動物的感染的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括檢測來自動物的生物樣品中犬科動物流感的存在。樣品中犬科動物流感的檢測可用于診斷動物中的犬科動物流感。該信息又可以提供基于區(qū)分隨時間存在的犬科動物流感的水平來預后動物的能力，并且可以幫助選擇動物的治療劑和治療，和幫助監(jiān)測療法。該方法還提供了確立在測試的動物中不存在犬科動物流感的能力。
[0202]檢測動物中犬科動物流感的能力允許評估不同的地理位置中犬科動物流感的爆發(fā)。該信息還允許早期檢測從而可以隔離受感染的動物，以限制疾病的傳播，和允許早期干預治療選擇。此外，得到該信息可以為準備治療許多患病動物的醫(yī)學人員提供指導，包括裝備藥材供應，和如果可以得到，疫苗。
[0203]在一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及從受試動物，如犬科動物收集生物樣品。生物樣品可以是任一種生物樣品，包括細胞、組織、毛發(fā)、全血、血清、血漿、乳頭抽吸物、肺灌洗液、腦脊液、唾液、汗液和淚液。
[0204]動物受試樣品可以來自懷疑具有犬科動物流感病毒的動物,無論該動物是否顯示出疾病癥狀。還可以提供對照樣品或者從已知沒有犬科動物流感的動物收集?？梢蕴峁╊~外的對照例如，以減少假陽性和假陰性結果，和證實測定中的試劑主動檢測犬科動物甲型
流感病毒。
[0205]除了檢測生物樣品中犬科動物流感的存在或不存在，本發(fā)明中使用的檢測方法可以檢測犬科動物流感病毒中的突變，如核酸序列的改變，其可以由環(huán)境、藥物治療、遺傳操作或者突變、損傷、食 物的改變、衰老或者動物的任何其他的特征引起。突變還可以導致犬科動物甲型流感變得抵抗以前有效的藥物，或者使得病毒感染和在不同物種的動物或者人類中繁殖。例如，已經表明鳥類甲型流感病毒感染其他動物和人。
[0206]在用于檢測動物中流感病毒的一個實施方案中，通過收集高質量的樣品、它們快速運輸到檢測設施、和在實驗室檢驗前合適的保存方便了診斷。在含有受感染的細胞和分泌物的樣品中最佳地檢測到病毒。在一個實施方案中，在臨床癥狀發(fā)作后前3天內采集用于直接檢測病毒抗原和/或核酸和/或病毒分離的樣品。多種類型的樣本適于診斷上呼吸道的病毒感染，包括，但不限于，鼻拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽吸物、鼻洗液和喉嚨拭子。除了拭子外，還可以采集組織或者血清的樣品，并且還可以進行侵入性步驟。
[0207]在一個實施方案中，收集呼吸系統(tǒng)樣品并以l_5ml病毒運送培養(yǎng)基運輸。滿足多種病毒的回收的多種培養(yǎng)基可通過商業(yè)途徑獲得。向運送培養(yǎng)基中加入臨床樣品。還可以用病毒運送培養(yǎng)基運送鼻或者鼻咽拭子。運送培養(yǎng)基的一個實例是10克小牛肉浸汁和2克牛白蛋白級分V，加入到無菌蒸餾水至400m。也可以加入抗生素，如0.8ml硫酸慶大霉素溶液(50mg/ml)和3.2ml兩性霉素B (250 μ g/ml)。優(yōu)選通過過濾消毒培養(yǎng)基。鼻洗液，如無菌鹽水(0.85%NaCl)也可以用于收集呼吸系統(tǒng)病毒的樣品。
[0208]在一個實施方案中，在臨床癥狀發(fā)生后不久，優(yōu)選不遲于7天內，從急性期動物的1- 5ml量的全血收集血清。還例如在癥狀發(fā)生后約14天收集恢復期血清樣品。在中和試驗中，血清樣品可以用于檢測抗呼吸系統(tǒng)病毒的抗體。
[0209]在一個實例中，可以在一定期限內(例如，每天一次，每周一次，每月一次，每半年一次或者每年一次)從個體動物收集樣品。在一定時期內從個體動物得到多個樣品可以用于驗證來自更早檢測的結果，和/或鑒定對特定治療，例如，對所選的治療藥物的應答或者抗性。
[0210]本發(fā)明的方法可以用于檢測來自動物的受試樣品中一種或多種病理物質的存在，和每種病理物質的水平?？梢允褂糜糜跈z測病理物質的任何方法，包括但不限于，抗體測定法，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、間接熒光抗體(IFA)檢測、血細胞凝集，和血細胞凝集抑制(HI)測定法，和蛋白質印跡。也可以使用已知的細胞培養(yǎng)方法。使用細胞培養(yǎng)物的免疫熒光或者細胞培養(yǎng)基(上清液)的HI測定法，可以進一步鑒定陽性培養(yǎng)物。
[0211]此外，可以使用檢測核酸(DNA或者RNA)或者蛋白質的方法。此類方法包括，但不限于，聚合酶鏈式反應(PCR)和逆轉錄酶(RT)PCR測試和實時測試，和定量核酸酶保護測定法?？衫猛ㄟ^商業(yè)途徑可獲得的測試試劑盒用于進行這些測定法。例如，QIAGEN(Valencia, CA)出售一步RT-PCR試劑盒，和病毒RNA提取試劑盒。
[0212]在一個實施方案中，該方法利用對本發(fā)明的病毒或病毒蛋白質特異的抗體。在特定實施方案中，利用對本發(fā)明病毒的HA蛋白質特異的抗體。在一個實施方案中，使用對本發(fā)明病毒的NP蛋白質特異的抗體。從動物得到合適的樣品，如來自鼻或者鼻咽區(qū)域的樣品，并從中分離病毒或者病毒蛋白質。然后對病毒組分篩選對蛋白質，如本發(fā)明病毒的HA或者NP特異的抗體的結合。在另一實施方案中，從動物得到血清樣品(或者其他含有抗體的樣品)并對血清篩選結合本發(fā)明病毒的蛋白質的抗體的存在。例如，可以進行ELISA測定，其中平板壁具有結合到壁的HA和/或NP蛋白質，或者其肽片段。然后將平板壁與來自受試動物的血清或者抗體接觸。動物中特異結合HA和/或NP蛋白質的抗體的存在表明該受試動物受到或者已經受到本發(fā)明的流感病毒的感染。
[0213]在一個實施方案中，通過測定生物樣品中抗病理物質的抗體的存在或不存在，檢測病理物質的存在。 在動物受感染后可以在血液檢驗中檢測到抗體之前，需要一定的時間(例如，數月)?？贵w一旦形成，通常持續(xù)許多年，甚至在成功地治療該疾病之后。發(fā)現針對犬科動物甲型流感病毒的抗體不能指出感染是最近的還是在過去的某個時間。
[0214]還可以用液體進行抗體測試?？贵w測定法包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、間接熒光抗體(IFA)測定法，和蛋白質印跡。優(yōu)選地，使用多種測定法，如ELISA或者IFA，接著通過蛋白質印跡進行抗體測試。在兩步方法中，使用ELISA或者IFA測定法，接著通過蛋白質印跡進行抗體測定法。認為ELISA是比IFA更可靠和更準確的測定法，但是如果不能利用EILSA，那么可以使用IFA。蛋白質印跡測試(其是更特異的測試)也可以在所有動物中進行，尤其在那些在ELISA或者IFA測定中檢測為陽性或者臨界陽性(含糊的)的動物中進行。
[0215]可以用于檢測流感病毒的其他基于抗體的測試包括血細胞凝集抑制測定法。如所述的使用雞或者火雞紅細胞(Burleson et al.，1992)和Kendal et al.，1982)，可以檢測來自動物的生物樣品中的血細胞凝集活性。在一個實施方案中，將本發(fā)明的流感或者HA蛋白或者肽與含有血清或者抗體的測試樣品接觸。然后加入來自動物如鳥的紅細胞(RBC)。如果存在抗HA的抗體，那么RBC將不凝集。如果不存在抗HA的抗體，那么在HA存在下，RBC將凝集。對標準血細胞凝集抑制測定法的變更和修改是本領域中已知的并且設想在本發(fā)明的范圍內。
