專利名稱：：用于犬科動(dòng)物中呼吸系統(tǒng)疾病控制的物質(zhì)和方法用于犬科動(dòng)物中呼吸系統(tǒng)疾病控制的物質(zhì)和方法相關(guān)申請(qǐng)的參考本申請(qǐng)要求2005年4月21日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/673,443的優(yōu)先權(quán)，將該臨時(shí)申請(qǐng)完整(包括任何附圖、表、核酸序列、氨基酸序列和圖)引入本文作為參考。發(fā)明背景"狗舍咳嗽"或者感染性氣管支氣管炎(ITB)是狗中的急性、傳染性呼吸系統(tǒng)感染，其特征主要是咳嗽(Forde,fl/，1998)。犬ITB被認(rèn)為是世界上狗的最普遍的感染性呼吸系統(tǒng)疾病，并且當(dāng)狗在高密度群體環(huán)境如狗舍中居住時(shí)，爆發(fā)可以達(dá)到流行性比例。多數(shù)爆發(fā)是由于直接的狗-狗接觸或者呼吸系統(tǒng)分泌物的氣霧化(FordWtf/，1998)。臨床病征由細(xì)菌和病毒的一種或者組合感染引起，所迷細(xì)菌和病毒可以在上呼吸道和下呼吸道的上皮組織中建群。犬科動(dòng)物副流感病毒(CPiV)和支氣管博德特氏菌(Bo/^ete//"6/widiZs卬riw)細(xì)菌是從受侵襲的狗分離的最常見的生物，但是幾種其他病毒，如犬科動(dòng)物瘟熱病毒(CDV)和犬科動(dòng)物腺病毒-1和-2(CAV-l，CAV-2)，以及纟田菌:i口鏈J求菌(5V尸e/toctfccws5/7.)、7>fl5tew/*e//a柳M加'cof/fl和大腸桿菌(五w/ieWc/i/flco/i)可以影響臨床過程和結(jié)果(Forde,fl/，1998)。盡管在高密度群體中爆發(fā)最有效和快速發(fā)生，具有高的發(fā)病率，但是并發(fā)的呼吸系統(tǒng)感染和死亡是不常見的。盡管可以發(fā)生威脅生命的繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎，但是多數(shù)ITB病例是自身限制性的并且在沒有任何治療下消退(FordWa/，1998)。在1992年7月，推測(cè)為"狗舍咳嗽"的呼吸系統(tǒng)感染在新英格蘭(NewEngland),佛羅里達(dá)(Florida)、西弗吉尼亞(WestVirginia)、威斯康辛(Wisconsin)、堪薩斯(Kansas)、科羅拉多(Colorado)、俄克拉荷馬(Oklahoma)和亞利桑那州(Arizona)的幾個(gè)靈提賽場(chǎng)(greyhoundtrack)變得流行。從獸醫(yī)了解到，多數(shù)受侵襲的狗具有后來消退的輕微咳嗽，但是一打以上的靈提患上了急性出血性肺炎，接著快速死亡(GreyhoundDailyNews,1999)。在1998年下半年到1999年上半年，在美國的竟賽靈提狗舍中發(fā)生了幾次"狗舍咳嗽"爆發(fā)，導(dǎo)致強(qiáng)制關(guān)閉賽場(chǎng)和隔離美國的所有竟賽靈提數(shù)周(GreyhoundDailyNews,1999)。在佛羅里達(dá)的一個(gè)賽場(chǎng)(PalmBeachKennelClub),在一天中幾乎40%的狗群體中記錄到咳嗽(來自WilliamDuggar博士的個(gè)人交流)。類似于1992年的爆發(fā)，該咳嗽在多數(shù)靈提中消退，但是佛羅里達(dá)的10只狗死于"狗舍咳嗽"非特征性的出血性肺炎綜合征(Putnam,1999)。在2003年3月-4月，在美國東部的靈提賽場(chǎng)發(fā)生"狗舍咳嗽"的另一次爆發(fā)。認(rèn)為該爆發(fā)在佛羅里達(dá)的四個(gè)賽場(chǎng)開始，并且因此幾乎三周中止比賽和狗的隔離。在WestPalmBeach的賽場(chǎng)幾乎25%的狗受到侵襲，而St.Petersburg的DerbyLane中1400條狗幾乎50%發(fā)生咳嗽。再一次，多數(shù)狗恢復(fù)，但是一些狗死于呼吸系統(tǒng)感染。僅在DerbyLane的呼吸爆發(fā)的估計(jì)的經(jīng)濟(jì)影響為2百萬美元。沒有公開的報(bào)導(dǎo)記載在1992、1998-1999或2003年在竟賽靈提狗舍中"狗舍咳嗽"流行的病因或者臨床病理。假定該感染是由于CPiV和/或支氣管博德特氏菌狗舍咳嗽的兩種最常見的病因。未證實(shí)的交流，如網(wǎng)站已經(jīng)將在一些咳嗽的狗中報(bào)導(dǎo)的致命的出血性肺炎規(guī)因于p-溶血性馬鏈球菌獸痙亞種(S/,印toc0cc""拜'subspecieswoe/wVfe附/cw51)，并且將該綜合征稱作"犬鏈球菌中毒性休克"。病毒從一個(gè)宿主物種傳染到另一個(gè)是流感病毒的生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)的關(guān)鍵特征(Webster,1998)。流感病毒的物種間傳染的兩個(gè)基本機(jī)制是可能的(Webster"W.，1992;LipatovW"/.，2004)。一種是基本上未變的病毒從一個(gè)物種直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種。該機(jī)制的實(shí)例包括最近的家禽流感病毒的H5N1亞型對(duì)人的感染(SubbaraoWfl/.，1998;PeirisCfl/.，2004;GuanWfl/.，2004)和可能地1918年的大流行，稱作西班牙流感(ReidW2004)。第二種機(jī)制是流感病毒基因組的區(qū)段化性質(zhì)的結(jié)果。用來自不同物種的病毒共感染宿主可以導(dǎo)致區(qū)段化病毒基因的重排列，和產(chǎn)生能夠感染其他物種的重組體。例如，鳥類和人流感病毒之間基因重排列產(chǎn)生的新的病毒在1957和1968年導(dǎo)致人類流感大流行(WebsterC"/.，1992;Lipatov"2004;KawaokaCa/"1989)。未改變的流感病毒從自然宿主物種向不同物種的多數(shù)直接傳播是最終事件，因?yàn)樵谛挛锓N的個(gè)體之間的持續(xù)傳播不能發(fā)生。多種病毒-宿主相互作用是復(fù)制和水平傳播所必須的并且為流感病毒在新的宿主中的永續(xù)性提供了強(qiáng)大的屏障(WebbyWfl/.，2004)。因此，流感病毒的新的宿主特異性譜系的建立是不常見的并且僅僅在馴養(yǎng)的家禽、豬、馬和人類中發(fā)生(Webster"fl/"1992;Lipatov"fl/"2004)。因?yàn)榱鞲胁《靖腥镜膰?yán)重性質(zhì)，所以仍然需要診斷、預(yù)防和治療流感病毒感染的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動(dòng)物和在犬科動(dòng)物中弓1起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)針對(duì)本發(fā)明的流感病毒的免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于鑒定本發(fā)明的病毒和和診斷本發(fā)明的病毒對(duì)動(dòng)物的感染的組合物和方法。附圖簡(jiǎn)述本專利或者申請(qǐng)文件含有至少一副彩圖。專利局將根據(jù)請(qǐng)求和在支付了必要的費(fèi)用后提供具有彩圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公布的拷貝。圖1A-1B顯示了血凝素基因之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。圖1A顯示了來自代表性犬、人、鳥類、豬和馬分離群，包括作為外類群的A/Budgerigar/Hokkaido/1/77(H4)的HA基因樹。圖IB顯示了4吏用A/Duck/Ukraine/63(H3)作為外類群，犬流感病毒HA基因與同一時(shí)期的和較老的馬HA基因的樹。通過近鄰連接方法從核苦,列推論出系統(tǒng)樹并且顯示了290%的自展分析值。條形表示核苷酸改變數(shù)目/水平樹枝的單位長(zhǎng)度。圖2A-2B顯示了在肺中流感H3抗原的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。用針對(duì)HA血凝素的小鼠單克隆抗體檢測(cè)肺組織切片并通過免疫過氧化物酶反應(yīng)檢測(cè)結(jié)合(褐色沉淀)。圖2A顯示了來自具有自發(fā)疾病的靈提的支氣管上皮。檢測(cè)支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和呼吸道腔和肺泡腔中巨噬細(xì)胞中的病毒H3抗原。圖2B顯示了用A/canine/Florida/43/04(H3N8)接種后5天，來自狗的支氣管上皮。在支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到病毒H3抗原。比例尺，66fim。圖3顯示了在死于與流感病毒感染有關(guān)的出血性肺炎的靈提支氣管中特征性組織學(xué)改變。對(duì)組織用H&E染色。上圖具有纖毛上皮細(xì)胞、粘液細(xì)胞和基細(xì)胞的正常支氣管。下圖來自患有自發(fā)性流感的靈提的支氣管。支氣管纖毛上皮細(xì)胞有壞死和糜爛。比例尺，100pm。圖4A-4B顯示了在H3血凝素基因中的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。圖4A顯示了犬科動(dòng)物流感病毒HA基因與同一時(shí)期的和較老的馬HA基因的系統(tǒng)樹。圖4B顯示了犬科動(dòng)物流感病毒HA蛋白質(zhì)與同一時(shí)期的和較老的馬HA基因的系統(tǒng)樹。通過近鄰連接方法從基因或者M(jìn)^列推論出系統(tǒng)樹并且顯示了280%的自展分析值。條形表示氨基酸改變數(shù)目/水平樹枝的單位長(zhǎng)度。圖5顯示了在死于與流感病毒感染有關(guān)的肺炎的狗的肺中支氣管和支氣管腺的上皮細(xì)胞中流感病毒H3蛋白質(zhì)。上圖支氣管中纖毛上皮細(xì)胞的糜爛。組織用H&E染色。下圖在支氣管(左)和支氣管腺(右)上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中流感病毒H3蛋白質(zhì)。將組織用針對(duì)流感病毒H3的單克隆抗體染色，通過免疫過氧化物酶反應(yīng)檢測(cè)(褐色沉淀)并用蘇木精復(fù)染。圖6A-6D顯示了從擴(kuò)增10倍連續(xù)體外稀釋的轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)得到的H3和基質(zhì)基因(圖6A和圖6B)的擴(kuò)增圖。通過起始RNA濃度的對(duì)數(shù)值對(duì)從每次稀釋得到的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)作圖，構(gòu)造H3和基質(zhì)基因(圖6C和圖6D)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7顯示用10倍連續(xù)稀釋的病毒原種(包括A/Wyoming/3/2003和A/canine/FL/242/2003)測(cè)試DirectigenFluA的靈敏性。紫色三角形指示陽性結(jié)果。序列簡(jiǎn)述SEQIDNO:1是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。SEQIDNO:2是SEQIDNO:1編碼的氨基,列。SEQIDNO:3是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB1蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。SEQIDNO:4是SEQIDNO:3編碼的氨基,列。SEQIDNO:5是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。SEQIDNO:6是SEQIDNO:5編碼的氨基^^列。SEQIDNO:7是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。SEQIDNO:8是SEQIDNO:7編碼的氨基齡列。SEQIDNO:9是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。SEQIDNO:10是SEQIDNO:9編碼的氨基斷列。SEQIDNO:11是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷^列。SEQIDNO:12是SEQIDNO:11編碼的^J^,列。SEQIDNO:13是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷^^列。SEQIDNO:14是SEQIDNO:13編碼的氨基,列。SEQIDNO:15是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。SEQIDNO:16是SEQIDNO:15編碼的氨基齡列。SEQIDNO:17是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核香酸序列。SEQIDNO:18是SEQIDNO:17編碼的氨基齡列。SEQIDNO:19是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB1蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核普酸序列。SEQIDNO:20是SEQIDNO:19編碼的氨基醋列。SEQIDNO:21是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。SEQIDNO:22是SEQIDNO:21編碼的氨基,列。SEQIDNO:23是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。SEQIDNO:24是SEQIDNO:23編碼的氨基,列。SEQIDNO:25是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苦酸序列。SEQIDNO:26是SEQIDNO:25編碼的氨基齡列。SEQIDNO:27是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核普酸序列。SEQIDNO:28是SEQIDNO:27編碼的^J^齡列。SEQIDNO:29是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核普酸序列。SEQIDNO:30是SEQIDNO:29編碼的氨基斷列。SEQIDNO:31是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。SEQIDNO:32是SEQIDNO:31編碼的氨基絲列。SEQIDNO:33是SEQIDNO:16中顯示的HA蛋白質(zhì)的成熟形式，其中已經(jīng)除去了N-末端16個(gè)氨基酸的信號(hào)序列。SEQIDNO:34是SEQIDNO:32中顯示的HA蛋白質(zhì)的成熟形式，其中已經(jīng)除去了N-末端16個(gè)氨基酸的信號(hào)序列。SEQIDNO:35是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:36是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:37是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:38是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:39是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:40是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:41是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:42是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:43是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:44是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:45是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:46是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:47是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苦酸序列。SEQIDNO:48是SEQIDNO:47編碼的氨基瞎列。SEQIDNO:49是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PBl蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:50是SEQIDNO:49編碼的氨基,列。SEQIDNO:51是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:52是SEQIDNO:51編碼的氨基齡列。SEQIDNO:53是可以根椐本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:54是SEQIDNO:53編碼的^J^麟列。SEQIDNO:55是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:56是SEQIDNO:55編碼的^J^,列。SEQIDNO:57是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:58是SEQIDNO:57編碼的氨基齡列。SEQIDNO:59是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核普酸序列。SEQIDNO:60是SEQIDNO:59編碼的氨基斷列。SEQIDNO:61是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:62是SEQIDNO:61編碼的^J^齡列。SEQIDNO:63是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:64是SEQIDNO:63編碼的氨基斷列。SEQIDNO:65是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PM蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:66是SEQIDNO:65編碼的氨基醋列。SEQIDNO:67是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:68是SEQIDNO:67編碼的^J^瞎列。SEQIDNO:69是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonvme/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:70是SEQIDNO:69編碼的氨基瞎列。SEQIDNO:71是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核普酸序列。SEQIDNO:72是SEQIDNO:71編碼的氨基財(cái)列。SEQIDNO:73是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:74是SEQIDNO:73編碼的^i^斷列。SEQIDNO:75是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jaeksonville/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:76是SEQIDNO:75編碼的氨基餅列。SEQIDNO:77是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。SEQIDNO:78是SEQIDNO:77編碼的氨基斷列。SEQIDNO:79是可以根椐本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:80是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核香酸。SEQIDNO:81是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:82是可以根椐本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:83是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:84是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:85是可以根椐本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:86是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:87是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。SEQIDNO:88是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動(dòng)物和引起呼吸系統(tǒng)疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的流感病毒包含編碼具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或者其功能和/或免疫原性片段或者變體的多核苷酸。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述多核苦酸包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中任一個(gè)所示的核苷酸序列，或者其片段或者變體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的流感病毒是亞型H3。根據(jù)本文描述的方法，可以從受感染的狗分離病毒并在細(xì)胞或者蛋中培養(yǎng)。在示例的實(shí)施方案中，流感病毒是甲型流感病毒。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的流感病毒的一種或多種基因或者基因組區(qū)段的全部或者部分的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含流感血凝素(HA)基因、神經(jīng)氨酸酶(NA)基因、核蛋白(NP)基因、基質(zhì)蛋白(MA或者M(jìn))基因、聚合酶堿性(PB)蛋白基因、聚合酶酸性(PA)蛋白基因、非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白基因，或者這些基因任一種的功能片段或者變體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含血凝素(HA)基因或者其功能片段或者變體。在另一實(shí)施方案中，HA基因編碼血凝素蛋白質(zhì)，其與馬H3共有序列的氨基酸序列相比，具有如下一個(gè)或多個(gè)83位的絲氨酸；222位的亮氨酸；328位的蘇氨酸；和/或483位的蘇氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，HA基因編碼具有SEQIDNO:16、32、62或78中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或者變體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，HA基因包含SEQIDNO:15、31、61或77中所示的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基^列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或者變體。在特定實(shí)施方案中，編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸分另'J包含SEQID隱1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中所示的核苷酸序列，或者編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的4壬一項(xiàng)的功能和/或免疫原性片段或者變體的序列。從而，本發(fā)明涉及多核苷*列，其包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一項(xiàng)中所示的核苷酸序列，或者SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的4壬一項(xiàng)的片段或者變體，包括簡(jiǎn)并變體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以包含SEQIDNO:3的核苷酸1-2271;SEQIDNO:5的核苷酸1-2148;SEQIDNO:7的核苷酸1-657;SEQIDNO:9的核苷酸1-1494;SEQIDNO:11的核苷酸1-1410;SEQIDNO:13的核苷酸1-756;SEQIDNO:15的核苷酸1-1695;SEQIDNO:19的核苷酸1-2271;SEQIDNO:21的核苦酸1-2148;SEQIDNO:23的核苷酸1-657;SEQIDNO:25的核苷酸1-1494;SEQIDNO:29的核苦酸1-756;SEQIDNO:31的核苷酸1-1695;SEQIDNO:47的核普酸1-2277;SEQIDNO:49的核苷酸1-2271;SEQIDNO:51的核苷酸1-2148;SEQIDNO:53的核苷酸l-6卯；SEQIDNO:55的核苷酸1-1494;SEQIDNO:57的核苦酸1-1410;SEQIDNO:59的核苦酸1-756;SEQIDNO:61的核苷酸1-1695;SEQIDNO:63的核苷酸1-2277;SEQIDNO:65的核苷酸1-2271;SEQIDNO:67的核苦酸1-2148;SEQIDNO:69的核普酸l-6卯；SEQIDNO:71的核苷酸1-1494;SEQIDNO:73的核苷酸1-1410;SEQIDNO:75的核苦酸1-756;和SEQIDNO:77的核苷酸1-1695。在本發(fā)明的范圍內(nèi)預(yù)期的病毒多核苦酸和多肽序列的核普酸和氨基酸序列已經(jīng)保存在GenBank，檢索號(hào)為DQ124147到DQ124161和DQ124190,將其公開引入本文作為參考。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的流感病毒的多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及主題多肽的功能和/或免疫原性片段和變體。預(yù)期的多肽包括本發(fā)明的流感病毒的HA蛋白、NA蛋白、NS蛋白、核蛋白、聚合酶堿性蛋白、聚合酶酸性蛋白，和基質(zhì)蛋白。在一個(gè)示例的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一項(xiàng)所示的氨基酸序列，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體包含多核苷酸序列，該多核苷^列編碼包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。在特定實(shí)施方案中，編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸分別包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列，或者編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)的功能和/或免疫原性片段或變體的序列。從而，本發(fā)明涉及包含多核苦酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，所述多核苷酸序列包含SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列，或者SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77任一個(gè)的片段或者變體，包括簡(jiǎn)并變體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體提供了本發(fā)明的有效連接的多核苷酸的過表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體一般包括在預(yù)計(jì)的宿主細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)元件，在所迷宿主細(xì)胞中將表達(dá)該表達(dá)構(gòu)建體。從而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選捧用于例如人類宿主細(xì)胞、哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、昆蟲宿主細(xì)胞、酵母宿主細(xì)胞、細(xì)菌宿主細(xì)胞、和;f直物宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)元件是在犬科動(dòng)物細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)元件。調(diào)節(jié)元件包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯終止序列、增強(qiáng)子、和多聚腺苷酸化元件。如本文所用的，術(shù)語"表達(dá)構(gòu)建體"指核酸序列的組合，其提供了有效連接的核,列的轉(zhuǎn)錄。如本文所用的，術(shù)語"有效連接"指所述的元件的并列，其中所述元件處于允許它們以它們預(yù)期的方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。通常，有效連接的元件為鄰接的關(guān)系。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以包含有效連接到編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列的啟動(dòng)子序列。使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以將啟動(dòng)子摻入多核苷酸中。在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中可以使用啟動(dòng)子的多個(gè)拷貝或者多個(gè)啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子與表達(dá)構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離可以與它與天然遺傳環(huán)境中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離相同。在該距離中允許一定的變化而不實(shí)質(zhì)性降低啟動(dòng)子活性。在表達(dá)構(gòu)建體中通常包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。優(yōu)選地，與本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體結(jié)合的啟動(dòng)子提供了本發(fā)明的有效連接的多核苷酸的過表達(dá)。與本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體用于真核細(xì)胞中的啟動(dòng)子可以是病毒或者細(xì)菌來源的。病毒啟動(dòng)子包括，但不限于，巨細(xì)胞病毒(CMV)基因啟動(dòng)子、SV40早期或者晚期啟動(dòng)子，或者勞斯肉瘤病毒(RSV)基因啟動(dòng)子。細(xì)胞來源的啟動(dòng)子包括，但不限于，結(jié)蛋白基因啟動(dòng)子和肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子。適于與本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體用于酵母細(xì)胞的啟動(dòng)子包括，但不限于，3-磷酸甘油酸酯激酶啟動(dòng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、醇脫氫酶-2啟動(dòng)子，和己糖激酶啟動(dòng)子。如果在植物細(xì)胞中提供或者向植物細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體，那么可以使用才直物病毒啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S(包括增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子(見，例如，美國專利號(hào)5,106,739和An，1997))或者CaMV19S啟動(dòng)子。可以用于植物中表達(dá)構(gòu)建體的其他啟動(dòng)子包括，例如，prolifera啟動(dòng)子、Ap3啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、才艮癌農(nóng)桿菌(A加柳e/acZew力的T-DNAl'-或2'-啟動(dòng)子、多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子、來自牽牛花的查耳酮合酶A(CHS-A)啟動(dòng)子、煙草PR-la啟動(dòng)子、泛蛋白啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、alcA基因啟動(dòng)子、pin2啟動(dòng)子(XuCfl/:，1993)、玉米WipI啟動(dòng)子、玉米trpA基因啟動(dòng)子(美國專利號(hào)5,625,136)、玉米CDPK基因啟動(dòng)子、和RUBISCOSSU啟動(dòng)子(美國專利號(hào)5,034,322)。根特異的啟動(dòng)子，如美國專利號(hào)6,455,760或美國專利號(hào)6,696,623或公布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0040078841;20040067506;20040019934;20030177536;20030084486;或20040123349中描述的任一種啟動(dòng)子序列可以用于本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體。組成性啟動(dòng)子(如CaMV、泛蛋白、肌動(dòng)蛋白或者NOS啟動(dòng)子)、發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子和^l秀導(dǎo)型啟動(dòng)子(如可以通過熱、光、激素或者化學(xué)品-誇導(dǎo)的那些啟動(dòng)子)也預(yù)期用于本發(fā)明的多核普酸表達(dá)構(gòu)建體。也可以使用組織特異性啟動(dòng)子，例如，果實(shí)特異性啟動(dòng)子，如番茄的E8啟動(dòng)子(檢索號(hào)AF515784;Good"/.(1994))。也可以使用種子特異性啟動(dòng)子，如來自P-菜豆蛋白基因(例如，菜豆的)或者大豆球蛋白基因(例如，大豆的)的啟動(dòng)子，和其他啟動(dòng)子。對(duì)于在原核系統(tǒng)中表達(dá)，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以包含啟動(dòng)子，如堿性磷酸酶啟動(dòng)予、色氨酸(trp)啟動(dòng)子、XPi^啟動(dòng)子、p-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子、乳糖啟動(dòng)子、phoA啟動(dòng)子、T3啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、或者tac啟動(dòng)子(deBoere/fl/"1983)。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以任選含有轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯終止序列、編碼信號(hào)肽的序列，和/或增強(qiáng)子元件。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可以通常從真核生物或者病毒基因序列的3'非翻譯區(qū)得到。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于編碼區(qū)的下游以提供有效終止。信號(hào)肽序列是通常存在于蛋白質(zhì)的氨基末端的短M列，其負(fù)責(zé)有效連接的成熟多肽重定位到多種不同的翻譯后細(xì)胞目的地，從特定細(xì)胞器隔室到蛋白質(zhì)作用部位和細(xì)胞外環(huán)境。通過使用有效連接的明的多肽。典型的增強(qiáng)子是順式作用元件，其增加基因轉(zhuǎn)錄并且可以包括在表達(dá)構(gòu)建體中。典型的增強(qiáng)子元件是本領(lǐng)域中已知的，并且包括，但不限于，CaMV35S增強(qiáng)子元件、巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件，和SV40增強(qiáng)子元件。增強(qiáng)基因表達(dá)的內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)子元件也是本領(lǐng)域中已知的。這些元件必須存在于轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)并且是方向依賴性的。指導(dǎo)從表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的mRNA的多聚腺苷酸化的DNA序列也可以包括在表達(dá)構(gòu)建體中，并且包括，但不限于，章魚堿合酶或者胭脂氨酸合表達(dá)構(gòu)建體還可以包括一種或多種顯性選擇標(biāo)記基因，包括，例如，編碼抗生素抗性和/或除草劑抗性用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因?？股乜剐曰蚩梢蕴峁?duì)一種或多種下面的抗生素的抗性潮霉素、卡那霉素、博來霉素、G418、鏈霉素、巴龍霉素、新霉素和大觀霉素。通過新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)可以提供卡那霉素抗性。除草劑抗性基因可以提供對(duì)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶或者草甘膦的抗性。用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化篩選的其他標(biāo)記包括，但不限于，編碼p-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、卩-半乳糖苷酶、螢光素酶、胭脂氨酸合成酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)或者增強(qiáng)的GFP的基因(YangWfl/1，1996)。酸載體?？梢栽诒景l(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或者多核苷酸的5，和3，末端包括獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)以允許插入到多核苷酸載體中。如本文所用的，術(shù)語"載體，，指任一遺傳元件，包括例如，質(zhì)粒、粘粒、染色體、噬菌體、病毒等等，其當(dāng)與適當(dāng)?shù)目刂圃Y(jié)合時(shí)能夠復(fù)制并且可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移多核苷酸序列。載體含有允許載體在所選的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。許多載體可以用于表達(dá)和/或克隆，并且包括，^旦不限于，pBR322、pUC系列、M13系列、pGEM系列、和pBLUESCRlPT載體(Stratagene，LaJolla,CAandPromega，Madison,WI)。本發(fā)明還涉及寡核普酸探針和引物，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，其可以與本發(fā)明多核苷酸的編碼或非編碼序列雜交。本發(fā)明的寡核苦酸4果針可以用于檢測(cè)流感病毒核酸序列的方法中。本發(fā)明的寡核苷酸引物可以用于PCR方法和涉及核酸擴(kuò)增的其他方法中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的探針或引物可以與本發(fā)明的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交。本發(fā)明的探針和引物可以任選包含檢測(cè)標(biāo)記或者報(bào)道分子，如熒光分子、酶、放射性部分，等等。本發(fā)明的揮:針和引物對(duì)于使用它們的方法或測(cè)定法可以是任何合適的長(zhǎng)度。通常，本發(fā)明的探針和引物將長(zhǎng)為10到500個(gè)或者更多核苷酸。在本發(fā)明的范圍內(nèi)預(yù)期長(zhǎng)為IO到20、21到30、31到40、41到50、51到60、61到70、71到80、81到卯、91到100或101個(gè)或更多核苦酸的揮:針和引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，4果針和引物長(zhǎng)為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸的任一個(gè)。本發(fā)明的探針和引物可以與所述多核苷酸序列具有完全(100%)的核苷酸序列同一性，或者序列同一性可以小于100°/。。例如，4采針或引物和序列之間的序列同一性可以為99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%或者任一其他百分?jǐn)?shù)序列同一性，只要該探針或引物可以在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的多核苦酸的核苷酸序列雜交。本發(fā)明的示例的探針和引物包括具有SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45和SEQIDNO:46的任一個(gè)中所示的核苷i^列，或者SEQIDNO:35-46的任一個(gè)的功能片段或者變體的那些探針和引物。如本文所用的，術(shù)語"核酸"、"多核苦酸"和"寡核苷酸，，指單鏈或者雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者混合的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，將包括天然核苷酸的已知的類似物，其可以以類似亍天然存在的核苷酸的方式發(fā)揮功能。多核苦酸序列包括可以轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA鏈序列和可以翻譯成蛋白質(zhì)的RNA鏈。本發(fā)明的任一核酸、多核苷酸或者寡核苷酸的互補(bǔ)序列也預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。多核苷酸序列還包括全長(zhǎng)序列以及衍生自全長(zhǎng)序列的較短的序列。本發(fā)明還包括序列與本文公開的多核苷酸互補(bǔ)的那些多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以以純化或者分離的形式提供。因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，多種不同的多核苷酸序列可以編碼本發(fā)明的多肽。在Lewin(1985)中描述了顯示所有可能的三聯(lián)體密碼子(并且其中U也代表T)和每個(gè)密碼子編碼的氨基酸的表格。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全會(huì)^月匕編碼與序列。這些簡(jiǎn)并變體和備選多核苷*列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文使用的，對(duì)"基本上相同"的序列的引用指編碼氨基酸替代、缺失、添加或者插入的序列，其不實(shí)質(zhì)上改變本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的功能和/或免疫原性活性。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明的多核苦酸的變體。變體序列包括那些序列，其中該序列的一個(gè)或多個(gè)核苦酸已經(jīng)被替代、缺失和/或插入。可以替代DNA的天然核苷酸的核苷酸具有堿基部分，其可以包括，但不限于，次黃苷、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、次黃嘌呤、1-曱基鳥噤呤、5-曱基胞嘧咬，和三苯甲基化堿基。序列中核苷酸的糖部分還可以是經(jīng)修飾的并且包括，但不限于，阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，可以用乙酰基、甲基和/或硫代基團(tuán)修飾核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧咬堿基。使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以制備和測(cè)試含有核苷酸替代、缺失、和/或插入的序列。的氨基酸不同的氨基酸替代。例如，非天然氨基酸可以替代多肽的氨基酸，只要具有替代氨基酸的多肽基本上保留與沒有替代的氨基酸的多肽相同的功能活性。非天然氨基酸的實(shí)例包括，但不限于，鳥氨酸、瓜氨酸、羥脯氨酸、高絲氨酸、苯基甘氨酸、?；撬?、碘代酪氨酸、2，4-二氨基丁酸、a-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、Y-氨基丁酸、e-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正纈氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、T-丁基甘氨酸、T-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、p-丙氨酸、氟-氨基酸、設(shè)計(jì)者氨基酸，如p-曱基^J^酸、C-甲基氨基酸、N-甲基M酸、和一般的氨基酸類似物。非天然氨基酸還包括具有衍生的側(cè)基的M酸。此夕卜，蛋白質(zhì)中的任一氨基酸可以為D(右旋)型或者L(左旋)型。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括本發(fā)明多肽的蛋白質(zhì)序列的等位基因變體。氨基酸可以一般以下面的類別分類非極性的、不帶電的極性的、堿性的和酸性的。保守替代(其中具有一個(gè)類別氨基酸的本發(fā)明的多肽用相同類別的另一tt酸替代)落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要具有替代的多肽仍然保留與不具有該替代的多肽基本上相同的功能活性。編碼序列中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代的多肽的多核苷酸包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。下面的表11提供了屬于每個(gè)類別的氨基酸的實(shí)例列表。在表12中定義了單字母氨基酸縮寫。使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以產(chǎn)生本發(fā)明的流感病毒多肽的片段和變體并且使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)試功能或者免疫原性的存在。例如，為了測(cè)試本發(fā)明的神經(jīng)氨酸酶多肽的片段和/或變體，可以測(cè)定酶促活性。從而，普通技術(shù)人員可以容易制備和測(cè)試本發(fā)明多肽的片段和變體，并確定該片段或變體是否相對(duì)于全長(zhǎng)或者非變異多肽保持活性。