[0216]通過從樣品如鼻或者鼻咽拭子分離病毒，可以確定動物的感染。使用標準方法，包括細胞培養(yǎng)和雞胚接種，可以進行病毒分離。
[0217]在進一步的實施方案中，可以用基于核酸的測定法檢測本發(fā)明的病毒。在一個實施方案中，從動物得到核酸樣品并將該核酸進行PCR，如果該核酸含有對本發(fā)明的流感病毒特異的序列，那么使用的引物將產生擴增產物。在特定實施方案中，在測定中將RT-PCR用于本發(fā)明病毒。在示例的實施方案中，用實時RT-PCR測定本發(fā)明的流感病毒。PCR、RT-PCR和實時PCR方法是本領域中已知的并且已經在美國專利號4，683，202; 4, 683，195; 4, 800，I59; 4，965，188; 5，994，056; 6，814，934;和 Saiki et al.(1985) ; Sambrook et al.(1989) ; Leeet al.(1993);和Livak et al.(1995)中。在一個實施方案中，PCR測定法使用對流感基質(MA)基因和/或HA基因特異的寡核苷酸。還可以對擴增產物測序以確定該產物是否具有本發(fā)明的流感病毒的序列。其他基于核酸的測定法可以用于檢測和診斷本發(fā)明病毒的病毒感染并且設想此類測定法在本發(fā)明的范圍內。在一個實施方案中，將含有核酸的樣品進行基于PCR的擴增，使用正向和反向引物，其中所述引物對病毒多核苷酸或者基因序列特異。如果樣品中的核酸是RNA，那么可以進行RT-PCR。對于實時PCR，將可檢測的探針與引物一起使用。
[0218]對許多循環(huán)流感病毒的血凝素(HA)基因特異的引物組是已知的，并且正在被不斷開發(fā)出來。流感病毒基因組是單鏈RNA，并且必須使用逆轉錄酶(RT)聚合酶進行DNA拷貝(cDNA)。例如，使用RT-PCR對RNA基因組的擴增需要一對寡核苷酸引物，其通?；诩仔土鞲胁《緛喰偷囊?知的HA序列和神經氨酸酶(NM)-1設計?？梢赃x擇引物使得它們將特異擴增僅一種病毒亞型的RNA。使用亞型特異的引物產生的DNA可以通過分子遺傳學技術如測序進一步分析。試驗優(yōu)選用陽性對照進行，或者產物通過測序并與已知序列比較來驗證。不存在目標PCR產物(即，“陰性”結果)不能排除病毒的存在。然后可以在幾小時內從臨床拭子或者感染的細胞培養(yǎng)物得到結果。甲型流感病毒的PCR和RT-PCR試驗由Fouchieret al., 2000 和 Maertzdorf et al., 2004 描述。
[0219]本發(fā)明還涉及篩選對本發(fā)明的病毒具有抗病毒活性的化合物或藥物的方法。在一個實施方案中，將本發(fā)明的病毒感染的細胞與受試化合物或者藥物接觸。然后測定接觸后病毒的量或者病毒活性?？梢赃x擇顯示出抗病毒活性的那些化合物或者藥物用于進一步評估。
[0220]本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的流感病毒感染的分離的細胞。在一個實施方案中，所述細胞是犬科動物細胞，如犬科動物腎上皮細胞。
[0221]本發(fā)明還涉及用編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明多核苷酸轉化的細胞。優(yōu)選地，在本發(fā)明的表達構建體中提供所述多核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述表達構建體提供了在細胞中過表達有效連接的本發(fā)明的多核苷酸。在一個實施方案中，用多核苷酸序列轉化細胞，所述多核苷酸序列包含編碼 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76 或 78 的任一個中顯示的氨基酸序列，或者其功能片段或者變體的序列。在特定實施方案中，用編碼SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸轉化的細胞分別包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或 77 中所示的核苷酸序列，或者編碼 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76 或 78 的任一個的功能片段或者變體的序列。從而，本發(fā)明涉及用包含SEQ IDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75 或 77 的任一個中所示的核苷酸序列或者 SEQ IDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個的片段或者變體，包括簡并變體的多核苷酸序列轉化的細胞。
[0222]所轉化的細胞可以是真核細胞，例如，植物細胞，包括原生質體，或者轉化的細胞可以是原核細胞，例如，細菌細胞，如大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌。動物細胞包括人細胞，哺乳動物細胞，部分犬科動物細胞、鳥類細胞和昆蟲細胞。植物細胞包括，但不限于，雙子葉植物細胞、單子葉植物細胞和針葉樹細胞。
[0223]本發(fā)明還涉及表達和產生本發(fā)明的病毒蛋白或者多肽的轉基因植物。本發(fā)明設想用本發(fā)明的多核苷酸轉化或者經育種而含有本發(fā)明的多核苷酸的植物、植物組織和植物細胞。優(yōu)選地，在植物、植物組織或者植物細胞中過表達本發(fā)明的多核苷酸。植物可以用于產生本發(fā)明的流感疫苗組合物并且可以通過植物的消費施用疫苗(見，例如，美國專利號5，484，719 和 6，136，320)。
[0224]本發(fā)明還涉及用于檢測病毒或者診斷本發(fā)明的病毒感染的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含本發(fā)明的 抗體，其特異結合本發(fā)明的流感病毒，或者其抗原性部分。在另一實施方案中，試劑盒包含本發(fā)明的一種或多種多肽或者肽。在特定實施方案中，所述多肽具有 SEQ ID N0.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、
56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個中所示的氨基酸序列，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。在另一實施方案中，試劑盒包含一種或多種本發(fā)明的多核苷酸或者寡核苷酸。在特定實施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID N0.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、
21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75 或 77 任一個中所示的核苷酸序列，或者其片段或者變體。試劑盒可以任選包含一種或多種對照抗體、對照多肽或者肽，和/或對照多核苷酸或者寡核苷酸。試劑盒的抗體、多肽、肽、多核苷酸和/或寡核苷酸可以在合適的容器或者包裝中提供。