本發(fā)明范圍內(nèi)預(yù)期的多核苷酸和多肽也可以按照與本文特別示例的本發(fā)明的那些序列的更具體的同一性和/或相似性范圍定義。序列同一性將通常大于60%，優(yōu)選大于75%,更優(yōu)選大于80%,甚至更優(yōu)選大于90%,并且可以大于95%。與本文示例的序列相比，序列的同一性和/或相似性可以為49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。除非另外指出，如本文使用的，兩個(gè)序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用Karlin和Altschul(1990)的，如在Karlin和Altschul(1993)中改進(jìn)的算法確定。這種算法整合到AltschulW(19卯)的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序，得分=100，字長(zhǎng)=12進(jìn)行BLAST搜索，以得到具有所希望的百分比序列同一性的序列。為了得到用于比較目的的缺口比對(duì)，可以使用如Altschul"a/.(1997)的GappedBLAST。當(dāng)利用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見NCBI/NIH網(wǎng)站。本發(fā)明還預(yù)期這樣的多核苷酸分子，其具有與本文示例的多核苦^列足夠同源的序列，從而允許與該序列在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格條件和標(biāo)準(zhǔn)方法(ManiatisCfl/,，1982)下雜交。如本文使用的，雜交的"嚴(yán)格"條件指這樣的條件，其中通常在6xSSPE,5xDenhardt溶液，0.1。/。SDS，0.1mg/ml變性DNA中低于DNA雜交分子的解鏈溫度(Tm)20-25。C下過夜進(jìn)行。通過下面的公式描述解鏈溫度Tm(Beltz"a/.，1983):Tm=81.5C+16.6Log[Na++0."(%G+C)-0.61(%曱酰胺)-600/雙鏈體長(zhǎng)度(以堿基對(duì)計(jì))。通常如下進(jìn)行洗滌(1)在lxSSPE，0.1%SDS中室溫下洗滌兩次，每次15分鐘(低嚴(yán)格洗滌)。(2)在0.2xSSPE，0.1%SDS中Tm-20。C下洗滌一次15分鐘(中等嚴(yán)格洗條)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的流感病毒的基因編碼的病毒蛋白質(zhì)和肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒蛋白是成熟HA蛋白。在特定實(shí)施方案中，成熟的HA蛋白包含下面的一個(gè)或多個(gè)82位的絲氨酸；221位的亮氨酸；327位的蘇氨酸；和/或482位的蘇氨酸。在示例的實(shí)施方案中，成熟的HA蛋白質(zhì)具有SEQIDNO:33或SEQIDNO:34中所示的氨基酸序列，或者SEQIDNO:33或SEQIDNO:34的功能和/或免疫原性片段或變體。在另一實(shí)施方案中，病毒蛋白是NA蛋白、NS蛋白、PB蛋白、PA蛋白、或者M(jìn)A蛋白。本發(fā)明的病毒蛋白質(zhì)和肽可以用于產(chǎn)生特異結(jié)合所述蛋白質(zhì)或肽的抗體。本發(fā)明的病毒蛋白質(zhì)和肽還可以用作疫苗組合物中的免疫原。本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答的組合物和方法，所述流感病毒能眵感染易感的宿主動(dòng)物和引起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明可以用于在易感的宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)任一亞型的流感病毒的免疫應(yīng)答。例如，流感病毒可以是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15或H16的HA亞型，和N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8氛N9的NA亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，HA亞型是H3或者H5。在另一實(shí)施方案中，NA亞型是N7或者N8。在特定實(shí)施方案中，誘導(dǎo)針對(duì)亞型H3N8的流感病毒的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物是犬科動(dòng)物。犬科動(dòng)物包括野生的、動(dòng)物園的和馴養(yǎng)的犬科動(dòng)物，如狼、郊狼和狐貍。犬科動(dòng)物還包括狗，尤其馴養(yǎng)的狗，如純種和/或雜種陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、獵狗、守衛(wèi)狗、警犬、賽犬和/或?qū)嶒?yàn)用狗。在特定實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物是馴養(yǎng)的狗，如靈提。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物，其足以誘導(dǎo)針對(duì)本發(fā)明的流感病毒的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以是體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。在特定實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答，其能夠在免疫后在一定的時(shí)間段內(nèi)預(yù)防或者減小受免疫的宿主動(dòng)物中的病毒感染。從而，本發(fā)明還涉及疫苗組合物和方法，其為接種的動(dòng)物提供了針對(duì)本發(fā)明病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答。如本文所用的，本發(fā)明的疫苗或者免疫原性組合物可以包含無細(xì)胞的完整病毒，包括減毒的或者失活的病毒，或者病毒的部分，包括亞病毒顆粒(包括"分離疫苗"，其中處理病毒體以除去一些或者全部病毒脂類)、病毒蛋白質(zhì)(包括個(gè)體蛋白質(zhì)和多種蛋白質(zhì)的大分子復(fù)合體)、多肽、和肽，以及病毒感染的細(xì)胞系，或者這些任一種的組合。包含病毒感染的細(xì)胞系的疫苗或者免疫原性組合物可以包含多種細(xì)胞系，每種用不同的病毒毒林感染。本發(fā)明的疫苗或者免疫原性組合物還包含重組的基于病毒載體的構(gòu)建體，其可以包含例如編碼本發(fā)明的流感病毒的HA蛋白、NA蛋白、核蛋白、聚合酶堿性蛋白、聚合酶酸性蛋白，和/或基質(zhì)蛋白的基因。可以用于制備重組載體/病毒構(gòu)建體的任何合適的病毒栽體預(yù)期用于本發(fā)明。例如，來自腺病毒、禽痘、皰疹病毒、牛痘、金絲雀痘、昆蟲痘、豬痘、西尼羅病毒和本領(lǐng)域已知的其他病毒的病毒載體可以用于本發(fā)明的組合物和方法中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)構(gòu)建編碼和表達(dá)組分的重組多核苷酸載體。此外，本文描述的多種疫苗組合物可以單獨(dú)使用和相互組合使用。例如，動(dòng)物的初次免疫可以使用重組的基于載體的構(gòu)建體，其具有單個(gè)或者多個(gè)毒林組分，然后用包含失活病毒或者失活的病毒感染的細(xì)胞系的疫苗組合物二次加強(qiáng)。使用本發(fā)明的疫苗組合物的其他免疫方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的并且預(yù)計(jì)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及重排列病毒，其包含本發(fā)明的流感病毒的至少一種基因或者基因組區(qū)段和來自本發(fā)明的不同的流感病毒或者來自不同于本發(fā)明病毒的流感病毒的病毒基因或者基因組區(qū)段的剩余部分。通過本發(fā)明的供體流感病毒的核酸與受體流感病毒的核酸的遺傳重排列，然后選擇包含供體病毒的核酸的重排列病毒，可以產(chǎn)生重排列病毒。產(chǎn)生和分離重排列病毒的方法是本領(lǐng)域中公知的(Fields"fl/.，1996)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重排列病毒包含人類、鳥類、豬或者馬流感病毒的基因或者基因組區(qū)段。本發(fā)明的重排列病毒可以包括來自供體和受體流感病毒的核酸的任一組合，只要重排列病毒包含來自本發(fā)明的供體流感病毒的至少一個(gè)基因或者基因組區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方案中，受體流感病毒可以是馬流感病毒。病毒蛋白質(zhì)的天然的、重組的或者合成的多肽，和其肽片段也可以用作根據(jù)本發(fā)明方法的疫苗組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，來自多種毒林的病毒多肽可以組合在疫苗組合物中并且用于接種宿主動(dòng)物。例如，基于來自至少兩種不同毒林的本發(fā)明的流感病毒的病毒HA蛋白質(zhì)的多肽可以組合在疫苗中。該多肽可以與一種毒林同源或者可以包含"雜合"或"嵌合，，多肽，其氨基酸序列來自結(jié)合或者連接來自至少兩種不同毒株的多肽。制備病毒多肽的步驟是本領(lǐng)域公知的。例如，使用固相合成方法(Merrifield，1963)可以合成病毒多肽和肽。使用重組DNA技術(shù)也可以產(chǎn)生病毒多肽和肽，其中編碼病毒蛋白質(zhì)或者肽的多核苷酸分子在宿主細(xì)胞，如細(xì)菌、酵母或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的疫苗組合物還包括棵核酸組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸可以包含編碼本發(fā)明的流感病毒的HA和/或NA蛋白質(zhì)的核苷酸序列。核酸接種的方法是本領(lǐng)域中已知的并且描述于例如美國專利號(hào)6,063,385和6，472，375。核酸可以為質(zhì)?；蛘呋虮磉_(dá)盒的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，將核酸包裹在脂質(zhì)體中提供，將所述脂質(zhì)體施用于動(dòng)物。可以為根據(jù)本發(fā)明使用的疫苗組合物和免疫原，如多肽和核酸提供可藥用載體或者稀釋劑。可以根據(jù)制備藥學(xué)上有用的組合物的已知方法配制用于本發(fā)明的化合物和組合物。在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和容易得到的許多來源中詳細(xì)描述了制劑。例如，E.W.Martin,EastonPennsylvania,MackPublishingCompany,19thed.，1995的i柳/wgt柳，sJPAar附flcewrica/5WeMce描述了可以用于本發(fā)明的制劑。通常，將配制本發(fā)明的組合物使得有效量的免疫原與合適的載體組合以便促進(jìn)組合物的有效施用。用于本發(fā)明方法中的組合物還可以為多種形式。這些包括例如，固體、半固體和液體劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液劑或混懸劑、栓劑、注射液和灌注液，和噴霧劑。優(yōu)選的形式取決于預(yù)期的施用方式和治療應(yīng)用。組合物還優(yōu)選包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的可藥用載體和稀釋劑。用于本發(fā)明肽模擬物的載體或稀釋劑的實(shí)例包括，但不限于，水、鹽水、油，包括礦物油、乙醇、二甲基亞砜、明膠、環(huán)糊精、硬脂酸鎂、葡萄糖、纖維素、糖、碳酸鈣、甘油、氧化鋁、淀粉和等同的載體和稀釋劑，或者這些任一種的混合物。本發(fā)明免疫原的制劑還可以包含懸浮劑、保護(hù)劑、潤(rùn)滑劑、緩沖劑、防腐劑和穩(wěn)定劑。為了提供施用此類劑量用于所希望的治療性治療，本發(fā)明的藥物組合物將有利地包含基于包括載體或稀釋劑的總組合物的重量按重量計(jì)約0.1%到45%，特別1到15%的一種或多種免疫原。如，通常將疫苗或者免疫原制備為注射劑，例如，液體溶液劑或者混懸劑。以與劑量制劑相容的方式和在受體中治療有效和免疫原性的量施用疫苗或者免疫原。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定具體疫苗或者免疫原制劑的最佳劑量和施用模式。還可以以多抗原肽(MAP)構(gòu)建體的形式提供本發(fā)明的肽和/或多肽。已經(jīng)在Tam(1988)描述了MAP構(gòu)建體的制備。MAP構(gòu)建體利用賴氨酸殘基的核心基質(zhì)，其上合成多個(gè)拷貝的免疫原(PosnettWa/.，1988)。可以才艮據(jù)本發(fā)明的方法制備并在疫苗組合物中施用多種MAP構(gòu)建體，每種含有相同或者不同的免疫原。在一個(gè)實(shí)施方案中，為MAP構(gòu)建體提供一種或多種佐劑和/或與一種或多種佐劑一起施用。還產(chǎn)生了本發(fā)明的流感多肽并且作為包含一種或多種多肽的大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)施用。公布的美國專利申請(qǐng)US2005/0009008描迷了產(chǎn)生作為流感病毒疫苗的病毒樣顆粒的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，將本文描述的疫苗和免疫原性組合物施用于易感宿主，通常犬科動(dòng)物，并且更通常為馴養(yǎng)的狗，以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫以抵抗病毒對(duì)宿主隨后的攻擊或者感染的有效量和方式施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物是犬科動(dòng)物。犬科動(dòng)物包括野生的、動(dòng)物園的和馴養(yǎng)的犬科動(dòng)物，如狼、郊狼和狐貍。犬科動(dòng)物還包括狗，尤其馴養(yǎng)的狗，如純種和/或雜種陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、獵狗、守衛(wèi)狗、警犬、賽犬和/或?qū)嶒?yàn)用狗。在特定實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物是馴養(yǎng)的狗，如靈提。通常腸胃外、通過注射，例如皮下、皿內(nèi)或者肌內(nèi)注射施用疫苗或者免疫原。其他合適的施用方式包括經(jīng)口或者經(jīng)鼻施用。通常，將疫苗或者免疫原施用于動(dòng)物至少兩次，每次施用之間為一周或多周的間隔。然而，_沒想用于初次和加強(qiáng)施用疫苗或者免疫原的其他方案，并且該方案可以取決于從業(yè)醫(yī)生的判斷和纟皮治療的具體宿主動(dòng)物。使用本領(lǐng)域中已知的方法，可以將疫苗制劑中的病毒和病毒感染的細(xì)胞失活或者減毒。例如，通過暴露于低聚曱醛、福爾馬林、苯酚、紫外線、高溫等等可以失活或者減毒完整病毒和受感染的細(xì)胞。疫苗劑量中無細(xì)胞的完整病毒的量將通常為約0.1mg到約5mg,更通常約0.2mg到約2mg。包含病毒感染的細(xì)胞系的疫苗制劑的劑量將通常含有每劑約106到約108個(gè)細(xì)胞，更通常每劑約5xl(^到約7.5xl(f個(gè)細(xì)胞。用于動(dòng)物的劑量中蛋白質(zhì)或肽免疫原的量可以從約0.1jig到10000ng，或約1jig到5000jig，或約10ng至ij1000^g，或纟々25ng至)J750ng，或^J50jig至l]500fig，或100jig至J250Hg，取決于接受劑量的動(dòng)物的大小、年齡等等。本發(fā)明的免疫原性或者疫苗組合物，如病毒或者病毒感染的細(xì)胞或者病毒蛋白質(zhì)或肽可以與佐劑組合，通常剛好在施用前組合。設(shè)想用于疫苗制劑的佐劑包括蘇氨?；邗６?MDP)(ByarsWfl/.，1987)、急苷、0/7^6"cter/"附/m/"vw附、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、鋁，或者這些任一種的混合物。適于用于本發(fā)明的方法和疫苗的多種其他佐劑，如明礬，是本領(lǐng)域中/Wp的，并且設(shè)想用于本發(fā)明。本發(fā)明還涉及特異結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者肽的抗體。本發(fā)明的抗體30包括單克隆和多克隆抗體組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明中設(shè)想完整抗體和其抗原結(jié)合片段。從而，例如，合適的抗原結(jié)合片段包括Fab2、Fab和Fv抗體片段。本發(fā)明的抗體可以用可檢測(cè)部分，如熒光分子標(biāo)記(例如，螢光素或者酶)。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)和鑒定本發(fā)明的流感病毒和診斷本發(fā)明的流感病毒對(duì)動(dòng)物的感染的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括檢測(cè)來自動(dòng)物的生物樣品中犬科動(dòng)物流感的存在。樣品中犬科動(dòng)物流感的檢測(cè)可用于診斷動(dòng)物中的犬科動(dòng)物流感。該信息又可以提供基于區(qū)分隨時(shí)間存在的犬科動(dòng)物流感的水平來預(yù)后動(dòng)物的能力，并且可以幫助選擇動(dòng)物的治療劑和治療，和幫助監(jiān)測(cè)療法。該方法還提供了確立在測(cè)試的動(dòng)物中不存在犬科動(dòng)物流感的能力。檢測(cè)動(dòng)物中犬科動(dòng)物流感的能力允許評(píng)估不同的地理位置中犬科動(dòng)物流感的爆發(fā)。該信息還允許早期檢測(cè)從而可以隔離受感染的動(dòng)物，以限制疾病的傳播，和允許早期干預(yù)治療選擇。此外，得到該信息可以為準(zhǔn)備治療許多患病動(dòng)物的醫(yī)學(xué)人員提供指導(dǎo)，包括裝備藥材供應(yīng)，和如果可以得到，疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及從受試動(dòng)物，如犬科動(dòng)物收集生物樣品。生物樣品可以是任一種生物樣品，包括細(xì)胞、組織、毛發(fā)、全血、血清、血漿、乳頭抽吸物、肺灌洗液、腦脊液、唾液、汗液和淚液。動(dòng)物受試樣品可以來自懷疑具有犬科動(dòng)物流感病毒的動(dòng)物，無論該動(dòng)物是否顯示出疾病癥狀。還可以提供對(duì)照樣品或者從已知沒有犬科動(dòng)物流感的動(dòng)物收集?？梢蕴峁╊~外的對(duì)照例如，以減少假陽性和假陰性結(jié)果，和證實(shí)測(cè)定中的試劑主動(dòng)檢測(cè)犬科動(dòng)物甲型流感病毒。除了檢測(cè)生物樣品中犬科動(dòng)物流感的存在或不存在，本發(fā)明中使用的檢測(cè)方法可以檢測(cè)犬科動(dòng)物流感病毒中的突變，如核酸序列的改變，其可以由環(huán)境、藥物治療、遺傳操作或者突變、損傷、食物的改變、衰老或者動(dòng)物的任何其他的特征引起。突變還可以導(dǎo)致犬科動(dòng)物曱型流感變得抵抗以前有效的藥物，或者使得病毒感染和在不同物種的動(dòng)物或者人類中繁殖。例如，已經(jīng)表明鳥類甲型流感病毒感染其他動(dòng)物和人。在用于檢測(cè)動(dòng)物中流感病毒的一個(gè)實(shí)施方案中，通過收集高質(zhì)量的樣品、它們快速運(yùn)輸?shù)綑z測(cè)設(shè)施、和在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)前合適的保存方便了診斷。在含有受感染的細(xì)胞和分泌物的樣品中最佳地檢測(cè)到病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，在臨床癥狀發(fā)作后前3天內(nèi)采集用于直接檢測(cè)病毒抗原和/或核酸和/或病毒分離的樣品。多種類型的樣本適于診斷上呼吸道的病毒感染，包括，但不限于，鼻拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽吸物、鼻洗液和喉嚨拭子。除了拭子外，還可以采集組織或者血清的樣品，并且還可以進(jìn)行侵入性步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，收集呼吸系統(tǒng)樣品并以l-5ml病毒運(yùn)送培養(yǎng)基運(yùn)輸。滿足多種病毒的回收的多種培養(yǎng)基可通過商業(yè)途徑獲得。向運(yùn)送培養(yǎng)基中加入臨床樣品。還可以用病毒運(yùn)送培養(yǎng)基運(yùn)送鼻或者鼻咽拭子。運(yùn)送培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例是10克小牛肉浸汁和2克牛白蛋白級(jí)分V，加入到無菌蒸餾水至400m。也可以加入抗生素，如0.8ml硫酸慶大霉素溶液(50mg/ml)和3.2ml兩性霉素B(250^g/ml)。優(yōu)選通過過濾消毒培養(yǎng)基。鼻洗液，如無菌鹽水(0.85%NaCl)也可以用于收集呼吸系統(tǒng)病毒的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，在臨床癥狀發(fā)生后不久，優(yōu)選不遲于7天內(nèi)，從急性期動(dòng)物的1-5ml量的全血收集血清。還例如在癥狀發(fā)生后約14天收集恢復(fù)期血清樣品。在中和試驗(yàn)中，血清樣品可以用于檢測(cè)抗呼吸系統(tǒng)病毒的抗體。在一個(gè)實(shí)例中，可以在一定期限內(nèi)(例如，每天一次，每周一次，每月一次，每半年一次或者每年一次)從個(gè)體動(dòng)物收集樣品。在一定時(shí)期內(nèi)從個(gè)體動(dòng)物得到多個(gè)樣品可以用于驗(yàn)證來自更早檢測(cè)的結(jié)果，和/或鑒定對(duì)特定治療，例如，對(duì)所選的治療藥物的應(yīng)答或者抗性。本發(fā)明的方法可以用于檢測(cè)來自動(dòng)物的受試樣品中一種或多種病理物質(zhì)的存在，和每種病理物質(zhì)的水平?？梢允褂糜糜跈z測(cè)病理物質(zhì)的任何方法，包括但不限于，抗體測(cè)定法，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、間接熒光抗體(IFA)檢測(cè)、血細(xì)胞凝集，和血細(xì)胞凝集抑制(HI)測(cè)定法，和蛋白質(zhì)印跡。也可以^使用已知的細(xì)胞培養(yǎng)方法。使用細(xì)胞培養(yǎng)物的免疫焚光或者細(xì)胞培養(yǎng)基(上清液)的HI測(cè)定法，可以進(jìn)一步鑒定陽性培養(yǎng)物。此外，可以使用檢測(cè)核酸(DNA或者RNA)或者蛋白質(zhì)的方法。此類方法包括，但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)PCR測(cè)試和實(shí)時(shí)測(cè)試，和定量核酸酶保護(hù)測(cè)定法。可利用通過商業(yè)途徑可獲得的測(cè)試試劑盒用于進(jìn)行這些測(cè)定法。例如，QIAGEN(Valencia,CA)出售一步RT-PCR試劑盒，和病毒RNA提取試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法利用對(duì)本發(fā)明的病毒或病毒蛋白質(zhì)特異的抗體。在特定實(shí)施方案中，利用對(duì)本發(fā)明病毒的HA蛋白質(zhì)特異的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用對(duì)本發(fā)明病毒的NP蛋白質(zhì)特異的抗體。從動(dòng)物得到合適的樣品，如來自鼻或者鼻咽區(qū)域的樣品，并從中分離病毒或者病毒蛋白質(zhì)。然后對(duì)病毒組分篩選對(duì)蛋白質(zhì)，如本發(fā)明病毒的HA或者NP特異的抗體的結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，從動(dòng)物得到血清樣品(或者其他含有抗體的樣品)并對(duì)血清篩選結(jié)合本發(fā)明病毒的蛋白質(zhì)的抗體的存在。