[0225]本申請還涉及雜種狗作為流感病毒感染和發(fā)病機理模型的用途。在一個實施方案中，對雜種狗接種本發(fā)明的流感病毒，如犬科動物流感病毒。任選地，接種后可以對狗施用治療劑。在用病毒接種之前，還可以對狗施用組合物用于產生針對流感病毒的免疫應答?？梢栽诮臃N之前和/或之后得到組織、血液、血清和其他生物樣品并使用本領域中已知的方法檢查病毒的存在和組織的發(fā)病機理，所述方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、核酸測序，和免疫組織化學。
[0226]將犬科動物流感病毒毒株(稱作“A/canine/Florida/43/2004”和“A/canine/Florida/242/2003”)于2006年10月9日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，P.0.Boxl549, Manassas, VA20108,其中犬科動物流感病毒毒株“A/canine/Florida/43/2004”的保藏號為PTA-7914，犬科動物流感病毒毒株“A/canine/Florida/242/2003”的保藏號為PTA-7915。將犬科動物病毒毒株(稱作“canine/Jax/05”和“canine/Miami/05”)于2006年10月17日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，P.0.Boxl549, Manassas, VA20108，其中犬科動物流感病毒毒株“canine/Jax/05” (也稱作“A/Canine/Jacksonville/05”)的保藏號為PTA-7941，犬科動物流感病毒毒株“canine/Miami/05”(也稱作“A/Canine/Miami/05”)的保藏號為PTA-7940。已經將主題病毒毒株保藏在這樣的條件下，其確保在本專利申請待決期間，根據37CFR1.14和35U.S.C.122授權的專利和商標委員(Commiss1ner of Patents and Trademarks)決定的人可以得到所述培養(yǎng)物。在提交主題申請的副本或其后續(xù)申請的國家，如需要可以按照所述國家的外國專利法獲得所述保藏物。然而，應該理解保藏物的可得性不構成實施本發(fā)明而損害政府行為授予的專利權的許可。
[0227]此外，將根據微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定保藏主題病毒保藏物并且可以被公眾獲得，即將進行所有必要的管理以保存它而確保在供應保藏物樣品的最近請求后至少5年的期間內和在任何情況下，保藏日后的至少30年期間內或者可以出版公開該培養(yǎng)物的任何專利的可實施期間內是存活的和未受污染的。保藏人承認當請求時，由于保藏物的條件保藏機構不能提供樣品時而更換保藏物的的義務。當公開該保藏物的專利被授權時，主題培養(yǎng)保藏物對公眾可得性的所有限制都將被不能改變地廢除。
[0228]表57 闡明了在鑒定為 A/canine/Florida/43/2004(Ca/Fla/43/04)的犬科動物流感病毒以及H3N8馬隔離群以及canine/Florida/242/2003隔離群的血凝素(或“HA”)、神經氨酸酶(或“NA”)和核蛋白(NP)基因編碼的氨基酸之間的相似性。
[0229]本文公開的任一實施方案的任一元素可以與本文的任何其他元素或者實施方案組合，并且特別設想此類組合在本發(fā)明的范圍內。
[0230]本文提及或者引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版物都完整(包括所有圖和表)引入本文作為參考，直到它們與本說明書的明確教導不一致的程度。
[0231]實施例1 — 6的材料和方法
[0232]從靈I收集血液和鼻拭子
[0233]從在賽跑狗舍中經歷呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)的臨床上患病的或者正常的靈觀通過頸
靜脈穿刺收集急性和恢復期血液樣品。在急性樣品后4到12周收集恢復期樣品。收獲血清并在一 80°C保存。收集鼻拭子并在遞交用于細菌分離之前置于具有炭的Amies運送培養(yǎng)基(Becton Dickinson B1sciences)中。
[0234]靈猨.的尸體剖檢
[0235]由佛羅里達大學獸醫(yī)學院(Universityof Florida College of VeterinaryMedicine (UF CVM))的解剖病理學處(Anatomic Pathology Service)對 2004 年 I 月在佛
羅里達賽場的爆發(fā)中死亡的8只靈麗的5只進行完全的尸體剖檢。另一只狗的尸體剖檢
在私立的獸醫(yī)診所進行，將組織遞交到UF CVM用于組織病理學診斷。將組織用10%中性緩沖福爾馬林固定，包埋在石蠟中，并對5-μ m切片用蘇木精和伊紅染色用于組織病理學診斷或者處理用于如下述的免疫組織化學。遞交未固定的組織用于細菌培養(yǎng)并且也保存在一80。。。
[0236]犬科動物呼吸系統(tǒng)病原體的血 清學試驗
[0237]將配對的急性和恢復期血清樣品遞交給康耐爾大學獸醫(yī)學院(CornellUniversity College of Veterinary Medicine)的動物健康診斷實驗室(Animal HealthDiagnostic Laboratory (AHDL))，對犬瘟熱病毒、2型腺病毒和副流感病毒進行血清中和測定?？贵w效價表達為抑制細胞培養(yǎng)物的病毒感染的血清的最終稀釋度。血清轉變表明病毒感染，將血清轉變定義為急性和恢復期樣品之間抗體效價升高> 4倍。沒有檢測到對這些病毒病原體的血清轉變。
[0238]犬科動物細菌呼吸系統(tǒng)病原體的微生物試驗
[0239]將配對的鼻拭子和死后組織遞交給UF CVM的診斷臨床微生物學/寄生蟲學/血清學處(Diagnostic Clinical Microb1logy/Parasitology/Serology Service)用于細菌分離和鑒定。在非選擇培養(yǎng)基以及選擇博德特氏菌(Bordetella)種(Regan-Lowe; Remel)和支原體(Mycoplasma)種(Remel)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)樣品。在沒有報告生長前，保持所有培養(yǎng)物21天。還將一些靈薇的鼻拭子遞交給堪薩斯州立大學獸醫(yī)學院(Kansas StateUniversity College of Veterinary Medicine)的診斷醫(yī)學 / 病理生物學系(Departmentof Diagnostic Medicine/Pathob1logy)用于細菌培養(yǎng)。在所檢驗的70只臨床上患病的狗中，從I只狗的鼻腔分離支氣管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica),而從33只狗的鼻腔回收支原體。通常用化膿性鼻涕從狗的鼻腔回收出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)。在2004年I月的爆發(fā)中死亡的兩只狗在死亡后肺中具有大腸桿菌的不足的生長，一只狗具有大腸桿菌和犬鏈球菌(Streptococcus canis)的不足的生長,另一只具有銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和酵母的不足的生長。從死亡狗的氣管或者肺中沒有分離到支氣管博德特氏菌或者支原體。