例如，可以進(jìn)行ELISA測(cè)定，其中平板壁具有結(jié)合到壁的HA和/或NP蛋白質(zhì)，或者其肽片段。然后將平板壁與來自受試動(dòng)物的血清或者抗體接觸。動(dòng)物中特異結(jié)合HA和/或NP蛋白質(zhì)的抗體的存在表明該受試動(dòng)物受到或者已經(jīng)受到本發(fā)明的流感病毒的感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過測(cè)定生物樣品中抗病理物質(zhì)的抗體的存在或不存在，檢測(cè)病理物質(zhì)的存在。在動(dòng)物受感染后可以在血液檢驗(yàn)中檢測(cè)到抗體之前，需要一定的時(shí)間(例如，數(shù)月)?？贵w一旦形成，通常持續(xù)許多年，甚至在成功地治療該疾病之后。發(fā)現(xiàn)針對(duì)犬科動(dòng)物甲型流感病毒的抗體不能指出感染是最近的還是在過去的某個(gè)時(shí)間。還可以用液體進(jìn)行抗體測(cè)試?？贵w測(cè)定法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、間接熒光抗體(IFA)測(cè)定法，和蛋白質(zhì)印跡。優(yōu)選地，使用多種測(cè)定法，如ELISA或者IFA，接著通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行抗體測(cè)試。在兩步方法中，使用EL1SA或者IFA測(cè)定法，接著通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行抗體測(cè)定法。認(rèn)為ELISA是比IFA更可靠和更準(zhǔn)確的測(cè)定法，但是如果不能利用EILSA，那么可以使用IFA。蛋白質(zhì)印跡測(cè)試(其是更特異的測(cè)試)也可以在所有動(dòng)物中進(jìn)行，尤其在那些在ELISA或者IFA測(cè)定中檢測(cè)為陽性或者臨界陽性(含糊的)的動(dòng)物中進(jìn)行?？梢杂糜跈z測(cè)流感病毒的其他基于抗體的測(cè)試包括血細(xì)胞凝集抑制測(cè)定法。如所迷的使用雞或者火雞紅細(xì)胞(Burleson"fl/.，1992)和KendalCfl/.，1982)，可以檢測(cè)來自動(dòng)物的生物樣品中的血細(xì)胞凝集活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的流感或者HA蛋白或者肽與含有血清或者抗體的測(cè)試樣品沖妄觸。然后加入來自動(dòng)物如鳥的紅細(xì)胞(RBC)。如果存在抗HA的抗體，那么RBC將不凝集。如果不存在抗HA的抗體，那么在HA存在下，RBC將凝集。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞凝集抑制測(cè)定法的變更和修改是本領(lǐng)域中已知的并且設(shè)想在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過從樣品如鼻或者鼻咽拭子分離病毒，可以確定動(dòng)物的感染。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚接種，可以進(jìn)行病毒分離。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以用基于核酸的測(cè)定法檢測(cè)本發(fā)明的病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，從動(dòng)物得到核酸樣品并將該核酸進(jìn)行PCR,如果該核酸含有對(duì)本發(fā)明的流感病毒特異的序列，那么使用的引物將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。在特定實(shí)施方案中，在測(cè)定中將RT-PCR用于本發(fā)明病毒。在示例的實(shí)施方案中，用實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定本發(fā)明的流感病毒。PCR、RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR方法是本々頁域中已知的并且已經(jīng)在美國專利號(hào)4,683,202;4,683,195;4,800,159;4,965,188;5，994，056;6，814，934;和SaikiCfl/.(1985);Sambrook(1989);Lee"fl/.(1993);和LivakCfl/.(1995)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR測(cè)定法使用對(duì)流感基質(zhì)(MA)基因和/或HA基因特異的寡核苷酸。還可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序以確定該產(chǎn)物是否具有本發(fā)明的流感病毒的序列。其他基于核酸的測(cè)定法可以用于檢測(cè)和診斷本發(fā)明病毒的病毒感染并且設(shè)想此類測(cè)定法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將含有核酸的樣品進(jìn)行基于PCR的擴(kuò)增，使用正向和反向引物，其中所述引物對(duì)病毒多核苷酸或者基因序列特異。如果樣品中的核酸是RNA,那么可以進(jìn)行RT-PCR。對(duì)于實(shí)時(shí)PCR,將可檢測(cè)的探針與引物一起使用。對(duì)許多循環(huán)流感病毒的血凝素(HA)基因特異的引物組是已知，并且正在被不斷開發(fā)出來。流感病毒基因組是單鏈RNA，并且必須使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)聚合酶進(jìn)行DNA拷貝(cDNA)。例如，使用RT-PCR對(duì)RNA基因組的擴(kuò)增需要一對(duì)寡核苷酸引物，其通常基于曱型流感病毒亞型的已知的HA序列和神經(jīng)氨酸酶(NM)-1設(shè)計(jì)。可以選擇引物使得它們將特異擴(kuò)增僅一種病毒亞型的RNA。使用亞型特異的引物產(chǎn)生的DNA可以通過分子遺傳學(xué)技術(shù)如測(cè)序進(jìn)一步分析。試驗(yàn)優(yōu)選用陽性對(duì)照進(jìn)行，或者產(chǎn)物通過測(cè)序并與已知序列比較來驗(yàn)證。不存在目標(biāo)PCR產(chǎn)物(即，"陰性"結(jié)果)不能排除病毒的存在。然后可以在幾小時(shí)內(nèi)從臨床拭子或者感染的細(xì)胞培養(yǎng)物得到結(jié)果。甲型流感病毒的PCR和RT-PCR試驗(yàn)由Fouchier"a/.,2000和Maertzdorf"fl/"2004描述。本發(fā)明還涉及篩選對(duì)本發(fā)明的病毒具有抗病毒活性的化合物或藥物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的病毒感染的細(xì)胞與受試化合物或者藥物接觸。然后測(cè)定接觸后病毒的量或者病毒活性?？梢赃x擇顯示出抗病毒活性的那些化合物或者藥物用于進(jìn)一步評(píng)估。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的流感病毒感染的分離的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是犬科動(dòng)物細(xì)胞，如犬科動(dòng)物腎上皮細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。優(yōu)選地，在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中提供所述多核苷^列。更優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體提供了在細(xì)胞中過表達(dá)有效連接的本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，用多核苷酸序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述多核苷酸序列包含編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中顯示的氨基酸序列，或者其功能片段或者變體的序列。在特定實(shí)施方案中，用編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核普酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分別包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、3565、67、69、71、73、75或77中所示的核苷酸序列，或者編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)的功能片段或者變體的序列。從而，本發(fā)明涉及用包含SEQID隱1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的<壬一個(gè)中所示的核苷酸序列或者SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)的片段或者變體，包括簡(jiǎn)并變體的多核苦酸序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如，植物細(xì)胞，包括原生質(zhì)體，或者轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如，細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌。動(dòng)物細(xì)胞包括人細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，部分犬科動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。才直物細(xì)胞包括，但不限于，雙子葉4直物細(xì)胞、單子葉植物細(xì)力包和針葉樹細(xì)胞。本發(fā)明還涉及表達(dá)和產(chǎn)生本發(fā)明的病毒蛋白或者多肽的轉(zhuǎn)基因植物。的植物、植物組織和植物細(xì)胞。優(yōu)選地，在植物、植物組織或者植物細(xì)胞中過表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。植物可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的流感疫苗組合物并且可以通過植物的消費(fèi)施用疫苗(見，例如，美國專利號(hào)5,484,719和6，136，320)。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)病毒或者診斷本發(fā)明的病毒感染的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含本發(fā)明的抗體，其特異結(jié)合本發(fā)明的流感病毒，或者其抗原性部分。在另一實(shí)施方案中，試劑盒包含本發(fā)明的一種或多種多肽或者肽。在特定實(shí)施方案中，所述多肽具有SEQIDN0.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)中所示的氨基,列，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。在另一實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或多種本發(fā)明的多核苷酸或者寡核苷酸。在特定實(shí)施方案中，所述多核苷酸具有SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77任一個(gè)中所示的核苷酸序列，或者其片段或者變體。試劑盒可以任選包含一種或多種對(duì)照抗體、對(duì)照多肽或者肽，和/或?qū)φ斩嗪塑账峄蛘吖押塑账?。試劑盒的抗體、多肽、肽、多核苷酸和/或寡核苦酸可以在合適的容器或者包裝中提供。本申請(qǐng)還涉及雜種狗作為流感病毒感染和發(fā)病機(jī)理模型的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)雜種狗接種本發(fā)明的流感病毒，如犬科動(dòng)物流感病毒。任選地，接種后可以對(duì)狗施用治療劑。在用病毒接種之前，還可以對(duì)狗施用組合物用于產(chǎn)生針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答?？梢栽诮臃N之前和/或之后得到組織、血液、血清和其他生物樣品并使用本領(lǐng)域中已知的方法檢查病毒的存在和組織的發(fā)病機(jī)理，所述方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、核酸測(cè)序，和免疫組織化學(xué)。本文公開的4壬一實(shí)施方案的任一元素可以與本文的任何其他元素或者實(shí)施方案組合，并且特別設(shè)想此類組合在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文提及或者引用的所有專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)和出版物都完整(包括所有圖和表)尋1入本文作為參考，直到它們與本說明書的明確教導(dǎo)不一致的程度。實(shí)施例1-6的材料和方法從靈提收集血液和鼻拭子從在賽跑狗舍中經(jīng)歷呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)的臨床上患病的或者正常的靈提通過頸靜脈穿刺收集急性和恢復(fù)期血液樣品。在急性樣品后4到12周收集恢復(fù)期樣品。收獲血清并在-80。C保存。收集鼻拭子并在遞交用于細(xì)菌分離之前置于具有炭的Amies運(yùn)送培養(yǎng)基(BectonDickinsonBiosciences)中。靈提的尸體剖檢由佛羅里達(dá)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院(UniversityofFloridaCollegeofVeterinaryMedicine(UFCVM))的解剖病理學(xué)處(AnatomkPathologyService)對(duì)2004年1月在佛羅里達(dá)賽場(chǎng)的爆發(fā)中死亡的8只靈提的5只進(jìn)行完全的尸體剖檢。另一只狗的尸體剖檢在私立的獸醫(yī)診所進(jìn)行，將組織遞交到UFCVM用于組織病理學(xué)診斷。將組織用10%中性緩沖福爾馬林固定，包埋在石蠟中，并對(duì)5卞m切片用蘇木精和伊紅染色用于組織病理學(xué)診斷或者處理用于如下述的免疫組織化學(xué)。遞交未固定的組織用于細(xì)菌培養(yǎng)并且也保存在-80。C。犬科動(dòng)物呼吸系統(tǒng)病原體的血清學(xué)試驗(yàn)將配對(duì)的急性和恢復(fù)期血清樣品遞交給康耐爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院(CornellUniversityCollegeofVeterinaryMedicine)的動(dòng)物健康"^斷實(shí)驗(yàn)室(AnimalHealthDiagnosticLaboratory(AHDL))，對(duì)犬瘋熱病毒、2型腺病毒和副流感病毒進(jìn)行血清中和測(cè)定。抗體效價(jià)表達(dá)為抑制細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒感染的血清的最終稀釋度。血清轉(zhuǎn)變表明病毒感染，將血清轉(zhuǎn)變定義為急性和恢復(fù)期樣品之間抗體效價(jià)升高24倍。沒有檢測(cè)到對(duì)這些病毒病原體的血清轉(zhuǎn)變。犬科動(dòng)物細(xì)菌呼吸系統(tǒng)病原體的微生物試驗(yàn)將配對(duì)的鼻拭子和死后組織遞交給UFCVM的診斷臨床微生物學(xué)/寄生蟲學(xué)/血清學(xué)處(DiagnosticClinicalMicrobiology/Parasitology/SerologyService)用于細(xì)菌分離和鑒定。在非選擇培養(yǎng)基以及選擇博德特氏菌(必onjfeteZ/fl)種(Regan-Lowe;Remel)和支原體(Afyop/flw歸)種(Remel)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)樣品。在沒有報(bào)告生長(zhǎng)前，保持所有培養(yǎng)物21天。還將一些靈提的鼻拭子遞交給堪薩斯州立大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院(KansasStateUniversityCollegeofVeterinaryMedicine)的診斷醫(yī)學(xué)/病理生物學(xué)系(DepartmentofDiagnosticMedicine/Pathobiology)用于細(xì)菌培養(yǎng)。在所檢驗(yàn)的70只臨床上患病的狗中，從1只狗的鼻腔分離支氣管博德特氏菌CBw&te///16nwc/t&印ft'cfl),而從33只狗的鼻腔回收支原體。通常用化膿性鼻弟從狗的鼻腔回收出血敗血性巴斯德氏菌(戶船fe",e"flr附w/to"V^)。在2004年1月的爆發(fā)中死亡的兩只狗在死亡后肺中具有大腸桿菌的不足的生長(zhǎng)，一只狗具有大腸桿菌和犬鏈球菌(A,印toacc附c"m's)的不足的生長(zhǎng)，另一只具有銅綠4叚單月包菌(Psewffo柳fWfls^mg/"osfl)和酵母的不足的生長(zhǎng)。從死亡狗的氣管或者肺中沒有分離到支氣管博德特氏菌或者支原體。從死后組織分離病毒將冷凍的組織解凍并在10倍體積的補(bǔ)充0.5。/。牛血清白蛋白(BSA)和抗生素的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中勻漿。通過離心除去固體碎片并將上清液接種到培養(yǎng)的細(xì)胞或者10天齡的含胚的雞蛋中。將來自死亡靈提的組織勻漿物4妾種到不同的細(xì)胞培養(yǎng)物中，該培養(yǎng)物支持多種病毒病原體的復(fù)制。細(xì)胞培養(yǎng)物包括Vero(非洲綠猴腎上皮細(xì)胞，ATCCNo.CCL-81)、A-72(犬腫瘤成纖維細(xì)胞，CRL-1542)、HRT-18(人直腸上皮細(xì)胞，CRL-11663)、MDCK(犬腎上皮細(xì)胞，CCL-34)、原代犬腎上皮細(xì)胞(AHDL，CornellUniversity)、原代犬肺上皮細(xì)胞(AHDL)和原代牛睪丸細(xì)胞(AHDL)。在補(bǔ)充2.5ug/mLTPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma)的MEM中培養(yǎng)MDCK和HRT細(xì)胞；在補(bǔ)充10%胎牛血清和抗生素的MEM中培養(yǎng)剩余的細(xì)胞系。在25eir^瓶中37。C下在含有5%C02的增濕空氣中培養(yǎng)細(xì)胞。用經(jīng)補(bǔ)充的MEM接種對(duì)照培養(yǎng)物。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)改變并在接種后5天收獲。將收獲的液體和細(xì)胞通過離心澄清并如對(duì)最初接種所描述的接種在新鮮細(xì)胞上；進(jìn)行兩次盲法傳代。使用雞或者火雞血紅細(xì)胞如所述的(BurlesonWaZ.，1992;Kendal"fl/.，1982)測(cè)定澄清的上清液中的血細(xì)胞凝集活性。對(duì)于雞胚中的病毒分離，將O.lmL組織勾漿物接種在尿膜嚢中并在35。C下培養(yǎng)48小時(shí)。兩次盲法傳代后，如所述的測(cè)定尿嚢液中的血細(xì)胞凝集活性(Burleson1992;Kendal1982)。RT-PCR、核苦酸測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化分析使用RNeasy試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，從組織培養(yǎng)物上清液或者尿嚢液提取總RNA。使用一步RT-PCR試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明將總RNA(IOng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。如以前描述的(Klimov"W.，1992a),使用通用的基因特異性引物組進(jìn)行cDNA中8種流感病毒基因的編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增。所得DNA擴(kuò)增子用作AppliedBiosystems3100自動(dòng)化DNA測(cè)序儀上的自動(dòng)化測(cè)序的模板，使用循環(huán)測(cè)序染料終止化學(xué)(ABI)。用GCGPackage,版本10.0(Accelyrs)(Womble，2000)分析核苷酸序列。用PhylogenyInferencePackage⑥版本3.5估計(jì)系統(tǒng)發(fā)生和從核苦酸序列計(jì)算自展值(Felsenstein，1989)。使用MEGA程序(Kumar"/.，2004)中實(shí)現(xiàn)的Tamura-Neigamma模型，將系統(tǒng)樹與近鄰連接分析產(chǎn)生的那些系統(tǒng)樹比較，并通過PAUP4.0Beta程序(SinauerAssociates)證實(shí)。狗的實(shí)驗(yàn)接種使用四只6個(gè)月齡的特定無病原體的小獵兔犬[2只雄性和2只雌性(LibertyResearch)]。體檢和基線血試驗(yàn)，包括全血細(xì)胞計(jì)數(shù)/微分、血清化學(xué)小組和尿分析確定動(dòng)物是健康的。將它們養(yǎng)在試驗(yàn)動(dòng)物照料評(píng)估和認(rèn)證協(xié)會(huì)(AssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCare)認(rèn)證的BSL2-增強(qiáng)型設(shè)施中。每天兩次持續(xù)7天記錄基線直腸溫度。通過異丙酚(Diprivan⑧，ZenecaPharmaceuticals,0.4mg/kg體重以生效)的靜脈內(nèi)注射麻醉狗用于用氣管內(nèi)插管進(jìn)行插管法。每只狗接種總劑量為106'6半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID5。)的A/Canine/Florida/43/2004(Canine/FL/04)(H3N8)病毒，將一半的劑量通過氣管內(nèi)插管施用于遠(yuǎn)端氣管并將另一半劑量通過導(dǎo)管施用于鼻道深處。接種后(p丄)14天，每天兩次進(jìn)行體檢和直腸溫度記錄。通過頸靜脈穿刺在接種后0、3、5、7、10和14天收集血樣(4mL)。在接種后0到5、7、10和14天用聚酯拭子(FisherScientific)從每只狗收集鼻和鼻咽樣品。將拭子置于病毒運(yùn)送培養(yǎng)基(Remel)中并保存在-80°C。通過在接種后5天靜脈內(nèi)接種Beuthanasia-D溶液(lmL/5kg體重；Schering-PloughAnimalHealthCorp)對(duì)兩只狗實(shí)施安樂死(l只雄性和1只雌性)并在第14天對(duì)剩下的2只狗進(jìn)行尸體剖檢。如所述的處理用于組織學(xué)分析的組織。用于病毒培養(yǎng)的組織在-8(TC保存。該研究得到佛羅里達(dá)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(UniversityofFloridaInstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的批準(zhǔn)。病毒從實(shí)驗(yàn)接種的狗的脫落通過離心澄清拭子運(yùn)送培養(yǎng)基制備的肺勻漿物和拭子提取物的連續(xù)稀釋液用補(bǔ)充0.5%BSA和抗生素的MEM建立。如所述的(Burleson"fl/.，1992)使用單層MDCK細(xì)胞在6孔組織培養(yǎng)板中進(jìn)行噬菌斑測(cè)定。用含有0.8%瓊脂糖和1.5ug/mLTPCK-胰蛋白酶的補(bǔ)充的MEM覆蓋接種的細(xì)胞單層。