[0240]從死后組織分離病毒
[0241]將冷凍的組織解凍并在10倍體積的補充0.5%牛血清白蛋白(BSA)和抗生素的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中 勻漿。通過離心除去固體碎片并將上清液接種到培養(yǎng)的細胞或
者10天齡的含胚的雞蛋中。將來自死亡靈.提的組織勻漿物接種到不同的細胞培養(yǎng)物中，
該培養(yǎng)物支持多種病毒病原體的復制。細胞培養(yǎng)物包括Vero (非洲綠猴腎上皮細胞，ATCCN0.CCL-81)、A-72 (犬腫瘤成纖維細胞，CRL-1542) ,HRT-18 (人直腸上皮細胞，CRL-11663)、MDCK(犬腎上皮細胞，CCL-34)、原代犬腎上皮細胞(AHDL，Cornell University)、原代犬肺上皮細胞(AHDL)和原代牛睪丸細胞(AHDL)。在補充2.5ug/mL TPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma)的MEM中培養(yǎng)MDCK和HRT細胞；在補充10%胎牛血清和抗生素的MEM中培養(yǎng)剩余的細胞系。在25cm2瓶中37°C下在含有5%C02的增濕空氣中培養(yǎng)細胞。用經補充的MEM接種對照培養(yǎng)物。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)改變并在接種后5天收獲。將收獲的液體和細胞通過離心澄清并如對最初接種所描述的接種在新鮮細胞上；進行兩次盲法傳代。使用雞或者火雞血紅細胞如所述的(Burleson et al., 1992; Kendal et al., 1982)測定澄清的上清液中的血細胞凝集活性。對于雞胚中的病毒分離，將0.1mL組織勻漿物接種在尿膜囊中并在35°C下培養(yǎng)48小時。兩次盲法傳代后，如所述的測定尿囊液中的血細胞凝集活性(Burleson etal.,1992;Kendal et al., 1982)。
[0242]RT-PCR、核苷酸測序和系統(tǒng)講化分析
[0243]使用RNeasy試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)根據生產商的使用說明，從組織培養(yǎng)物上清液或者尿囊液提取總RNA。使用一步RT-PCR試劑盒(Qiagen，Valencia, CA)根據生產商的使用說明將總RNA(1ng)逆轉錄成cDNA。如以前描述的(Klimov et al.，1992a)，使用通用的基因特異性引物組進行cDNA中8種流感病毒基因的編碼區(qū)的PCR擴增。所得DNA擴增子用作Applied B1systems3100自動化DNA測序儀上的自動化測序的模板,使用循環(huán)
測序染料終止化學(ABI)。用 t;CG Package" ,版本 10.0(Accelyrs) (WombIe, 2000)
分析核苷酸序列。用Phylogeny Inference Packaged版本3.5估計系統(tǒng)發(fā)生和從核苷
酸序列計算自展值(Felsenstein, 1989)。使用 MEGA@ 程序(Kumar et al., 2004)中實現的Tamura-Nei gamma模型,將系統(tǒng)樹與近鄰連接分析產生的那些系統(tǒng)樹比較,并通過PAUP"5 4.0Beta 程序(Sinauer Associates)證實。
[0244]狗的實驗接種
[0245]使用四只6個月齡的特定無病原體的小獵兔犬[2只雄性和2只雌性(LibertyResearch)]。體檢和基線血試驗，包括全血細胞計數/微分、血清化學小組和尿分析確定動物是健康的。將它們養(yǎng)在試驗動物照料評估和認證協(xié)會(Associat1n for Assessment andAccreditat1n of Laboratory Animal Care)認證的BSL2-增強型設施中。每天兩次持續(xù)7
天記錄基線直腸溫度。通過異丙酚(腿privan?, Zeneca Pharmaceuticals, 0.4mg/kg 體
重以生效)的靜脈內注射麻醉狗用于用氣管內插管進行插管法。每只狗接種總劑量為16 6半數組織培養(yǎng)感染量(TCID5tl)的 A/Canine/Florida/43/2004(Canine/FL/04) (H3N8)病毒，將一半的劑量通過氣管內插 管施用于遠端氣管并將另一半劑量通過導管施用于鼻道深處。接種后(p.1.) 14天，每天兩次進行體檢和直腸溫度記錄。通過頸靜脈穿刺在接種后0、3、5、
7、10和14天收集血樣(4mL)。在接種后O到5、7、10和14天用聚酯拭子(Fisher Scientific)從每只狗收集鼻和鼻咽樣品。將拭子置于病毒運送培養(yǎng)基(Remel)中并保存在一 80°C。通過在接種后5天靜脈內接種Beuthanasia-D⑩溶液(lmL/5kg體重;Schering-PloughAnimal Health Corp)對兩只狗實施安樂死(I只雄性和I只雌性)并在第14天對剩下的2只狗進行尸體剖檢。如所述的處理用于組織學分析的組織。用于病毒培養(yǎng)的組織在一80°C保存。該研究得到佛羅里達大學機構動物管理和使用委員會(University of FloridaInstitut1nal Animal Care and Use Committee)的批準。
[0246]病毒從實驗接種的狗的脫落
[0247]通過離心澄清拭子運送培養(yǎng)基制備的肺勻漿物和拭子提取物的連續(xù)稀釋液用補充0.5%BSA和抗生素的MEM建立。如所述的(Burleson et al.，1992)使用單層MDCK細胞在6孔組織培養(yǎng)板中進行噬菌斑測定。用含有0.8%瓊脂糖和1.5ug/mL TPCK-胰蛋白酶的補充的MEM覆蓋接種的細胞單層。在固定和用結晶紫染色前，在含有5%C02的增濕的空氣中37°C下培養(yǎng)細胞72小時。病毒濃度表達為每克組織或者每個拭子的噬斑形成單位(PFU)。
[0248]免疫組織化學
[0249]在Bond-Rite? 載玻片(Richard-AlIan Scientific, Kalamazoo, Ml)上封固來自靈.薇:和小獵兔犬的脫蠟和再水化的5-μ m肺組織切片并隨后用蛋白
酶K (DakoCytomat1n, Carpenteria, CA)接著用過氧化物酶封閉試劑(DftkO?EnVis1n?Peroxidase Kit, Dako Corp.)處理。將切片與抗犬痕熱病毒(VMRD，Inc.)、犬2型腺病毒(VMRD，Inc.)、犬副流感病毒(VMRD，Inc.)或者甲型流感H3 (ChemiconInternat1nal, Inc.)的單克隆抗體的1:500稀釋液在室溫下溫育2小時。對照包括用小鼠IgG(lmg/mL，Serotec, Inc.)溫育相同的切片，并溫育單克隆抗體與正常的犬肺切片。
用一級抗體處理后，用二級免疫過氧化物酶和過氧化物酶底物試劑(；Dak0? EnVis1n?
Peroxidase Kit, Dako Corp.)根據生產商的使用說明溫育切片。將切片用蘇木精復染，用Clarifier#2 和 Bluing Reagent (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI)處理，脫水，并用 Permount(ProSciTech)蓋片。
[0250]血.細胞凝集抑制(HI)測定法
[0251]在37°C下用受體破壞酶(RDE，Denka) (1份血清:3份RDE)溫育血清樣品16小時，然后在56 °C熱失活60分鐘。在37 °C下在MDCK細胞中培養(yǎng)Influenza A/Canine/FL/04(H3N8)病毒36-48小時。收獲病毒培養(yǎng)上清液，通過離心澄清，并在一 80°C保存。如以前描述的進行HI測定法(Kendal et al.，1982)。簡言之，將25 μ I中的4血凝單位病毒加入微量滴定孔中等體積的連續(xù)稀釋的血清，并在室溫溫育30分鐘。加入等體積的0.5%ν/V火雞紅細胞并在30分鐘后通過視覺評估血細胞凝集效價。將終點HI效價定義為完全抑制血細胞凝集的血清的最后稀釋度。將血清轉變定義為配對的急性和恢復期樣品之間的HI效價> 4倍增加。將單個樣品的血清陽性定義為≥ 1:32的HI抗體效價。
[0252]微量中和Ml測定 [0253]通過如以前描述的MN 測定法(Rowe et al.，1999)檢測對 A/Canine/FL/04 (H3N8)的中和血清抗體應答，只是在測定前對犬血清進行如上述的RDE處理。將終點效價定義為得到病毒的100TCID5(i50%中和的血清的最高稀釋度。將血清轉變定義為配對的急性和恢復期樣品之間麗效價≥4-倍增加。將單個樣品的血清陽性定義為麗效價≥1:80。
[0254]下面是闡明實施本發(fā)明方法的實例。不應該將這些實施例理解為限制。除非另外指出，所有百分數都是按重量計并且所有溶劑混合物比例都是按體積計。
[0255]實施例1
[0256]在2004年I月，在Florida賽場的2個狗舍中喂養(yǎng)的22只競賽靈和為這些狗
舍提供狗的當地農場中發(fā)生了呼吸系統(tǒng)疾病的爆發(fā)。在每個狗舍建筑中有約60只狗，農場中約300只狗。在6天內發(fā)生了爆發(fā)，之后沒有鑒定到新的病例。22只狗的14只具有39.5到41.5°C的發(fā)熱，發(fā)咝的作嘔性咳嗽10到14天，并且最終恢復。在剩余的8只狗中，6只明顯健康的狗出乎意料地死亡，具有口和鼻出血。兩只其他狗由于快速惡化，在發(fā)生口鼻出血的24小時內實施安樂死。這些狗都具有41°C發(fā)熱。8例死亡中4例在狗舍建筑物中發(fā)生，4例在農場發(fā)生。50%的死亡發(fā)生在爆發(fā)的第3天。22只狗的年齡為17個月到4歲，但是73%的為17到33個月齡。
[0257]兩種臨床綜合征是明顯的:較輕微的病，其特征是最初的發(fā)熱和然后咳嗽10 -14天(14只狗)，隨后恢復，或者過急性死亡，伴隨著呼吸道中的出血(8只狗，死亡率為36%)。對8個死亡病例的6例進行了尸體剖檢。所有狗都在肺、縱隔和胸膜腔中具有廣泛的出血。對呼吸道的組織學檢查揭示除了肺部出血外，所有狗都具有氣管炎、支氣管炎、細支氣管炎和化膿性支氣管肺炎(圖3)。這些組織中上皮層和氣道腔中浸潤嗜中性粒細胞和巨噬細胞。將從這些狗制備的肺勻漿物接種到多種猴、人、牛和犬細胞系用于病毒培養(yǎng)。來自一條狗的肺勻漿物在胰蛋白酶存在下在培養(yǎng)的Madin-Darby犬腎上皮細胞(MDCK)中引起細胞病變效應，并且細胞培養(yǎng)上清液凝集了雞紅細胞。通過商業(yè)ELISA檢測甲型和乙型流感病毒的核蛋白，和通過使用對甲型流感病毒的基質基因特異的引物進行PCR分析，提供甲型流感病毒的初步證據。此外，通過針對馬甲型流感H3亞型的參照抗血清抑制了血細胞凝集活性，但是通過對人甲型流感亞型Hl-Hll和H13特異的抗血清沒有抑制血細胞凝集活性(表3)。為了表征病毒的分子性質，我們測定了病毒基因組的8個RNA區(qū)段的核苷酸序列。與已知的流感病毒基因的序列比較和系統(tǒng)進化分析表明犬分離群的8種基因與來自同時代的馬甲型流感(H3N8)病毒最相似，它們與所述病毒的基因共有> 96-97%的序列同一性(圖1A，表4)。相比，來自鳥類、豬和人甲型流感分離株的代表性基因與犬分離群具有≤ 94% 同一性(表 4)。這些數據將犬分離群 A/Canine/Florida/43/04(Canine/FL/04)鑒定為與馬流感病毒的同時代譜系密切相關的甲型流感H3N8病毒。因為犬分離群的所有基因都是馬流感病毒來源的，所以我們推斷馬流感病毒的整個基因組已經轉移到狗。
[0258]實施例2
[0259]為了研究Canine/FL/04在靈.提’中的臨床和病理學觀察中的作用，我們使用抗甲
型流感H3的單克隆抗體對肺組織進行了免疫組織化學染色(IHC)。在支氣管和細支氣管上皮細胞的細胞質、支氣管腺上皮細胞和氣道腔和肺泡腔的巨噬細胞中總是檢測到病毒H3抗原(圖2A)。這些數據支持在多只狗中H3亞型流感病毒的肺部感染的診斷。
[0260]實施例3
[0261]為了確定Canine/FL/04-樣病毒參與呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)的病因，我們通過血細胞凝集抑制(HI)和微量中和法(MN)分析了來自11只病狗和16只無癥狀接觸狗的急性和恢復期血清。在兩種測定法中，在11只中的8只(73%)病狗中發(fā)生了血清轉變，其定義為對Canine/FL/04的抗體效價從急性到恢復期升高≥4-倍(表1)。在HI測定中，16只中的6只(38% )無癥狀接觸狗中發(fā)生血清轉變，而在MN測定法中，16只中的8只(50% )血清轉變(表1)。血清轉變數據表明Canine/FL/04-樣病毒對狗的感染，其與多數動物中呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)作在時間上吻合。