在固定和用結(jié)晶紫染色前，在含有5。/。C02的增濕的空氣中37。C下培養(yǎng)細(xì)月包72小時(shí)。病毒濃度表達(dá)為每克組織或者每個(gè)拭子的噬斑形成單位(PFU)。免疫組織化學(xué)在Bond-RiteTM載玻片(Richard-AllanScientific,Kalamazoo,MI)上封固來自靈提和小獵兔犬的脫蠟和再水化的5卞m肺組織切片并隨后用蛋白酶K(DakoCytomation，Carpenteria，CA)接著用過氧化物酶封閉試劑(DakoEnVisionTMperoxidaseKit,DakoCorp.)處理。將切片與抗犬痕熱病毒(VMRD,Inc.)、犬2型腺病毒(VMRD,Inc.)、犬副流感病毒(VMRD，Ine.)或者曱型流感H3(ChemiconInternational,Inc.)的單克隆抗體的1:500稀釋液在室溫下溫育2小時(shí)。對(duì)照包括用小鼠IgG(lmg/mL，Serotec，Inc.)溫育相同的切片，并溫育單克隆抗體與正常的犬肺切片。用一級(jí)抗體處理后，用二級(jí)免疫過氧4b物酶和過氧化物酶底物試劑(Dako⑧EnVisionPeroxidaseKit,DakoCorp.)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明溫育切片。將切片用蘇木精復(fù)染，用Clarifier#2和BluingReagent(Richard-AllanScientific,Kalamazoo,MI)處理，脫水，并用Permount(ProSciTech)蓋片。血細(xì)胞凝集抑制(HI〗測(cè)定法在37。C下用受體破壞酶(RDE，Denka)(1份血清3份RDE)溫育血清樣品16小時(shí)，然后在56。C熱失活60分鐘。在37。C下在MDCK細(xì)胞中培養(yǎng)InfluenzaA/Canine/FL/04(H3N8)病毒36-48小時(shí)。收獲病毒培養(yǎng)上清液，通過離心澄清，并在-80。C保存。如以前描述的進(jìn)行HI測(cè)定法(Kendale/a/.，1982)。筒言之，將25pl中的4血凝單位病毒加入孩i量滴定孔中等體積的連續(xù)稀釋的血清，并在室溫溫育30分鐘。加入等體積的0.5%v/v火雞紅細(xì)胞并在30分鐘后通過視覺評(píng)估血細(xì)胞凝集效價(jià)。將終點(diǎn)HI效價(jià)定義為完全抑制血細(xì)胞凝集的血清的最后稀釋度。將血清轉(zhuǎn)變定義為配對(duì)的急性和恢復(fù)期樣品之間的HI效價(jià)^4倍增加。將單個(gè)樣品的血清陽性定義為^1:32的HI抗體效價(jià)。微量中和(MN)測(cè)定通過如以前描述的MN測(cè)定法(Rowe"a/"1999)檢測(cè)對(duì)A/Canine/FL/04(H3N8)的中和血清抗體應(yīng)答，只是在測(cè)定前對(duì)犬血清進(jìn)行如上述的RDE處理。將終點(diǎn)效價(jià)定義為得到病毒的100TCIDso50。/。中和的血清的最高稀釋度。將血清轉(zhuǎn)變定義為配對(duì)的急性和恢復(fù)期樣品之間MN效價(jià)^4-倍增加。將單個(gè)樣品的血清陽性定義為MN效價(jià)三1:80。下面是闡明實(shí)施本發(fā)明方法的實(shí)例。不應(yīng)該將這些實(shí)施例理解為限制。除非另外指出，所有百分?jǐn)?shù)都是按重量計(jì)并且所有溶劑混合物比例都是按體積計(jì)。實(shí)施例1在2004年1月，在Florida賽場(chǎng)的2個(gè)狗舍中喂養(yǎng)的22只竟賽靈提和為這些狗舍提供狗的當(dāng)?shù)剞r(nóng)場(chǎng)中發(fā)生了呼吸系統(tǒng)疾病的爆發(fā)。在每個(gè)狗舍建筑中有約60只狗，農(nóng)場(chǎng)中約300只狗。在6天內(nèi)發(fā)生了爆發(fā)，之后沒有42鑒定到新的病例。22只狗的14只具有39.5到41.5。C的發(fā)熱，發(fā)咝的作嘔性咳嗽10到14天，并且最終恢復(fù)。在剩余的8只狗中，6只明顯健康的狗出乎意料地死亡，具有口和鼻出血。兩只其他狗由于快速惡化，在發(fā)生口鼻出血的24小時(shí)內(nèi)實(shí)施安樂死。這些狗都具有41。C發(fā)熱。8例死亡中4例在狗舍建筑物中發(fā)生，4例在農(nóng)場(chǎng)發(fā)生。50%的死亡發(fā)生在爆發(fā)的第3天。22只狗的年齡為17個(gè)月到4歲，但是73%的為17到33個(gè)月齡。兩種臨床綜合征是明顯的較輕微的病，其特征是最初的發(fā)熱和然后咳嗽10-14天(14只狗)，隨后恢復(fù)，或者過急性死亡，伴隨著呼吸道中的出血(8只狗，死亡率為36%)。對(duì)8個(gè)死亡病例的6例進(jìn)行了尸體剖檢。所有狗都在肺、縱隔和胸膜腔中具有廣泛的出血。對(duì)呼吸道的組織學(xué)檢查揭示除了肺部出血外，所有狗都具有氣管炎、支氣管炎、細(xì)支氣管炎和化膿性支氣管肺炎(圖3)。這些組織中上皮層和氣道腔中浸潤(rùn)嗜中性粒細(xì)胞和巨嗟細(xì)胞。將從這些狗制備的肺勻漿物接種到多種猴、人、牛和犬細(xì)胞系用于病毒培養(yǎng)。來自一條狗的肺勻漿物在胰蛋白酶存在下在培養(yǎng)的Madin-Darby犬腎上皮細(xì)胞(MDCK)中引起細(xì)胞病變效應(yīng)，并且細(xì)胞培養(yǎng)上清液凝集了雞紅細(xì)胞。通過商業(yè)ELISA檢測(cè)曱型和乙型流感病毒的核蛋白，和通過使用對(duì)甲型流感病毒的基質(zhì)基因特異的引物進(jìn)行PCR分析，提供甲型流感病毒的初步證據(jù)。此外，通過針對(duì)馬曱型流感H3亞型的參照抗血清抑制了血細(xì)胞凝集活性，但是通過對(duì)人曱型流感亞型Hl-Hll和H13特異的抗血清沒有抑制血細(xì)胞凝集活性(表3)。為了表征病毒的分子性質(zhì)，我們測(cè)定了病毒基因組的8個(gè)RNA區(qū)段的核苦酸序列。與已知的流感病毒基因的序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明犬分離群的8種基因與來自同時(shí)代的馬甲型流感(H3N8)病毒最相似，它們與所述病毒的基因共有^96-97%的序列同一性(圖1A,表4)。相比，來自鳥類、豬和人甲型流感分離抹的代表性基因與犬分離群具有^94%同一性(表4)。這些數(shù)據(jù)將犬分離群A/Canine/Florida/43/04(Canine/FL/04)鑒定為與馬流感病毒的同時(shí)代語系密切相關(guān)的甲型流感H3N8病毒。因?yàn)槿蛛x群的所有基因都是馬流感病毒來源的，所以我們推斷馬流感病毒的整個(gè)基因組已經(jīng)轉(zhuǎn)移到狗。實(shí)施例2為了研究Canine/FL/04在靈提中的臨床和病理學(xué)觀察中的作用，我們僅用抗甲型流感H3的單克隆抗體對(duì)肺組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色(IHC)。在支氣管和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、支氣管腺上皮細(xì)胞和氣道腔和肺泡腔的巨噬細(xì)胞中總是檢測(cè)到病毒H3抗原(圖2A)。這些數(shù)據(jù)支持在多只狗中H3亞型流感病毒的肺部感染的診斷。實(shí)施例3為了確定Canine/FL/04-樣病毒參與呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)的病因，我們通過血細(xì)胞凝集抑制(HI)和微量中和法(MN)分析了來自11只病狗和16只無癥狀接觸狗的急性和恢復(fù)期血清。在兩種測(cè)定法中，在11只中的8只(73%)病狗中發(fā)生了血清轉(zhuǎn)變，其定義為對(duì)Canine/FL/04的抗體效價(jià)從急性到恢復(fù)期升高24-倍(表l)。在HI測(cè)定中，16只中的6只(38%)無癥狀接觸狗中發(fā)生血清轉(zhuǎn)變，而在MN測(cè)定法中，16只中的8只(50%)血清轉(zhuǎn)變(表1)。血清轉(zhuǎn)變數(shù)據(jù)表明Canine/FL/04-樣病毒對(duì)狗的感染，其與多數(shù)動(dòng)物中呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)作在時(shí)間上吻合。在與病狗一起喂養(yǎng)的額外的46只無癥狀狗的爆發(fā)后3個(gè)月，收集單個(gè)血清樣品。其中，在兩種測(cè)定法中43只(93%)為血清陽性。對(duì)于所測(cè)試的73只狗的總?cè)后w中，93%的在兩種測(cè)定中為血清陽性，包括82。/。(9/ll)只病狗和95%(59/62)健康接觸狗。沒有呼吸系統(tǒng)疾病史的狗中的高血清陽性率表明犬科動(dòng)物流感病毒的多數(shù)感染是亞臨床的并且提示病毒在狗中的有效傳播。亞臨床感染是否促進(jìn)病毒的傳播還是未知的。實(shí)施例4為了更好地理解Canine/FL/04病毒感染狗的能力，用106'6半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCIDso)通過氣管內(nèi)和鼻內(nèi)途徑接種四只6月齡purpose-品種的小獵兔犬的每一只。所有狗在接種后前2天(p丄)都發(fā)生發(fā)熱(直腸溫度S39。C)，但是在14天的觀察期內(nèi)沒有一只顯示出呼吸癥狀，如咳嗽或者鼻洋。通過用鼻或者口咽拭子定量病毒檢查病毒脫落。4只狗的僅僅兩只脫落可檢測(cè)量的病毒。一只狗在接種后1和2天脫落病毒(每個(gè)拭子1.0-2.5log1QPFU),而另一只狗在接種后連續(xù)四天脫落病毒(每個(gè)拭子1.4-4.5log10PFU)。在5p丄對(duì)兩只狗的尸體剖檢揭示了類似于在靈提中的自發(fā)疾病中發(fā)現(xiàn)的壞死和增生性氣管炎、支氣管炎和細(xì)支氣管炎，但是沒有肺出血或者支氣管肺炎。通過IHC在支氣管、細(xì)支氣管和支氣管腺的上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到病毒H3抗原(圖2B)。從一只狗的肺組織回收感染性病毒。在接種后14天對(duì)剩下兩只狗的尸體剖檢顯示了呼吸系統(tǒng)組織中最小的組織學(xué)改變，通過IHC沒有檢測(cè)到病毒H3抗原，從肺勻漿物沒有回收病毒。到接種后第7天用MN測(cè)定法檢測(cè)到后兩只狗中的血清轉(zhuǎn)變，到笫14天抗體效價(jià)進(jìn)一步增加2到3倍。這些結(jié)果確定狗對(duì)Canine/FL/04感染的易感性，如通過發(fā)熱反應(yīng)、在肺實(shí)質(zhì)中存在病毒抗原和感染性病毒、流感的典型組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，和血清轉(zhuǎn)變所證實(shí)。在實(shí)驗(yàn)接種的小獵兔犬中不能再現(xiàn)嚴(yán)重疾病和死亡并不令人驚奇，因?yàn)榇蟛糠值奶烊桓腥镜撵`提是無癥狀的。實(shí)施例5為了研究在2004年1月爆發(fā)前，Canine/FL/04-樣流感病毒是否已經(jīng)在佛羅里達(dá)的靈提群體中傳播，使用HI和MN測(cè)定法對(duì)來自65只竟賽靈提的存檔血清測(cè)試抗Canine/FL/04的抗體。在來自1996到1999年的33個(gè)狗樣品中沒有檢測(cè)到抗體。在2000到2003年間的32個(gè)狗樣品中，9個(gè)樣品在兩種測(cè)定法中都是血清陽性的-l個(gè)在2000年，2個(gè)在2002年，6個(gè)在20O3年(表5)。血清陽性狗位于佛羅里達(dá)賽場(chǎng)，這些賽場(chǎng)與從1999到2003年未知病因的呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)有關(guān)，提示Canine/FL/04-樣病毒可能是那些爆發(fā)的致病因子。為了進(jìn)一步研究該可能性，我們檢查了來自2003年3月死于出血性支氣管肺炎的靈提的存檔組織。接種到MDCK細(xì)胞和雞胚的來自一只狗的肺勻漿物產(chǎn)生了H3N8流感病毒，稱作A/Canine/Florida/242/2003(Canine/FL/03)。對(duì)Canine/FL/03的完整基因/FL/04的>99%同一性(表4)，表明Canine/FL/04-樣病毒在2004年前已經(jīng)感染了靈提。實(shí)施例6從2004年6月到8月，在佛羅里達(dá)、德克薩斯、阿拉巴馬、阿肯色、西佛吉尼亞和堪薩斯州的14個(gè)賽場(chǎng)的幾千只竟賽靈提中發(fā)生了呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)。一些賽場(chǎng)的官員估計(jì)他們至少80%的狗群體患有臨床疾病。多數(shù)狗具有與2004年1月爆發(fā)中的狗類似的發(fā)熱(^39。C)和咳嗽的臨床病征，但是許多狗也具有粘液膿性鼻弟。報(bào)導(dǎo)了多例死亡，但是不能確定準(zhǔn)確的死亡率。我們收集了位于4佛羅里達(dá)賽場(chǎng)的94只狗的配對(duì)的急性和恢復(fù)期血清56%的這些狗對(duì)Canine/FL/04的抗體效價(jià)升高^4倍，100%為血清陽性的(表6)。來自西佛吉尼亞和堪薩斯州的29只狗的恢復(fù)期血清也具有抗Canine/FL/04的抗體。我們從德克薩斯賽場(chǎng)的死于出血性支氣管肺炎的靈提的肺分離了甲型流感(H3N8)病毒。該分離群(稱作A/Canine/Texas/1/2004(Canine/TX/04))的完整基因組的序列分析揭示與Canine/FL/04^99。/。的同一性(表4)。在13個(gè)月期間內(nèi)和從不同的地理位置從致死的犬病例分離出三種密切相關(guān)的流感病毒，以及在竟賽靈提中普遍感染的實(shí)質(zhì)性血清學(xué)證據(jù)，提示Canine/FL/04-樣病毒在狗群體中的持續(xù)傳播。Canine/FL/03、Canine/FL/04和Canine/TX/04的HA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明它們組成單源群，具有有力的自引支持度，其與2002和2003年分離的馬病毒的同時(shí)代H3基因明顯不同(圖1B)。其他7種基因組區(qū)段的系統(tǒng)發(fā)生分析和逐對(duì)核苷酸序列比較提示犬基因隔離為與馬病毒譜系最密切相關(guān)的不同的亞譜系(數(shù)據(jù)未顯示，和表4)。在HA中存在4個(gè)標(biāo)記氨基酸改變也支持犬流感基因聚類為與馬流感分離的單源群(表2)。與來自2003和2004年的血清學(xué)結(jié)果一起，這些數(shù)據(jù)與如下相一致從馬到狗的單個(gè)病毒傳播事件和隨后該病毒在靈提群體中的水平擴(kuò)散。然而，不能正式排除來自未鑒定的儲(chǔ)存物種的流感病毒的該獨(dú)特譜系的重復(fù)導(dǎo)入，雖然這無論如何不太可能。病毒HA是流感病毒的宿主物種特異性的關(guān)鍵決定子(Suzukiafl/.，2000)。為了鑒定HA內(nèi)可能與對(duì)犬科動(dòng)物宿主的適應(yīng)有關(guān)的殘基，我們比較了犬HA的推導(dǎo)的M酸序列與同時(shí)代馬病毒的那些氨基酸序列。在馬和犬成熟HA共有氨基酸序列中有四個(gè)氨基酸不同N83S、W222L、I328T和N483T(見表2)。犬病毒當(dāng)與共有的馬序列比較時(shí)具有氨基酸缺失。因此，HA馬序列中的氨基酸位置7是HA犬序列中的位置6，HA馬序列中的氨基酸位置29是HA犬序列中的位置28，HA馬序列中的氨基酸位置82是HA犬序列中的位置82,等等。從而，四個(gè)替代的氨基酸在SEQIDNO:33和SEQIDNO:34中所示氨基酸序列的位置82、221、327和482。在共有序列位置83上絲氨酸對(duì)天冬酰胺的替代是未知功能重要性的改變，因?yàn)樵趤碜云鋇也物種的H3分子中發(fā)現(xiàn)多種極性殘基。在接近H3HA的切割位點(diǎn)的共有序列位置328上的嚴(yán)格保守的異亮氨酸已經(jīng)被蘇氨酸替代。發(fā)病機(jī)理中宿主蛋白酶對(duì)HA切割的重要作用提示該改變值得進(jìn)一步研究。在共有序列位置222上亮氨酸對(duì)色氨酸的替代是相當(dāng)值得注意的，因?yàn)樗砼c唾液酸結(jié)合口袋相鄰的非保守改變，其可以調(diào)節(jié)受體功能(WeisWa/.,1988)。有趣的是，在222位的亮氨酸不是犬H3HA特有的，因?yàn)樗ǔ?^現(xiàn)于H4、H8、H9和H12HA亞型中(Nobusawa1991;Kovacova""/.，2002)。亮氨酸替代與對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的病毒特異性可能更相容，因?yàn)橐呀?jīng)才艮導(dǎo)了亞型H4病毒對(duì)豬的感染(Karasine"/.，2000)和亞型H9病毒對(duì)人和豬的感染(PeirisWd/.，1999)。在共有序列483位上天冬酰胺對(duì)蘇氨酸的替4戈導(dǎo)致在HA2亞基中糖基化位點(diǎn)的喪失，該位點(diǎn)在所有HA亞型中保守(Wagner"2002)。盡管HA中這些氨基酸改變對(duì)于馬病毒對(duì)狗的適應(yīng)性的重要性還有待確定，但是以前已經(jīng)觀察到與物種間轉(zhuǎn)移有關(guān)的類似的氨基酸改變(Vines"/，1998;Matrosovich"fl/"2000)。在表19到25中顯示了本發(fā)明的其他流感病毒蛋白質(zhì)和馬共有序列之間的氨基酸差異。最初感染競(jìng)賽靈提的馬流感病毒的來源仍然是推測(cè)性的。在靈提竟賽場(chǎng)的狗舍不位于附近的馬或者馬賽場(chǎng)，提示該靈提和脫落病毒的馬之間的接觸不能充分解釋2004年在不同州的多處爆發(fā)。接觸馬病毒的潛在來源是對(duì)靈提喂飼馬肉，所述靈提的食物被補(bǔ)充食品加工廠的生肉，食品加工廠提供可能攜帶流感的尸體，包括馬。該感染方式的先例包括H5N1鳥流感病毒向進(jìn)食受感染的雞尸體的豬和動(dòng)物園貓科動(dòng)物的種間傳播(Webster，1998;Keawcharoen"d,2004;KuikenW"/.，2004)。盡管這是馬流感向狗的最初引入的似乎合理的途徑，但是它不能解釋最近在不同州的幾千只狗中的多次流感爆發(fā)。我們的實(shí)驗(yàn)接種研究表明在狗的鼻道和口咽中存在病毒，盡管處于適度的滴度。然而，這些結(jié)果表明脫落是可能的，并且通過大滴氣溶膠、污染物進(jìn)行的病毒的狗-狗傳播或者間接粘膜接觸可以在該疾病的動(dòng)物流行病學(xué)中起作用。全部哺乳動(dòng)物流感病毒向不相關(guān)的哺乳動(dòng)物物種的種間轉(zhuǎn)移是罕見的事件。以前的研究已經(jīng)提供了狗與人曱型流感(H3N2)病毒的暫時(shí)感染的有限的血清學(xué)或者病毒學(xué)證據(jù)，但不是血清學(xué)和病毒學(xué)證據(jù)兩者(MkitinWa/"1972，Kilbourne，Wa/.，1975;Chang"fl/"1976;HouserW/.，1980)。然而，沒有犬科動(dòng)物宿主中持續(xù)傳播的證據(jù)。盡管充分記栽了豬流感病毒從豬向人的直接轉(zhuǎn)移(DacsoCfl/"1984;KimuraC1998;PatriarcaCfl/"1984;Top""/.,1977),但是沒有豬病毒在人宿主中適應(yīng)的證據(jù)。在該報(bào)導(dǎo)中，我們提供了完整馬曱型流感(H3N8)病毒向另一種哺乳動(dòng)物物種狗的種間傳播。犬病毒HA中獨(dú)特的M酸替代，以及美國多個(gè)州中狗感染的血清學(xué)證據(jù)，提示該病毒適應(yīng)了犬科動(dòng)物宿主。因?yàn)楣肥侨祟惖闹饕惆閯?dòng)物，所以這些發(fā)現(xiàn)具有公共健康的牽連；狗可能提供新的甲型流感病毒向人類傳播的新的來源。表l.對(duì)A/Canine/Florida/43/04(H3N8)的抗體應(yīng)答<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>a具有疾病的臨床病征的狗的數(shù)目。b與臨床上患病狗接觸喂養(yǎng)的無癥狀狗的數(shù)目。c使用A/Canine/Florida/43/04病毒的血細(xì)胞凝集抑制(HI)測(cè)定法。d^f吏用A/Canine/Florida/43/04病毒的微量中和(MN)測(cè)定法。e具有配對(duì)的急性和恢復(fù)期血清中抗體效價(jià)增加至少4倍的狗的百分比。f在恢復(fù)期血清中具有陽性抗體效價(jià)(HI效價(jià)^32:MN效價(jià)^80)的狗的百分比。g恢復(fù)期血清的幾何平均抗體效價(jià)。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>*成熟H3HA中的氨基酸殘基(單字母代碼)和位置。氨基酸代碼是A-丙氨酸，D-天冬氨酸，G-甘氨酸，1=異亮氨酸，K-賴氨酸，1^=亮氨酸，M=甲硫氨酸，N-天冬酰胺，R-精氨酸，S-絲氨酸，T-蘇氨酸，V-纈氨酸，W-色氨酸。t表示沒有從共有馬H3HA的改變。表3.通過針對(duì)不同HA亞型的參考血清對(duì)病毒分離群的血細(xì)胞凝集抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>a對(duì)來自#43狗的病毒分離群的血細(xì)胞凝集抑制滴定度。b在白鼬中產(chǎn)生多克隆抗血清，而在綿羊或山羊中產(chǎn)生所有其他抗血表4.A/Canine/Florida/43/04(H3N8)基因與馬、鳥類、豬和人的甲型流感毒林的序列同源性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>aA/Canine/Florida/43/04(H3N8)基因與來自所述物種的流感病毒分離群的多數(shù)同源基因的百分比核苷酸和氨基酸(括號(hào)內(nèi))序列同一性，接著是它們的Genbank序列數(shù)據(jù)庫檢索號(hào)。b不可應(yīng)用在人或者豬病毒中從沒有報(bào)道N8神經(jīng)氨酸酶。表5.對(duì)1996到2003年收集的靈提血清中A/canine/Florida/43/04(H3N8)的抗體效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表6.2004年6月在佛羅里達(dá)賽場(chǎng)的竟賽靈提中對(duì)A/canine/Florida/43/04(H3N8)的抗體應(yīng)答<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>M吏用A/canine/Florida/43/04(H3N8)通過HI測(cè)試的臨床上患病狗的數(shù)目。b在急性和恢復(fù)期血清之間抗體效價(jià)升高^4倍的狗的百分比。c在恢復(fù)期血清中具有陽性抗體效價(jià)(HI效價(jià)>16)的狗的百分比。d恢復(fù)期血清的幾何平均抗體效價(jià)。實(shí)施例7-11的材料和方法犬組織由佛羅里達(dá)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的解剖病理學(xué)處對(duì)6只雜種狗和一只寵物YorkshireTerrier狗進(jìn)行尸體剖檢，所述雜種狗在2005年4月/5月流感爆發(fā)期間在佛羅里達(dá)東北部的收容所死亡，所述YorkshireTerrier狗在2005年5月流感病毒爆發(fā)期間在佛羅里達(dá)東南部的獸醫(yī)診所中死亡。將組織用10%中性緩沖福爾馬林固定，包埋在石蠟中，并用蘇木精和伊紅染色5卞m的切片用于組織病理學(xué)診斷。在病毒學(xué)分析之前，未固定的組織在-80。C保存。從犬組織樣品提取RNA將來自7只狗的每一只的冷凍的肺組織解凍并在補(bǔ)充0.5%牛血清白蛋白(BSA)(Kendall，LifelineMedicalInc.,Danbury，CT)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中用一次性組織研磨機(jī)勻漿。使用商業(yè)試劑盒(RNeasy⑧MiniKit,QIAGENInc.，Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明提取總的RNA并用60最終體積的緩沖液洗脫。還從自沒有呼吸系統(tǒng)疾病的狗收集的肺組織提取總RNA。實(shí)時(shí)RT-PCR使用含有ROX作為被動(dòng)參考染料的QuantiTectProbeRT-PCR試劑盒(QIAGENInc.，Valencia,CA)，對(duì)從犬組織樣品提取的總RNA進(jìn)行一步定量實(shí)時(shí)RT-PCR。簡(jiǎn)言之，兩個(gè)引物-探針組用于檢測(cè)每種樣品中的甲型流感序列(表7)。一個(gè)引物-探針組對(duì)于犬血凝素(113)基因序列是選擇性的。另一個(gè)引物-探針組靶定甲型流感病毒的基質(zhì)(M)基因的高度保守區(qū)。對(duì)于每個(gè)實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)，向含有12.5pL2XQuantiTechProbeRT-PCRMasterMix,0.25|LiLQuantiTechRTMix,正向和反向引物(每種0.4^M終濃度)，探針(0.1|uM終濃度)和無RNA酶的水的反應(yīng)混合物中加入5|aL提取的總RNA，最終體積為25|aL。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，用TaqManRibosomalRNAControlReagents(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)檢測(cè)18SrRNA,其作為從犬組織樣品提取的RNA的存在的內(nèi)源性內(nèi)部對(duì)照。在Mx3000PQPCR系統(tǒng)(Stratagene，LaJolla，CA)中對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行定量一步實(shí)時(shí)RT-PCR。循環(huán)條件包括50°C30分鐘的逆轉(zhuǎn)錄步驟，95。C15分鐘以激活HotStarTaqDNA聚合酶的最初變性步驟，和40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)包括94'C變性15秒，接著60'C下退火/延伸1分鐘。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)記錄FAM(發(fā)射波長(zhǎng)518nm)和VIC(發(fā)射波長(zhǎng)554nm)熒光信號(hào)。通過在每個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中設(shè)置閾值熒光(dR)為1000,確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。用Mx3000P⑧版本2.0軟件程序(Stratagene，LaJolla，CA)進(jìn)行數(shù)椐采集和分析。當(dāng)H3或者M(jìn)基因的閱值循環(huán)(Ct)比來自沒有呼吸系統(tǒng)疾病的狗的肺組織的Ct小3個(gè)單位時(shí)，認(rèn)為樣品是甲型流感病毒陽性的。陽性對(duì)照由從A/canine/FL/242/03(H3N8)病毒提取的RNA的擴(kuò)增組成。MDCK細(xì)胞中的病毒分離解凍來自7只狗的每一只的冷凍的肺組織并在10倍體積的補(bǔ)充0.5%(BSA)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中勻漿。離心除去固體殘?jiān)⑸锨逡航臃N到在補(bǔ)充1ng/mLTPCK-處理的胰蛋白酶(Sigraa-AldrichCorp"St.Louis,MO)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的DMEM中培養(yǎng)的Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞上。細(xì)胞在含有5%C02的濕潤(rùn)空氣中37。C下在25cn^瓶中生長(zhǎng)。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)改變并在接種后5天收獲。通過離心澄清收獲的培養(yǎng)物并如對(duì)于最初接種所述的將上清液接種到新鮮的MDCM細(xì)胞上；對(duì)通過血細(xì)胞凝集或者RT-PCR沒有顯示流感病毒證據(jù)的樣品進(jìn)行兩次額外的傳代。使用0.5。/o火雞細(xì)胞如以前描述(Burleson，F(xiàn)."aZ.，1992;Kendal，P.""A,1982)的測(cè)定澄清的上清液中的血細(xì)胞凝集活性。如下述進(jìn)行RT-PCR。含胚的雞蛋中的病毒分離如上文關(guān)于MDCK細(xì)胞的接種所述的從冷凍的肺組織制備勻漿。將勻漿(0.2niL)接種到10天齡含胚的雞蛋的尿膜嚢中。在35。C培育48小時(shí)后，在4。C過夜冷凍雞蛋，然后收獲尿嚢液。使用0.5。/。火雞血紅細(xì)胞如以前描述的(Burleson，F(xiàn).Ca/.，1992;Kendal，P.Wa/.，1982)測(cè)定澄清的上清液中的血細(xì)胞凝集活性。如下文描述的進(jìn)行RT-PCR。對(duì)最初接種后沒有顯示出流感病毒證據(jù)的樣品用含胚的蛋進(jìn)行兩次額外傳代。RT-PCR、核普酸測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化分析使用QIAampViralRNAMini試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從MDCK上清液或者尿嚢液提取病毒RNA。使用QIAGENOneStepRT-PCR試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。如以前描述的(Klimov，A.1992b)，使用通用的基因特異性引物組(根據(jù)請(qǐng)求可以得到引物序列)進(jìn)行cDNA中8種流感病毒基因的編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增。所得的DNA擴(kuò)增子用作ABIPRISM3100自動(dòng)化DNA測(cè)序4義中自動(dòng)化測(cè)序的才莫板，使用循環(huán)測(cè)序染料終止化學(xué)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。使用Lasergene6Package(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)分析核苦斷列。用PHYLIP版本3.5@軟件程序從核苷酸序列估計(jì)系統(tǒng)發(fā)生和計(jì)算自展值(Felsenstein，J.，1989)。將系統(tǒng)樹與用MEGA程序(Kumar,S."2004)中實(shí)現(xiàn)的Tamura-Nei模型進(jìn)行的近鄰連接分析產(chǎn)生的系統(tǒng)樹相比較，并通過PAUP4.0Beta程序(SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA)證實(shí)。血細(xì)胞凝集抑制(HI)測(cè)定將血清樣品與受體破壞酶(RDE，DENKASEIKENCo.，Ltd.,Tokyo,Japan)(1份血清3份RDE)在37。C溫育16小時(shí)，然后在56。C熱失活30分鐘。流感A/Canine/Jacksonville/05(H3N8)病毒在37。C下5%C02中在MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)72小時(shí)。收獲病毒培養(yǎng)上清液，通過離心澄清，并在-80'C保存。HI測(cè)定中使用的所有其他病毒都生長(zhǎng)在10天齡的含胚的雞蛋中，從其收集尿嚢液并在-80。C保存。如以前描述的(Kendal,P."a/.，1982)進(jìn)行HI測(cè)定。簡(jiǎn)言之，向96孔塑料板中等體積的連續(xù)稀釋的血清中加入25^14凝血單位的病毒并在室溫下溫育30分鐘。加入等體積的0.5%火雞紅細(xì)胞并在30分鐘后通過視覺估計(jì)血細(xì)胞凝集效價(jià)。將終點(diǎn)HI效價(jià)定義為完全抑制血細(xì)胞凝集的血清的最后稀釋度。實(shí)施例7—臨床病例在2005年4月和5月，在佛羅里達(dá)東北部的收容所中喂養(yǎng)的狗中發(fā)生了以前描述的呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)(Crawford，P.C."fl/.，2005)。該爆發(fā)涉及3個(gè)月至9歲年齡的至少58條狗，并且包括純種狗以及雜種狗。最常見的臨床病征是膿性鼻分泌物和咳嗽7到21天。在具有臨床疾病^7天的43條狗中，41條對(duì)canine/FL/04(H3N8)的HI抗體效價(jià)為32到>1024。至少10條狗發(fā)展成肺炎，其中6條被實(shí)施安樂死。這6條雜種狗包括3條雄性和3條雌性，年齡為4個(gè)月到3歲。在安樂死時(shí)臨床病征的持續(xù)時(shí)間為2到10天。在尸體剖檢時(shí)，這些狗具有肺充血和水肺。對(duì)呼吸道的組織學(xué)檢查揭示了鼻炎、氣管炎、支氣管炎、細(xì)支氣管炎和化膿性支氣管肺炎。在氣管、支氣管、細(xì)支氣管和支氣管腺中存在上皮細(xì)胞壞死和糜爛。呼吸系統(tǒng)組織被嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。在2005年5月，在佛羅里達(dá)東南部的一個(gè)獸醫(yī)診所中40條寵物狗中發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)。最常見的臨床病征是膿性鼻分泌物和咳嗽10到30天。在40條狗中，17條對(duì)于canine/FL/04(H3N8)是血清陽性的，HI抗體效價(jià)范圍為32到>1024。在可以得到配對(duì)的急性和恢復(fù)期血清的10條狗中發(fā)生了血清轉(zhuǎn)變。三條狗發(fā)展為肺炎。一條狗為9歲的雄性YorkshireTerrier,在臨床病征發(fā)作后3天死亡。該狗具有氣管支氣管炎、肺水腫和充血，和嚴(yán)重的支氣管肺炎。類似于6條收容所的狗，在組織中有上皮細(xì)胞壞死和氣道糜爛和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)施例8—實(shí)時(shí)RT-PCR和病毒分離通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法分析來自7條狗的肺組織，所述測(cè)定法檢測(cè)甲型流感的M基因和犬H3N8甲型流感病毒的H3基因。來自所有7條狗的肺對(duì)于甲型流感M基因和犬流感H3基因都是陽性的(表8)。在MDCK細(xì)胞中傳代3次后，從在肺炎3天后死亡的收容所狗的肺分離亞型H3N8病毒。該病毒稱作A/canine/JacksonviUe/05(H3N8)(canine/Jax/05)。在含胚的雞蛋中傳代2次后，從肺炎3天后也死亡的寵物狗的肺回收甲型流感亞型H3N8病毒。將該病毒稱作A/canine/Miami//05(H3N8)(canine/Miami/05)。實(shí)施例9一犬曱型流感H3N8分離群的遺傳學(xué)分析canine/Jax/05和canine/Miami/05的序列分析揭示它們的血凝素(HA)基因與從2004和2005年賽場(chǎng)的流感爆發(fā)期間死于肺炎的竟賽靈提的肺回收的canine/FL/04、canine/TX/04和canine/Iowa/05分離群具有98o/o同一性(Crawford，P.C."a/"2005;YoonK-Y."fl,.，2005)。此外，canine/Jax/05和canine/Miami/05的HA基因與2000年后分離的同時(shí)代馬流感病毒有98%同一性。HA基因的系統(tǒng)發(fā)生比較表明canine/Jax/05和canineZMiami/05病毒與canine/FL/04、canine/TX/04和canine/Iowa/05靈提分離群和同時(shí)代的馬分離群聚類，形成與20世紀(jì)卯年代早期分離的較早的馬病毒不同的組(圖4)。此夕卜，canine/Jax/05、canine/Miami/05和canine/Iowa/05分離群與canine/Tx/04比對(duì)canine/FL/04或canine/FL/03更接近。2005年分離群形成了一個(gè)亞組，其似乎與較早的2003和2004犬病毒分叉，在約10個(gè)筒約信息位點(diǎn)具有差異。這些差異支持如下假說，即犬流感病毒在狗與狗之間水平傳播，而不是從外部來源定期地再次輸入。從2003到2005年的突變積累表明病毒被傳播到新的宿主后必須經(jīng)歷的正在進(jìn)行的適應(yīng)過程，如對(duì)犬流感病毒預(yù)期已經(jīng)發(fā)生。實(shí)施例10—犬曱型流感病毒H3N8分離群的氨基酸分析在所有6種犬分離群中都有保守氨基酸替代，其使得它們與同時(shí)代的馬流感病毒不同(表9)。這些保守替代是I15M、N83S、W222L、I328T和N483T。成熟HA蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)生比較表明canine/Jax/05、canine/Miami/05和canine/Iowa/05病毒與canine/TX/04分離群形成一個(gè)亞組(圖4)。有3個(gè)氨基酸改變(L118V、K261N和G4"E)使得該亞組與其他犬病毒不同(表9)。有兩個(gè)氨基酸改變(F79L和G218E)，其使得2005分離群與它們的canine/TX/04才艮不同。此外，來自非靈提狗的2005分離群canine/Jax/05和canine/Miami/05與canine/Iowa/05靈提分離群有一個(gè)氨基酸改變R492K而不同。最后，canine/Jax/05與canine/Miami/05的差別是一個(gè)氨基酸S107P。在所有其他H3N8馬和犬病毒中，S在107位保守，但是A/Equine/Jilin/1/89除外，其具有T(GuoY."1992)。實(shí)施例11—犬曱型流感H3N8分離群的抗原分析使用較早的和同時(shí)代的馬流感病毒和犬流感病毒的血清組，和在2005年從感染流感病毒的馬和狗收集的血清進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制(HI)試驗(yàn)(表10)。在該分析中還包括來自對(duì)canine/FL/04免疫的白鼬的血清。當(dāng)用同時(shí)代的馬病毒測(cè)試時(shí)，馬血清中HI抗體效價(jià)比以前的分離群高8到16倍，但是當(dāng)用犬病毒測(cè)試時(shí)降低至少4倍。犬血清不與較早的馬病毒反應(yīng)，但是當(dāng)用同時(shí)代的馬分離群和犬分離群測(cè)試時(shí)，抗體效價(jià)增加4倍。該結(jié)果也在來自對(duì)犬流感病毒免疫的白鼬的血清中觀察到。這些血清反應(yīng)性模式表明犬流感病毒和同時(shí)代的馬流感病毒之間的抗原相似性，并且與系統(tǒng)發(fā)生分析相一致。抗canine/Miami/05分離群的馬、犬和白鼬血清中的抗體效價(jià)與2003和2004白鼬分離群的那些相似。然而，canine/Jax/05分離群的效價(jià)低2到4倍。這提示canine/Jax/05在抗原上與其他犬分離群不同，這可能與成熟HA中107位的單個(gè)氨基酸改變部分有關(guān)。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>表8.對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)期間，在佛羅里達(dá)的收容所和獸醫(yī)診所死于肺炎的狗的肺組織進(jìn)行的定量實(shí)時(shí)RT-PCR和病毒分離<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>表9.犬流感病毒和同時(shí)代的馬流感病毒的成熟HA的氨基酸比較<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>表IO.抗早期和同時(shí)代的馬流感病毒和犬流感病毒的馬、犬和白鼬血清中的抗體效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>a在用抗原欄中所列出的馬、犬或者白鼬血清和病毒進(jìn)行的血細(xì)胞凝集抑制測(cè)定中測(cè)定的抗體效價(jià)。b來自用canine/FL/04病毒免疫的血清。實(shí)施例12-15的材料和方法犬流感病毒接種物通過用代表以前描述的(Crawford"2005)最初分離群的第3代的A/canine/FL/43/04(H3N8)原種接種Madin-Darby犬腎(MDCK)上皮細(xì)胞，制備病毒接種物。在補(bǔ)充ljig/mLTPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中接種的MDCK細(xì)胞在含有5%C02的濕潤(rùn)空氣中37。C下生長(zhǎng)在250cir^培養(yǎng)瓶中。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)改變并在接種后5天收獲。通過離心澄清收獲的培養(yǎng)物并在接種狗之前將上清液在-80'C保存。用上清液的等分試樣通過Reed和Muench方法測(cè)定病毒效價(jià)。效價(jià)為107半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCIDso)的A/canine/Florida/43/04(canine/FL/04)/mL。實(shí)驗(yàn)接種8條4個(gè)月齡的colony品種的雜種狗(MarshallBioResources，NorthRose，NY)(4條雄性和4條雌性)用于佛羅里達(dá)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)接種研究。狗的體重為13到17kg。在接種前，根據(jù)體檢、基線血試驗(yàn)和記錄體溫兩周，發(fā)現(xiàn)狗是健康的。根據(jù)對(duì)在到達(dá)實(shí)驗(yàn)室之時(shí)和2周后收集的配對(duì)血清樣品進(jìn)行的血清學(xué)試驗(yàn)，所有狗以前都沒有接觸犬it感病毒。通過靜樂K內(nèi)注射異丙酚(Diprivan⑧，ZenecaPharmaceuticals,0.4mg/kg體重以生效)麻醉狗以用氣管內(nèi)管插管。6條狗(3條雄性和3條雌性)每條接種5mL無菌鹽水中的107TCID5Qcanine/FL/04病毒，通過插入到氣管內(nèi)插管的小直徑橡膠導(dǎo)管將所述病毒施用于氣管遠(yuǎn)端。兩條狗(l條雄性和1條雌性)用等體積的無菌鹽水假接種。假接種的對(duì)照狗與接種病毒的狗關(guān)在不同的房間內(nèi)并且由不同的工作人員照料。每天進(jìn)行兩次體檢和直腸溫度記錄，直到接種后6天(p丄)。咽和直腸拭子采集為了監(jiān)視病毒脫落，在接種后0到6天，使用聚酯拭子(FisherScientificInternationalInc.,Pittsburgh,PA)從每條狗每天兩次收集口咽樣品。將子置于含有0.5。/o牛血清白蛋白(BSA)的1mL無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)中。從第0到6天每天從每條狗收集直腸拭子。通過離心澄清拭子運(yùn)送培養(yǎng)液，制備拭子提取物。使用DirectigenTM商業(yè)免疫測(cè)定試劑盒(BD，F(xiàn)ranklinLakes,NJ)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，對(duì)拭子提取物的等分試樣立即測(cè)試甲型流感病毒核蛋白。剩佘的提取物在-80。C保存?zhèn)溆糜谄渌牟《緦W(xué)測(cè)定。尸體剖檢在接種后第1天，通過靜脈內(nèi)接種Beuthanasia-D⑧溶液(1mL/5kg體重；Schering-PloughAnimalHealthCorp)，對(duì)一條j艮接種的狗和一條病毒接種的狗實(shí)施安樂死。從接種后第2到第5天，每天對(duì)一條病毒接種的狗類似地實(shí)施安樂死。在接種后第6天，對(duì)剩下的假接種的和病毒接種的狗實(shí)施安樂死。由研究人員(WLC)之一進(jìn)行完全的尸體剖檢。將組織用10%中性緩沖的福爾馬林固定，石蠟包埋，并對(duì)5卞m切片用蘇木精和伊紅染色用于組織病理學(xué)診斷或者處理用于如下文所述的免疫組織化學(xué)。將未固定的肺組織送到佛羅里達(dá)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的診斷臨床微生物學(xué)/寄生蟲學(xué)/血清學(xué)處(DiagnosticClinicalMicrobiology/Parasitology/SerologyService)用于細(xì)茵分離和鑒定。在非選擇性培養(yǎng)基以及選擇博德特氏菌(^7^/^//)種(Regan-Lowe;Remel，Lenexa，KS)和支原體(Af戸盧s歸)種(Remel)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)樣品。在報(bào)告無生長(zhǎng)前，所有培養(yǎng)物都保持了21天。在病毒學(xué)分析之前，未固定的組織也在-80。C保存。免疫組織化學(xué)將脫石蠟并再水化的5卞m氣管和肺組織切片封固在Bond-RiteTM載玻片(Richard-AllanScientific,Kalamazoo,MI)上并隨后用蛋白酶K(DAKOCytomationInc.,Carpenteria,CA)處理，接著用過氧化物酶封閉試劑(DAKO⑧EnVisionTMPeroxidaseKit,DAKOCorp.,Carpenteria,CA)處理。將切片用抗甲型流感H3的單克隆抗體(ChemiconInternational,Inc.,Ternecula，CA)的l:500稀釋液在室溫下溫育2小時(shí)。對(duì)照包括用小鼠IgG(lmg/mL，Serotec，Inc.Raleigh,NC)溫育相同的切片，和使用正常的犬肺切片與單克隆抗體溫育。用一級(jí)抗體處理后，將切片與二級(jí)免疫過氧化物酶和過氧^b物酶底物試劑(Dako⑧EnVisionTMPeroxidaseKit,DakoCorp.)才艮據(jù)生產(chǎn)商的使用說明處理。將切片用蘇木精復(fù)染，用Clarifier#2和Bluing試劑(Richard-AllanScientific,Kalamazoo,Ml)處理，脫水，并用Permount(ProSciTech，Queensland,Australia)蓋片。來自拭子和組織的RNA提取物將來自每條狗的肺和氣管組織解凍并在補(bǔ)充0.5。/。牛血清白蛋白(BSA)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中，使用一次性組織研磨機(jī)(Kendall，LifelineMedicalInc.,Danbury，CT)勻漿。使用商業(yè)試劑盒(RNeasy⑧MiniKit,QIAGENInc.,Valencia,CA),根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從組織勻漿以及咽和直腸拭子提取物提取總RNA并用最終體積60的緩沖液洗脫。實(shí)時(shí)RT-PCR使用QuantiTectProbeRT畫PCR試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)和引物-探針組對(duì)總的RNA進(jìn)行一步定量實(shí)時(shí)RT-PCR，該試劑盒含有作為被動(dòng)參照染料的ROX，所述引物-探針組靶定曱型流感病毒的基質(zhì)(M)基因的高度寸呆守區(qū)(PayungpornS.Wfl/.，2006a;PayungpornS.a/.，2006b)。對(duì)于每次實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)，向含有12.5|iL2XQuantiTechProbeRT-PCRMasterMix,0.25|LiLQuantiTechRTMix,正向和反向引物(每種終濃度0.4|_iM)，探針(O.liaM終濃度)和無RNA酶的水的反應(yīng)混合物中加入5jaL提取的總RNA,終體積為25pL。使用TaqManGAPDHControlReagents(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)才艮據(jù)生產(chǎn)商的4吏用說明檢測(cè)GAPDH,其作為從拭子和組織樣品提取的RNA存在的內(nèi)源性內(nèi)部對(duì)照和作為歸一化對(duì)照。對(duì)Mx3000PQPCR系統(tǒng)(Stratagene，LaJolla，CA)中的反應(yīng)混合物進(jìn)行定量一步實(shí)時(shí)RT-PCR。