[0262]在與病狗一起喂養(yǎng)的額外的46只無癥狀狗的爆發(fā)后3個月，收集單個血清樣品。其中，在兩種測定法中43只(93%)為血清陽性。對于所測試的73只狗的總群體中，93%的在兩種測定中為血清陽性，包括82%(9/11)只病狗和95%(59/62)健康接觸狗。沒有呼吸系統(tǒng)疾病史的狗中的高血清陽性率表明犬科動物流感病毒的多數感染是亞臨床的并且提示病毒在狗中的有效傳播。亞臨床感染是否促進病毒的傳播還是未知的。
[0263]實施例4
[0264]為了更好地理解Canine/FL/04病毒感染狗的能力，用16 6半數組織培養(yǎng)感染量(TCID50)通過氣管內和鼻內途徑接種四只6月齡purpose-品種的小獵兔犬的每一只。所有狗在接種后前2天(p.1.)都發(fā)生發(fā)熱(直腸溫度> 390C )，但是在14天的觀察期內沒有一只顯示出呼吸癥狀，如咳嗽或者鼻涕。通過用鼻或者口咽拭子定量病毒檢查病毒脫落。4只狗的僅僅兩只脫落可檢測量的病毒。一只狗在接種后I和2天脫落病毒(每個拭子
1.0-2.51og10PFU)，而另一只狗在接種后連續(xù)四天脫落病毒(每個拭子1.4-4.51og10PFU)。
在5p.1.對兩只狗的尸體剖檢揭示了類似于在靈中的自發(fā)疾病中發(fā)現的壞死和增生性氣管炎、支氣管炎和細支氣管炎，但是沒有肺出血或者支氣管肺炎。通過IHC在支氣管、細支氣管和支氣管腺的上皮細胞的細胞質中檢測到病毒H3抗原(圖2B)。從一只狗的肺組織回收感染性病毒。在接種后14天對剩下兩只狗的尸體剖檢顯示了呼吸系統(tǒng)組織中最小的組織學改變，通過IHC沒有檢測到病毒H3抗原，從肺勻漿物沒有回收病毒。到接種后第7天用MN測定法檢測到后兩只狗中的血清轉變，到第14天抗體效價進一步增加2到3倍。這些結果確定狗對Canine/FL/04感染的易感性，如通過發(fā)熱反應、在肺實質中存在病毒抗原和感染性病毒、流感的典型組織學發(fā)現，和血清轉變所證實。在實驗接種的小獵兔犬中不
能再現嚴重疾病和死亡并不令人驚奇，因為大部分的天然感染的靈.觀是無癥狀的。
[0265]實施例5
[0266]為了研究在2004年I月爆發(fā)前，Canine/FL/04-樣流感病毒是否已經在佛羅里
達的靈It群體中傳播，使用HI和MN測定法對來自65只競賽靈提.的存檔血清測試抗
Canine/FL/04的抗體。在來自1996到1999年的33個狗樣品中沒有檢測到抗體。在2000到2003年間的32個狗樣品中，9個樣品在兩種測定法中都是血清陽性的一 I個在2000年，2個在2002年，6個在2003年(表5)。血清陽性狗位于佛羅里達賽場，這些賽場與從1999到2003年未知病因的呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)有關，提示Canine/FL/04-樣病毒可能是那些爆發(fā)的致病因子。為了進一步研究該可能性，我們檢查了來自2003年3月死于出血性支氣管肺
炎的靈.提’的存檔組織。接種到MDCK細胞和雞胚的來自一只狗的肺勻漿物產生了 H3N8流感病毒，稱作 A/Canin e/Florida/242/2003 (Canine/FL/03)。對 Canine/FL/03 的完整基因組的序列分析揭示與Canine/FL/04的>99%同一性(表4)，表明Canine/FL/04-樣病毒在
2004年前已經感染了靈Jte
[0267]實施例6
[0268]從2004年6月到8月，在佛羅里達、德克薩斯、阿拉巴馬、阿肯色、西佛吉尼亞和堪薩斯州的14個賽場的幾千只競賽靈,提中發(fā)生了呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)。
[0269]一些賽場的官員估計他們至少80%的狗群體患有臨床疾病。多數狗具有與2004年I月爆發(fā)中的狗類似的發(fā)熱(> 390C )和咳嗽的臨床病征，但是許多狗也具有粘液膿性鼻涕。報導了多例死亡，但是不能確定準確的死亡率。
[0270]我們收集了位于4佛羅里達賽場的94只狗的配對的急性和恢復期血清:56%的這些狗對Canine/FL/04的抗體效價升高≥4倍，100%為血清陽性的(表6)。來自西佛吉尼亞和堪薩斯州的29只狗的恢復期血清也具有抗Canine/FL/04的抗體。我們從德克薩斯賽場的死于出血性支氣管肺炎的靈魏的肺分離了甲型流感(H3N8)病毒。該分離群(稱作A/Canine/Texas/1/2004 (Canine/TX/04))的完整基因組的序列分析揭示與Canine/FL/04>99%的同一性(表4)。在13個月期間內和從不同的地理位置從致死的犬病例分
離出三種密切相關的流感病毒，以及在競賽靈中普遍感染的實質性血清學證據，提示Canine/FL/04-樣病毒在狗群體中的持續(xù)傳播。
[0271]Canine/FL/03、Canine/FL/04 和 Canine/TX/04 的 HA 基因的系統(tǒng)進化分析表明它們組成單源群，具有有力的自引支持度，其與2002和2003年分離的馬病毒的同時代H3基因明顯不同(圖1B)。其他7種基因組區(qū)段的系統(tǒng)發(fā)生分析和逐對核苷酸序列比較提示犬基因隔離為與馬病毒譜系最密切相關的不同的亞譜系(數據未顯示，和表4)。在HA中存在4個標記氨基酸改變也支持犬流感基因聚類為與馬流感分離的單源群(表2)。與來自2003和2004年的血清學結果一起，這些數據與如下相一致:從馬到狗的單個病毒傳播事件和隨
后該病毒在靈.ft群體中的水平擴散。然而，不能正式排除來自未鑒定的儲存物種的流感病
毒的該獨特譜系的重復導入，雖然這無論如何不太可能。
[0272]病毒HA是流感病毒的宿主物種特異性的關鍵決定子(Suzuki et al.，2000)。為了鑒定HA內可能與對犬科動物宿主的適應有關的殘基，我們比較了犬HA的推導的氨基酸序列與同時代馬病毒的那些氨基酸序列。在馬和犬成熟HA共有氨基酸序列中有四個氨基酸不同:N83S、W222L、I328T和N483T(見表2)。犬病毒當與共有的馬序列比較時具有氨基酸缺失。因此，HA馬序列中的氨基酸位置7是HA犬序列中的位置6，HA馬序列中的氨基酸位置29是HA犬序列中的位置28，HA馬序列中的氨基酸位置82是HA犬序列中的位置82，等等。從而，四個替代的氨基酸在SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中所示氨基酸序列的位置82、221、327和482。在共有序列位置83上絲氨酸對天冬酰胺的替代是未知功能重要性的改變，因為在來自其他物種的H3分子中發(fā)現多種極性殘基。在接近H3HA的切割位點的共有序列位置328上的嚴格保守的異亮氨酸已經被蘇氨酸替代。發(fā)病機理中宿主蛋白酶對HA切割的重要作用提示該改變值得進一步研究。在共有序列位置222上亮氨酸對色氨酸的替代是相當值得注意的，因為它代表與唾液酸結合口袋相鄰的非保守改變，其可以調節(jié)受體功能(Weis et al., 1988) 0有趣的是，在222位的亮氨酸不是犬H3HA特有的，因為它通常被發(fā)現于 H4、H8、H9 和 H12HA 亞型中(Nobusawa et al., 1991; Kovacova et al., 2002)。亮氨酸替代與對哺乳動物宿主的病毒特異性可能更相容，因為已經報導了亞型H4病毒對豬的感染(Karasin et al.，2000)和亞型H9病毒對人和豬的感染(Peiris et al.，1999)。在共有序列483位上天冬 酰胺對蘇氨酸的替代導致在HA2亞基中糖基化位點的喪失，該位點在所有HA亞型中保守(Wagner et al.，2002)。盡管HA中這些氨基酸改變對于馬病毒對狗的適應性的重要性還有待確定，但是以前已經觀察到與物種間轉移有關的類似的氨基酸改變(Vines et al., 1998;Matrosovich et al., 2000)。在表 19 到 25 中顯不了本發(fā)明的其他流感病毒蛋白質和馬共有序列之間的氨基酸差異。
[0273]最初感染競賽靈提的馬流感病毒的來源仍然是推測性的。在靈.提競賽場的狗舍不位于附近的馬或者馬賽場，提示該靈'觀:和脫落病毒的馬之間的接觸不能充分解釋
2004年在不同州的多處爆發(fā)。接觸馬病毒的潛在來源是對靈.提I喂飼馬肉，所述靈.提的
食物被補充食品加工廠的生肉，食品加工廠提供可能攜帶流感的尸體，包括馬。該感染方式的先例包括H5N1鳥流感病毒向進食受感染的雞尸體的豬和動物園貓科動物的種間傳播(Webster, 1998;Keawcharoen et al., 2004;Kuiken et al.，2004)。盡管這是馬流感向狗的最初引入的似乎合理的途徑，但是它不能解釋最近在不同州的幾千只狗中的多次流感爆發(fā)。我們的實驗接種研究表明在狗的鼻道和口咽中存在病毒，盡管處于適度的滴度。然而，這些結果表明脫落是可能的，并且通過大滴氣溶膠、污染物進行的病毒的狗一狗傳播或者間接粘膜接觸可以在該疾病的動物流行病學中起作用。[0274]全部哺乳動物流感病毒向不相關的哺乳動物物種的種間轉移是罕見的事件。以前的研究已經提供了狗與人甲型流感(H3N2)病毒的暫時感染的有限的血清學或者病毒學證據，但不是血清學和病毒學證據兩者(Nikitin et al., 1972, Kilbourne, etal.，1975; Chang et al.，1976;Houser et al.，1980)。然而，沒有犬科動物宿主中持續(xù)傳播的證據。盡管充分記載了豬流感病毒從豬向人的直接轉移(Dacso et al.，1984; Kimura etal.，1998; Patriarca et al.，1984; Top et al.，1977)，但是沒有豬病毒在人宿主中適應的證據。在該報導中，我們提供了完整馬甲型流感(H3N8)病毒向另一種哺乳動物物種狗的種間傳播。犬病毒HA中獨特的氨基酸替代，以及美國多個州中狗感染的血清學證據，提示該病毒適應了犬科動物宿主。因為狗是人類的主要陪伴動物，所以這些發(fā)現具有公共健康的牽連；狗可能提供新的甲型流感病毒向人類傳播的新的來源。
[0275]
【權利要求】
1.分離的流感病毒，其能夠感染犬科動物，其中所述流感病毒包含編碼具有SEQIDNO: 64、66、68、70、72、74、76或78的任一個中所示的氨基酸序列的多肽或者其功能和/或免疫原性片段的多核苷酸，或者所述多核苷酸編碼與SEQ IDN0:64、66、68、70、72、74、76或78的任一個中所示的氨基酸序列有99%或者更大的序列同一性的多肽。
2.根據權利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒具有H3的HA血清型。
3.根據權利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒包含具有SEQID NO:63、65、67、69、71、73、75或77的任一個中所示的核苷酸序列的多核苷酸，或者所述多核苷酸與SEQ IDNO:63、65、67、69、71、73、75或77的任一個中所示的核苷酸序列有98%或者更大的序列同一性。