循環(huán)條件包括50°C30分鐘的反轉(zhuǎn)錄步驟，95°C15分鐘以活化HotStarTaqDNA聚合酶的最初變性步驟，和40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)包括94。C變性15秒，接著60'C下退火/延伸1分鐘。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)記錄FAM(發(fā)射波長(zhǎng)518nm)和VIC(發(fā)射波長(zhǎng)554nm)熒光信號(hào)。通過在每個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中設(shè)置閾值熒光(dR)為1000，確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。用Mx3000P⑧版本2.0軟件程序(Stratagene，LaJolla，CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。陽性對(duì)照由從A/canine/FL/242/03(H3N8)病毒提取的RNA的擴(kuò)增《且成。對(duì)于每個(gè)樣品，通過將MCt值除以對(duì)應(yīng)的GAPDHCt值對(duì)結(jié)果歸一化。從組織再次分離病毒解凍來自接種病毒的狗的冷凍的肺和氣管組織并在10倍體積的補(bǔ)充0.5。/。(BSA)和抗生素的DMEM中勻漿。離心除去固體殘?jiān)⑸锨逡航臃N到在補(bǔ)充lng/mLTPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO)和如上述抗生素的DMEM中培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞上。細(xì)胞在含有5%C02的濕潤(rùn)空氣中37。C下在25112瓶中生長(zhǎng)。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)改變并在接種后5天收獲。通過離心澄清收獲的培養(yǎng)物并如對(duì)于最初接種所述的將上清液接種到新鮮的MDCM細(xì)胞上；對(duì)通過血細(xì)胞凝集或者RT-PCR沒有顯示流感病毒證據(jù)的樣品進(jìn)行兩次額外的傳代。使用0.5%火雞細(xì)胞如以前描述(CrawfordWa/.，2005)的測(cè)定經(jīng)澄清的上清液中的血細(xì)胞凝集活性。如下述進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR、核苷酸測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化分析使用QIAampViralRNAMini試劑盒(QIAGENInc"Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從MDCK上清液提取病毒RNA。使用QIAGENOneStepRT-PCR試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。如以前描述的(Crawford"fl/.，2005),使用通用的基因特異性引物組(根據(jù)請(qǐng)求可以得到引物序列)進(jìn)行cDNA中8種流感病毒基因的編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增。所得的DNA擴(kuò)增子用作ABIPRISM3100自動(dòng)化DNA測(cè)序儀中自動(dòng)化測(cè)序的模板，使用循環(huán)測(cè)序染料終止化學(xué)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。使用Lasergene6Package(DNASTAR，Inc.,Madison,WI)分析核苷酸序列。將從受感染的狗回收的病毒的核苷酸序列與接種物中病毒的序列比較以確定在呼吸道中復(fù)制期間是否已經(jīng)發(fā)生了改變。實(shí)施例12—臨床疾病所有6條接種病毒的狗在接種后前2天都產(chǎn)生了暫時(shí)發(fā)熱(直腸溫度S39。C),但是沒有一只在6天的觀察期內(nèi)顯示出呼吸系統(tǒng)病征如咳嗽或者鼻'弟。假接種的狗保持臨床上健康。實(shí)施例13—病毒脫落對(duì)接種后24小時(shí)從一條接種病毒的狗收集的口咽拭子檢測(cè)甲型流感核蛋白。通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR，在接種后72、84和120小時(shí)從一條狗和接種后108、120和132小時(shí)從另一條狗收集的口咽拭子是病毒陽性的(表11)。每拭子提取物中流感M基因拷貝的絕對(duì)數(shù)目從接種后第3天到第6天隨時(shí)間增加。在直腸拭子中沒有檢測(cè)到病毒。實(shí)施例14一尸體剖檢與以前使用特定無病原體的小獵兔犬的實(shí)驗(yàn)感染(CrawfordWfl/.，2005)相比，接種病毒的雜種狗患有肺炎，如通過來自接種后1到6天的肺的總體的和組織學(xué)分析所證明。除了肺炎外，狗還患有類似于自然感染的狗中所描述的鼻炎、氣管炎、支氣管炎和細(xì)支氣管炎(CrawfordWd，2005)。在呼吸道和支氣管腺層中存在上皮壞死和糜爛，在粘膜下層組織中有嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5,上圖)。免疫組織化學(xué)在支氣管、細(xì)支氣管和支氣管腺的上皮細(xì)胞中檢測(cè)到病毒H3抗原(圖5，下圖)。不存在細(xì)菌超感染。來自2條假接種的狗的呼吸系統(tǒng)組織是正常的。實(shí)施例15-氣管和肺中的病毒復(fù)制通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR,從接種后第1天到第6天，所有狗中的氣管和肺都是病毒陽性的(表12)。每jiL氣管勻漿的流感M基因拷貝的絕對(duì)數(shù)目從接種后第1天到第5天增加，然后在第6天下降。每nL肺勻漿的M基因拷貝的絕對(duì)數(shù)目從接種后第l天到第6天下降。通常，在接種后6天的每天，氣管舍有比肺多^llogw的病毒。表ll.通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)用犬流感病毒接種的雜種狗的口咽中的病毒脫落<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>a用A/canine/FL/43/04(H3N8)病毒接種后從狗收集口咽拭子的時(shí)間。b通過將M(Ct)除以每個(gè)拭子提取物的GAPDH(Ct)計(jì)算歸一化比。c每nL拭子提取物的基質(zhì)基因拷貝的絕對(duì)數(shù)目。表12.通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)用犬流感病毒接種的雜種狗的氣管和肺中病毒復(fù)制<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>用A/caniiie/FL/43/04(H3N8)病毒接種后從狗收集組織的時(shí)間。通過將M(Ct)除以每個(gè)組織勻漿的GAPDH(Ct)計(jì)算歸一化比。c每pL組織勻漿的基質(zhì)基因拷貝的絕對(duì)數(shù)目。實(shí)施例16的材料和實(shí)施例方法病毒毒林在含胚的卵或者M(jìn)DCK細(xì)胞中增殖犬流感病毒毒抹以及鳥、馬和人來源的那些流感病毒毒林(表15中所列)，并通過雞胚中的終點(diǎn)稀釋或者噬斑測(cè)定法滴定它們的感染力。使用火雞血紅細(xì)胞通過血細(xì)胞凝集測(cè)定法進(jìn)行快速病毒定量。診斷樣品對(duì)2005年期間病毒呼吸系統(tǒng)疾病的疑似病例收集的共60條犬的肺組織測(cè)試犬流感病毒的存在。從犬組織樣品提取RNA將重量為20到30mg的肺組織塊在一次性組織研磨機(jī)(Kendal)中勻漿。按照生產(chǎn)商的推薦，使用商業(yè)試劑盒(RNeasyMiniKit,Qiagen，Valencia,CA)提取總RNA并用終體積60|iL稀釋。引物和探針設(shè)計(jì)使用CLUSTALX程序(版本1.8)進(jìn)行來自多種亞型和來自多種物種的H3和M基因的多序列比對(duì)。從對(duì)應(yīng)于曱型流感病毒的不同亞型的已知序列的保守區(qū)選擇基質(zhì)(M)引物和探針，而選擇H3血凝素基因特異引物和探針組以特別匹配馬和犬甲型流感病毒基因和錯(cuò)配同源的鳥和人基因(表13)。用引物設(shè)計(jì)軟件(OLIGOS版本9.1)和EXIQON(http:yVlnatools.com、提供的基于網(wǎng)絡(luò)的分析工具進(jìn)行Tm計(jì)算和預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及自身雜交。18SrRNA基因的保守區(qū)用作從犬組織樣品的提取的RNA的存在的內(nèi)源性內(nèi)部對(duì)照。Pre誦DevelopedTaqManAssayReagentsforEukaryotic18SrRNA(VIC/TAMRA)(AppliedBiosystems)用于實(shí)時(shí)檢測(cè)組織樣品中的18SrRNA。實(shí)時(shí)RT-PCR條件通過使用含有作為被動(dòng)參照染料的ROX的QuantitectProbeRT-PCR試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)進(jìn)行一步實(shí)時(shí)RT-PCR。在每次實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)中，5|iLRNA樣品用作模板與反應(yīng)混合物組合，所述反應(yīng)混合物含有10juL2XQuantiTechProbeRT曙PCRMasterMix,0.2fiLQuantiTechRTMix,引物(0.4終濃度的H3基因或者0.6終濃度的M基因)，探針(0.1|iM終濃度的H3基因或者0.2終濃度的M基因)和無RNA酶的水，最終體積為20pL。在Mx3005PReal-TimeQPCR系統(tǒng)(Stratagene)中進(jìn)行一步實(shí)時(shí)RT-PCR。循環(huán)條件包括50°C30分鐘的反轉(zhuǎn)錄步驟。95°C15分鐘以便活化HotStarTaqDNA聚合酶的初步變性步驟后，在40個(gè)循環(huán)中進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括變性(94。C15秒)和退火/延伸(6(TC30秒)。在每個(gè)循環(huán)延伸步驟結(jié)束時(shí)得到FAM(發(fā)射波長(zhǎng)516nm,用于H3和M檢測(cè))和VIC(發(fā)射波長(zhǎng)555nm,用于18SrRNA檢測(cè))熒光信號(hào)一次。使用Mx3005P軟件版本2.02(Stratagene)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測(cè)定的數(shù)據(jù)采集和分析。H3引物/探針組對(duì)于犬流感(H3N8)的特異性和M引物/探針組對(duì)于甲型流感病毒的通用性為了測(cè)試每種31物/探針組的特異性，從甲型流感病毒的幾種已知的亞型提取的RNA用作實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定中的模板(表15)。用于確定實(shí)時(shí)RT-PCR性能的RNA標(biāo)準(zhǔn)通過使用與T7啟動(dòng)子連接的引物，用犬甲型流感病毒(A/canine/Florida/242/2003(H3N8))的基因產(chǎn)生H3(nt1-487)和M(ntl-276)的PCR擴(kuò)增子(表13)。然后通過4吏用Riboprobe體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)-T7(Promega)，按照生產(chǎn)商的推薦，將H3和]M基因的純化的PCR擴(kuò)增子用作體外轉(zhuǎn)錄的模板。通過測(cè)量260nm的吸光度計(jì)算所轉(zhuǎn)錄的RNA的濃度。然后將RNA連續(xù)稀釋10倍，從108到10個(gè)拷貝/pL以進(jìn)行靈敏度測(cè)試。此外，通過將最初的RNA模板濃度(拷貝/nL)的對(duì)數(shù)對(duì)為每次稀釋得到的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)作圖產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便確定實(shí)時(shí)RT-PCR的總體性能。實(shí)時(shí)RT-PCR和DirectigenFluA測(cè)試試劑盒之間的比較靈敏度測(cè)試將包括106'67EID5o/mL(HA-64)的A/Wyoming/3/2003(H3N2)和107'17EID5o/mL(HA^^16)的A/canine/Florida/242/2003(H3N8)的兩種病毒毒林的原種病毒用于檢測(cè)閾值測(cè)定法。按照生產(chǎn)商的使用說明，在快速甲型流感病毒抗原、檢觀'J試劑盒DirectigenFluA，(Becton，DickinsonandCompany)中使用磷酸緩沖鹽水(PBS)(125pL)中樣品的對(duì)數(shù)稀釋度。每個(gè)DirectigenFluA測(cè)試裝置在膜中央具有一個(gè)H1N1流感抗原點(diǎn)，其顯影為紫色點(diǎn)并且指出該測(cè)試的完整性，該測(cè)試是基于抗核蛋白(NP)的單克隆抗體。在所述點(diǎn)周圍紫色三角形的顯影表明在測(cè)試的樣品中存在流感NP。將來自三角形的紫色信號(hào)的強(qiáng)度打分為+(三角形輪廓)，++(淺色三角形)，+++(深紫色三角形)和++++(極深紫色三角形)。使用QIAampViralRNAMini試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)從每種病毒稀釋液的125jaL等分試樣提取病毒RNA并以最終體積50稀釋。通過實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)試5uL體積提取的病毒RNA用于與DirectigenFluA試劑盒的比較靈敏度測(cè)試。實(shí)施例16犬流感病毒的實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定依賴于來自三種分子探針的信息，所述探針華巴定來自宿主細(xì)胞的18SrRNA以及來自甲型流感病毒基因組的M和H3(表14)。宿主基因的擴(kuò)增報(bào)告樣品質(zhì)量和完整性。預(yù)期含有犬流感(H3N8)病毒的臨床的、尸體剖檢或?qū)嶒?yàn)室樣品用三種探針產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)。用M和18SrRNA探針產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)但是對(duì)于H3陰性的樣品將表明來自人、豬或者鳥來源的流感病毒亞型H3或者來自非H3亞型的流感病毒。這些罕見的情況可以通過RT-PCR解決，其使用HA通用引物以產(chǎn)生擴(kuò)增子cDNA,可以通過測(cè)序分析所述cDNA。適當(dāng)收集和處理的缺少曱型流感病毒的樣品僅僅產(chǎn)生18SrRNA擴(kuò)增信號(hào)。僅僅18SrRNA探針和H3探針產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)的情況表明有缺點(diǎn)的技術(shù)，除非證明相反；需要闡明使用M探針的假陰性或者對(duì)于H3的假陽性。最后，用這三種探針不能產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)的樣品表明有缺陷的樣品收集、降解、錯(cuò)誤的RNA提取或者存在PCR中使用的聚合酶的抑制劑。為了測(cè)試犬甲型流感病毒(H3N8)的H3引物"果針組的特異性和甲型流感的M引物/探4十組的通用性，通過實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)試甲型流感病毒的幾種亞型。結(jié)果表明H3引物/探針組僅僅用犬流感(H3N8)產(chǎn)生陽性擴(kuò)增信號(hào)。在其他亞型或者人H3毒林中沒有觀察到顯著的假陽性或者非特異性擴(kuò)增信號(hào)。M引物/4笨針組對(duì)測(cè)試的所有毒林產(chǎn)生了陽性擴(kuò)增信號(hào)(表15)。這些結(jié)果表明H3引物/探針特異檢測(cè)犬曱型流感病毒(H3N8)，而M引物/探針檢測(cè)甲型流感病毒的多種亞型。通過M和H3體外轉(zhuǎn)錄的RNA的終點(diǎn)稀釋評(píng)估實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法的性能。如所預(yù)期的，閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與RNA標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度以正相關(guān)增加?？梢栽贛和H3的分別低至103和102個(gè)拷貝"L的RNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度下檢測(cè)到焚光信號(hào)(圖6A和6B)。通過將起始RNA濃度的對(duì)數(shù)對(duì)從每個(gè)稀釋度得到的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)作圖，構(gòu)建M和H3基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6C和6D)。用標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率確定PCR反應(yīng)效率，其在理論上是指數(shù)的；100%擴(kuò)增效率將意味著每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增子濃度的加倍。具有約-3.1到-3.6之間斜率的標(biāo)準(zhǔn)曲線通常適于多數(shù)需要準(zhǔn)確定量的應(yīng)用(卯-110%反應(yīng)效率)。Rsq值是所有數(shù)據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的擬合。如果所有數(shù)據(jù)都精確地位于曲線上，那么Rsq將為l.OO。隨著數(shù)據(jù)從該曲線進(jìn)一步下降，Rsq降低。Rsq^).985是多數(shù)測(cè)定法可接受的。M標(biāo)準(zhǔn)曲線揭示了-3.576的斜率(效率=90.4%)和Rsq=1.00,而H3標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生了-3.423的斜率(效率=95.9%)和Rsq=0.999。這些值表明實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法的滿意的擴(kuò)增效率和總體性能。我們將M引物/探針組與H3引物/探針組相比較低的效率和靈敏度規(guī)因于M引物序列的N倍簡(jiǎn)并性，需要該筒并性來確保M基因序列變異性在多種亞型、宿主和語系的病毒之間的寬覆蓋度。還將實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法的靈敏度與商業(yè)的快速抗原檢測(cè)測(cè)定法(DirectigenFluA)相比較。用DirectigenFluA和通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析了A7Wyoming/3/2003(H3N2)和A/canine/Florida/242/2003(H3N8)的對(duì)數(shù)稀釋度。DirectigenFluA的結(jié)果表明對(duì)兩種病毒毒林的靈敏度為用于這些實(shí)驗(yàn)的原種病毒的約100倍稀釋度(圖7)。犬病毒(A/canine/Florida/242/2003:10"PFU/ml)樣品產(chǎn)生的信號(hào)(紫色)比在人病毒(A/Wyoming/3/2003:107'xPFU/ml)中發(fā)現(xiàn)的弱得多，與這些樣品中較低的病毒濃度相一致。備選地，犬流感的較低信號(hào)可以規(guī)因于單克隆抗體對(duì)NP的分子特異性；即在犬甲型流感病毒的NP表位中氨基酸的保守性很差。A/canine/Florida/242/2003和A/Wyoming/3/2003的每次反應(yīng)分別使用病毒10和30PFU當(dāng)量，M基因的實(shí)時(shí)RT-PCR產(chǎn)生了高于閾值的Ct值(表16)。兩種病毒毒抹的靈敏度值的差異是因?yàn)樽畛醯牟《镜味ǘ鹊牟煌?。沒有進(jìn)行犬和人流感病毒之間的H3基因檢測(cè)比較，是因?yàn)槲覀兊膶?shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定中的H3引物A果針唯一地?cái)U(kuò)增犬甲型流感病毒。RT-PCR比快速抗原檢測(cè)試劑盒靈敏105倍。為了評(píng)估RT-PCR測(cè)試在來自患有急性呼吸系統(tǒng)疾病的狗的尸體剖檢樣品中的性能，通過實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)試了在2005年送交的60個(gè)犬肺組織樣品中犬曱型流感病毒的存在。60個(gè)樣品中總共12個(gè)(20%)對(duì)于M和H3基因是陽性的，而剩下的48個(gè)樣品對(duì)于M和H3基因都產(chǎn)生了陰性結(jié)杲。通過蛋和MDCK細(xì)胞接種進(jìn)行病毒分離嘗試，以評(píng)估實(shí)時(shí)測(cè)定法的特異性；根據(jù)RT-PCR，12個(gè)樣品中對(duì)犬流感陽性的兩個(gè)樣品產(chǎn)生了犬流感病毒(數(shù)據(jù)未顯示，手稿準(zhǔn)備中)。盡管所有組織都從具有嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病史的狗中收集，^f旦是通過實(shí)時(shí)PCR或者常規(guī)分離，多數(shù)樣品都沒有產(chǎn)生犬流感病毒，提示其他呼吸系統(tǒng)病原體如支氣管博德特氏菌(5<^^&//^wic/t&卬,/cflO、犬瘟熱或者副流感病毒的高發(fā)生率。本文的一步實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法提供了犬甲型流感病毒(H3N8)檢測(cè)的快速、靈敏和劃算的方法。該疾病的早期中，犬甲型流感病毒(H3N8)感染的快速實(shí)驗(yàn)室診斷可以得到與臨床患者和設(shè)施管理相關(guān)的信息。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage113</formula>表14:實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法的解釋<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表16:<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表17.<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表18.<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表19.H3N8馬和犬流感病毒的PB2蛋白質(zhì)之間的氨基酸差異<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>*基于1963和1998年間分離的病毒的可利用的基因。表22.H3N8馬和犬流感病毒的NP蛋白質(zhì)之間的氨基酸差異<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>*基于1963和1998年間分離的病毒的可利用的基因。表25.H3N8馬和犬流感病毒的NS1蛋白質(zhì)之間的氬基酸差異<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>*基于1963和1998年間分離的病毒的可利用的基因。應(yīng)該理解本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于闡明目的，并且參照其的多種^f務(wù)飾或更改將是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的，并且包括在本申請(qǐng)的灃青神和范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)美國專利號(hào)5,106,739美國專利號(hào)5，034，322美國專利號(hào)6,455,760美國專利號(hào)6,696,623美國專利號(hào)4,683,202美國專利號(hào)4,683,195美國專利號(hào)4，800，159美國專利號(hào)4,965,188美國專利號(hào)5，994，056美國專利號(hào)6，814，9347>布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0040078841^^布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?00400675067>布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?00400199347>布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0030177536公布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0030084486z^布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0040123349GreyhoundDailyNews,1/28/99.NationalGreyhoundAssociation(NGA)，Abilene,Kansas.http:〃www.NGAgreyhounds.com.Personalcommunication,Dr.WilliamDuggar,veterinarianatPalmBeachKennelClub,WestPalmBeach,Florida.Altschul，S.F."a/.(1990)"BasicLocalAlignmentSearchTool"/M/.215:402-410.Altschul,S.F."a/.(1997)"GappedBLASTandPSI國BLAST:ANewGenerationofProteinDatabaseSearchPrograms"7Vwc/.25:3389-3402.An,G.(1987)"BinaryTivectorsforplanttransformationandpromoteranalysis',Me狄offc￡>12戸0/.153:292-305.Beltz,G.A.，Jacobs,K.A.，Eickbush,T.H.，Cherbas,P.T.,Kafatos,F.C.(1983)"Isolationofmultigenefamiliesanddeterminationofhomologiesbyfilterhybridizationmethods"</^E""z戸o/ogv,R.Wu,L.GrossmanandK.Moldave[eds.AcademicPress,NewYork100:266-285.Burleson,F."(1992)F/ra/<g>vJZ^6orfltofjMa腿fl/(AcademicPress》Byars，N.E.，A.C.Allison(1987)"Adjuvantformulationforuseinvaccinestoelicitbothcell-mediatedandhumoralimmunity"5:223-228.Crawford,P.C."(2005)"Transmissionofequineinfluenzavirustodogs"310:482-485.Chang,C.P.tf/.(1976)"InfluenzavirusisolationsfromdogsduringahumanepidemicinTaiwan"/Z/Zoo<s^3:61-64.Dacso，C.C."(1984)"Sporadicoccurrenceofzoonoticswineinfluenzavirusinfections"/C7/mM/m^V/20:833-835.deBoer，H.A"Comstock,LJ.，Vasser，M.(1983)"Thetacpromoter:afunctionalhybridderivedfromthetrpandlacpromoters"/Vw.Ato/./4cflfif.80(1):21國25.Felsenstein,J.(1989)C/"淑/cy5:164.Fields"a/.(1946)F/e/^yKZ/y/<s);，3rded"Lippincott-Ravenpublishers.Ford,R.B.,Vaden,S，L.(1998)"Canineinfectioustracheobronchitis"InD/yeos&sDogCW，2ndedition,C.E.Greene,editor,W.B.SaundersCo.,Philadelphia,PA，pp.33-38.FouchierC(2000)/owr"a/C7/"/cfl/M/m6zWogy38(11):4096-4101.Good,X.eZfl/.(1994)"ReducedethylenesynthesisbytransgenictomatoesexpressingS-adenosylinethioninehydrolase"尸/"w,A/o/ec.^/o/.26:781-7卯.Guan，Y."a/.(2004)"H5N1influenza:aproteanpandemicthreat"iVoc胸"c"rf5Wi/5"J101:8156-8161.Guo，Y."/(1992)"Characterizationofanewavian陽likeinfluenzaAvirusfromhorsesinChina"Wto/ow188:245-255.Houser，R.E./.(1980)"EvidenceofpriorinfectionwithinfluenzaA/Texas/77(H3N2)virusindogswithclinicalparainfluenza"CVm/Comp44:396-402.Karasin，A.I."fl/.(2000)"IsolationandcharacterizationofH4N6avianinfluenzavirusesfrompigswithpneumoniainCanada"/F/ra/74:9322-9327.KarlinS.andAltschul,S.F.(1990)"MethodsforAssessingtheStatisticalSignificanceofMolecularSequenceFeaturesbyUsingGeneralScoringSchemes"Prac.7V^/.爿cfldf/A487:2264-2268.KarlinS.andAltschul,S.F.(1993)"ApplicationsandStatisticsforMultipleHigh-ScoringSegmentsinMolecularSequences"iVarf./4cflrf.C/W90:5873-5877.Kawaoka，Y.Wa/.，(1989)"Avian-to-humantransmissionofthePBlgeneofinfluenzaAvirusesinthe1957and1968pandemics"JKz>o/63:4603-4608.Keawcharoen,J.fl/.(2004)"AvianinfluenzaH5N1intigersandleopards"五柳"g/"/e"Z)iy10:2189-2191.Kendal，A.P.""A(1982)InConceptsandProceduresforLaboratory-basedInfluenzaSurveillance.A.P.Kendal,M.S.Pereira，J.J.Skehel，Eds.(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,CentersforDiseaseControlandPreventionandPan-AmericanHealthOrganization,Atlanta,GA，UnitedStates)pp.B17-B35.Kilbourne,E.D.Ccr/.(1975)"DemonstrationofantibodiestobothhemagglutininandneuraminidaseantigensofH3N2influenzaAvirusindomesticdogs"Trtfe/r/ro/ogy6:315-318.Kimura，K."/.(1998)"Fatalcaseofswineinfluenzavirusinanimmunocompetenthost"M""C7Zw/Voc73:243-245.Klimov,A，I.fl/.(1992a)"Sequencechangesintheliveattenuated,cold-adaptedvariantsofinfluenzaA/Leningrad/134/57(H2N2)virus"186:795-797.KlimovA."a/.(1992b)"SubtypeH7influenzaviruses:comparativeantigenicandmolecularanalysisoftheHA-，M-，andNS-genes"j/r/iK/w/.122:143-161.Kovacova,A.Wfl/.(2002)"SequencesimilaritiesandevolutionaryrelationshipsofinfluenzavirusAhemagglutinins"(7￡^24:57-63.Kuiken,T."fl/.(2004)"AvianH5N1influenzaincats"5"c/e/ice306:241.Kumar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是稱作A/canine/Florida/43/04的病毒分離群或者稱作A/canine/Florida/242/2003的病毒分離群。7.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒是稱作canine/Jax/05的病毒分離群或稱作canine/Miami/05的病毒分離群。8.分離的多核苷酸，其包含權(quán)利要求l到7任一項(xiàng)的流感病毒的基因組區(qū)段或者基因的全部或者部分。9.才艮據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自神經(jīng)氨酸酶基因、核蛋白基因、基質(zhì)蛋白基因、聚合酶堿性蛋白基因、聚合酶酸性蛋白基因、非結(jié)構(gòu)蛋白基因、和血凝素基因的流感基因的全部或者部分。10.根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述流感病毒包含編碼具有SEQID隱2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列的多肽或者其功能和/或免疫原性片段的多核苷酸，或者所迷多核苷酸編碼與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的4壬一個(gè)中所示的氨基酸序列有99%或者更大的序列同一性的多肽。11.根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述流感病毒包含具有SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列的多核苷酸，或者所述多核苦酸與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的4壬一個(gè)中所示的核苷酸序列有98%或者更大的序列同一性。12.多核苷酸表達(dá)構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求8到ll任一項(xiàng)的多核苷酸。13.寡核苷酸，其可以與權(quán)利要求8到ll任一項(xiàng)的多核香酸的編碼或者非編碼序列雜交。14.根據(jù)權(quán)利要求13的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在高嚴(yán)格條件下與所述序列雜交。15，根據(jù)權(quán)利要求13的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長(zhǎng)為10到500個(gè)核苷酸、10到20個(gè)核苷酸、21到30個(gè)核苷酸、31到40個(gè)核苷酸、41到50個(gè)核苷酸、51到60個(gè)核苷酸、61到70個(gè)核苷酸、71到80個(gè)核苷酸、81到卯個(gè)4t苦酸或91到100個(gè)核苷酸。16.根據(jù)權(quán)利要求13的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含可檢測(cè)的標(biāo)記或者凈艮告分子。17.根據(jù)權(quán)利要求13的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與權(quán)利要求8的多核苷酸有約90°/。到100%的核苷酸序列同一性。18.根據(jù)權(quán)利要求13的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQIDNO:35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、79、80、81、82、83、84、85、86、87或88任一個(gè)中所示的核苷酸序列。19.權(quán)利要求8到ll任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的經(jīng)分離的多肽。20.根據(jù)權(quán)利要求19的多肽，其中所述多肽選自血凝素蛋白、神經(jīng)氨酸酶蛋白、核蛋白、基質(zhì)蛋白、聚合酶堿性蛋白、聚合酶酸性蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。21.包含權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的流感病毒的免疫原的組合物，其中所述免疫原能夠誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答，所述流感病毒能夠感染犬科動(dòng)物。22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其中所述免疫原包含無細(xì)胞的完整病毒，或者其部分；病毒多核苷酸；病毒蛋白；病毒多肽或者肽；病毒感染的細(xì)胞；基于重組病毒載體的構(gòu)建體；重排列病毒；或者所述病毒的棵核酸。23.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中所述病毒蛋白質(zhì)、多肽或者肽包含SEQID飾2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列或者其功能和/或免疫原性片段，或者所迷多核苷酸編碼與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基^列有99%或者更大的序列同一性的多肽。24.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中所述病毒多核苷酸編碼包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)中所示的M酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段。25.在動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的流感病毒的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對(duì)所述動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求21、22、23或24任一項(xiàng)的組合物。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述組合物包含病毒蛋白質(zhì)、多肽或者肽，或者其功能和/或免疫原性片段，所迷病毒蛋白質(zhì)、多肽或者肽包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)中所示的氨基酸序列。27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答，其預(yù)防或者阻止流感病毒對(duì)所述動(dòng)物的感染。28.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述流感病毒具有選自H3和H5的HA血清型。29.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述流感病毒具有血清型H3N8。30.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述組合物還包含佐劑。31.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述動(dòng)物是犬科動(dòng)物。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述犬科動(dòng)物是馴養(yǎng)的狗。33.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中腸胃外施用所述組合物。34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中皮下、腹膜內(nèi)或者肌內(nèi)施用所述組合物。35.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中經(jīng)鼻或者經(jīng)口施用所述組合物。36.分離的抗體，其特異結(jié)合權(quán)利要求19或20任一項(xiàng)的多肽的表位。37.根據(jù)權(quán)利要求36的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。38.根據(jù)權(quán)利要求36的抗體，其中所述抗體結(jié)合血凝素蛋白。39.根據(jù)權(quán)利要求38的抗體，其中所述血凝素蛋白是H3或者H5血凝素蛋白。40.根據(jù)權(quán)利要求38的抗體，其中所述血凝素蛋白包含SEQIDNO:16、SEQIDNO:32、SEQIDNO:62或SEQIDNO:78中所示的^J^酸序列。41.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的流感病毒或者權(quán)利要求8的多核苷酸。42.根據(jù)權(quán)利要求41的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是犬科動(dòng)物細(xì)胞。43.檢測(cè)能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒的方法，所述方法包括從動(dòng)物得到生物樣品，并對(duì)所述樣品篩選結(jié)合權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的流感病毒的蛋白質(zhì)、多肽或者肽的抗體或者配體的存在。44.檢測(cè)能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒的方法，所述方法包括從動(dòng)物得到核酸樣品，并將所述核酸樣品與根據(jù)權(quán)利要求13到18任一項(xiàng)的寡核苷酸接觸，并確定所述寡核苷酸在嚴(yán)格條件下是否與所述核酸雜交。45.篩選對(duì)能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒具有抗病毒活性的化合物的方法，所述方法包括將用權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的病毒感染或者包含所述病毒的細(xì)胞與受試化合物接觸，并確定所述受試化合物是否抑制所述病毒在所述細(xì)胞中的活性。46.重排列病毒，其包含權(quán)利要求1的流感病毒的至少一種基因、基因組區(qū)^:或者多核苷酸。47.分離的病毒，其包含一種或多種多核苦酸，其中所述一種或多種多核普酸編碼選自HA、NA、NP、MA、PB1、PB2、PA和NS的犬科動(dòng)物流感病毒蛋白質(zhì)，或者其功能或者免疫原性片段。48.根據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所述一種或多種多核苷酸包含選自SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75和77的核普酸序列。49.根據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所述HA蛋白質(zhì)具有選自SEQIDNO:16、32、62和78的氨基,列。50.根據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所述NA蛋白質(zhì)具有選自SEQIDNO:12、28、58和74的氨基,列。51.根據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所述NP蛋白質(zhì)具有選自SEQIDNO:10、26、56和72的氨基齡列。52.根據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所述MA蛋白質(zhì)具有選自SEQIDNO:14、30、60和76的J^^Jf列。53.根據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所迷PB1蛋白質(zhì)具有選自SEQIDNO:4、20、50和66的#^#列。54.根據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所述PB2蛋白質(zhì)具有選自SEQIDNO:2、18、48和64的氨基斷列。55.根據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所述PA蛋白質(zhì)具有選自SEQIDNO:6、22、52和68的氨基齡列。56.才艮據(jù)權(quán)利要求47的病毒，其中所述NS蛋白質(zhì)具有選自SEQIDNO:8、24、54和70的氨基齡列。57.檢測(cè)能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒的方法，所述方法包括從動(dòng)物得到含有核酸的樣品，并將所述核酸樣品與特異結(jié)合所述病毒的多核苷酸或者基因序列的正向和反向寡核苷酸引物在一定條件下接觸，如果所述核酸含有所述引物結(jié)合的序列，那么所述條件足以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；并檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物。58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述寡核苷酸引物是根據(jù)權(quán)利要求13到18任一項(xiàng)的寡核普酸。全文摘要本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動(dòng)物和在犬科動(dòng)物中引起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)針對(duì)本發(fā)明的流感病毒的免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于鑒定本發(fā)明的病毒和診斷本發(fā)明病毒對(duì)動(dòng)物的感染的組合物和方法。文檔編號(hào)A61K39/145GK101253267SQ200680018936公開日2008年8月27日申請(qǐng)日期2006年4月21日優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日發(fā)明者A·I·克利莫夫,E·J·杜博維,J·卡茨,N·J·考克斯,P·C·克勞福德,P·J·吉布斯,R·O·多尼斯,W·L·卡斯?fàn)柭暾?qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金公司;疾病控制和預(yù)防中心，健康公共事業(yè)部部長(zhǎng)所代表的美國政府;康乃爾研究基金會(huì)有限公司