4.根據權利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒是稱作canine/Jacksonville/05的病毒隔尚群。
5.根據權利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒被滅活或減毒。
6.根據權利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒在可藥用載體或稀釋劑中提供。
7.分離的多核苷酸，其包含權利要求1的流感病毒的基因組區(qū)段或基因的全部或部分。
8.多核苷酸表達構建體，其包含權利要求7的多核苷酸。
9.權利要求7的多核苷酸編碼的經分離的多肽。
10.包含權利要求1的流感病毒的免疫原的組合物，其中所述免疫原能夠誘導針對流感病毒的免疫應答，所述流感病毒能夠感染犬科動物。
11.根據權利要求10的組合物，其中所述免疫原包含無細胞的完整病毒，或者其部分；病毒多核苷酸；病毒蛋白；病毒多肽或者肽；病毒感染的細胞；基于重組病毒載體的構建體；重排列病毒；或者所述病毒的裸核酸。
12.根據權利要求10的組合物，其中用可藥用載體或稀釋劑配制所述組合物。
13.權利要求10的組合物在制造試劑盒中的用途，所述試劑盒用于在動物中誘導針對能夠感染犬科動物的流感病毒的免疫應答。
14.根據權利要求13的用途，其中所述組合物包含病毒蛋白質、多肽或者肽，或者其功能和/或免疫原性片段，所述病毒蛋白質、多肽或者肽包含SEQ ID N0:64、66、68、70、72、74、76或78任一個中所示的氨基酸序列。
15.根據權利要求13的用途，其中所述免疫應答是保護性免疫應答，其預防或者阻止流感病毒對所述動物的感染。
16.根據權利要求13的用途，其中所述動物是犬科動物。
17.根據權利要求13的用途，其中腸胃外、皮下、腹膜內、肌內、經鼻或者經口施用所述組合物。
18.細胞，其包含: a)能夠感染犬科動物的流感病毒；或 b)多核苷酸，其包含權利要求1的流感病毒的基因組區(qū)段或基因的全部或部分。
19.H3流感病毒抗原用于制造疫苗的用途，所述疫苗保護犬科動物免于H3流感病毒感染。
20.權利要求19的用途，其中所述疫苗包含來自犬科動物流感病毒隔離群canine/Jacksonville/05的一種或多種抗原。
21.權利要求19的用途，其中所述H3流感病毒抗原包含滅活的病毒或活的減毒的病毒。
22.權利要求19的用途，其中腸胃外、皮下、腹膜內、肌內、經鼻或者經口施用所述疫苗。
23.權利要求19的用途，其中所述疫苗與選自博德特氏菌疫苗、腺病毒疫苗和副流感病毒疫苗的至少一種疫苗組合施用。
24.犬科動物流感疫苗，其中該疫苗包含: 治療有效量的至少一種H3流感病毒抗原，和 至少一種可藥用賦形劑。
25.權利要求24的疫苗，其中所述疫苗包含來自犬科動物流感病毒隔離群canine/Jacksonville/05的一種或多種抗原。
26.權利要求24的疫苗，其中所述病毒抗原包含滅活的病毒或活的減毒的病毒。
27.針對能夠感染犬科動物的流感病毒的疫苗，其包含根據權利要求1一 6任一項的犬 科動物流感病毒，或權利要求8的多核苷酸表達構建體，或權利要求9的多肽，或權利要求10 - 12的組合物。
28.權利要求27的疫苗，其中所述疫苗包含至少一種可藥用賦形劑。
29.重組病毒載體，其包含編碼包含SEQID NO:78中所示的氨基酸序列的血凝素(HA)的多核苷酸。
30.權利要求29的重組病毒載體，其中所述多核苷酸包含SEQID NO: 77的核苷酸序列。
31.權利要求29的重組病毒載體，其中所述重組病毒載體包含編碼含有成熟形式的氨基酸序列SEQ ID NO: 78的血凝素(HA)的多核苷酸，其中所述HA蛋白包含在成熟形式氨基酸序列的第82位的絲氨酸、221位的亮氨酸、327位的蘇氨酸，和482位的蘇氨酸。
32.權利要求29到31任一項的重組病毒載體,其中所述病毒載體來自腺病毒、禽痘、皰疹病毒、牛痘病毒、金絲雀痘、昆蟲痘、豬痘、或西尼羅病毒。
33.權利要求29到31任一項的重組病毒載體，其中所述病毒載體是金絲雀痘病毒載體。
34.多核苷酸載體，其包含編碼血凝素(HA)的多核苷酸，所述血凝素(HA)包含成熟形式所示的氨基酸序列SEQ ID NO:78。
35.權利要求34的多核苷酸載體，其中所述多核苷酸包含SEQID NO: 77的核苷酸序列。
36.權利要求34的多核苷酸載體,其中所述多核苷酸載體包含編碼含有成熟形式的氨基酸序列SEQ ID NO: 78的血凝素(HA)的多核苷酸，其中所述HA蛋白包含在所述成熟形式氨基酸序列的第82位的絲氨酸、221位的亮氨酸、327位的蘇氨酸，和482位的蘇氨酸。
37.權利要求34到36任一項的多核苷酸載體,其中所述多核苷酸載體是病毒載體。
38.權利要求37的多核苷酸載體,其中所述病毒載體來自腺病毒、禽痘、皰疫病毒、牛痘病毒、金絲雀痘、昆蟲痘、豬痘、或西尼羅病毒。
39.權利要求37的多核苷酸載體,其中所述病毒載體是金絲雀痘病毒載體。
40.權利要求29到39任一項的重組病毒載體或多核苷酸載體，其中所述HA蛋白還包含成熟形式的氨基酸序列的第491位的賴氨酸。
【文檔編號】C12N7/00GK104017775SQ201310741621
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2006年10月19日 優(yōu)先權日:2005年10月19日
【發(fā)明者】P·C·克勞福德, P·J·吉布斯, E·J·杜博維, R·O·多尼斯, J·卡茨, A·I·克利莫夫, N·P·拉克什曼, M·A·盧姆, D·G·E·古瓦爾特斯, M·W·梅倫坎普, N·J·考克斯, W·L·卡斯爾曼 申請人:佛羅里達大學研究基金公司, 疾病控制和預防中心, 健康公共事業(yè)部部長所代表的美國政府, 康乃爾研究基金會有限公司