一株產(chǎn)角蛋白酶的金色鏈霉菌及其應(yīng)用方法
【專利摘要】摘要：本發(fā)明公開一株角蛋白產(chǎn)生菌株及其培養(yǎng)條件和粗酶性質(zhì)，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。經(jīng)鑒定，該菌株為金色鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)，命名為K13，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.8047。經(jīng)初步優(yōu)化，該菌株的培養(yǎng)基為：羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白胨3-5%，硝酸鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.04%，氯化鈉0.05%，搖床培養(yǎng)條件為：初始pH值為10.0，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速220r/min，裝液量30ml/250ml，發(fā)酵周期64h，產(chǎn)角蛋白酶活力達到44.2U/ml。該角蛋白酶為中溫堿性角蛋白酶，最適作用溫度為50-60℃，最適pH為8.5，且該酶在堿性(pH7.0-10.0)環(huán)境中酶活力穩(wěn)定。
【專利說明】一株產(chǎn)角蛋白酶的金色鏈霉菌及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株產(chǎn)角蛋白酶的金色鏈霉菌及其粗酶性質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002]我國每年產(chǎn)生大量的家禽羽毛和廢次羊毛，其主要成分是角蛋白。由于角蛋白存在大量的二硫鍵、氫鍵和疏水作用，不容易被普通蛋白酶水解，因而大部分未被利用，有的甚至造成環(huán)境污染。角蛋白酶可將家禽羽毛、廢次羊毛降解轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿鞍踪|(zhì)、多肽或者氨基酸，用作醫(yī)藥原料、動物飼料等，變廢為寶，減少環(huán)境污染。許多微生物能產(chǎn)生角蛋白酶，如鏈霉菌、單胞菌、芽孢桿菌等。
[0003]本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)角蛋白酶的金色鏈霉菌，并初步研究了其粗酶性質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]角蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選、鑒定、培養(yǎng)條件優(yōu)化等方法如下:
(I)平板初篩:從江南大學(xué)附近農(nóng)村羊圈采集土壤樣品，取Ig 土樣添加到IOml生理鹽水中，制備土壤懸液，稀釋涂布至初篩培養(yǎng)基平皿中，30°C培養(yǎng)3d。在分離平板上挑取能生長的較大的單菌落，劃線分離至單菌落。
[0005](2)搖瓶復(fù)篩:初篩得到的菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵，測定其上清液角蛋白酶活力，發(fā)現(xiàn)13號菌酶活力較高。`
[0006](3)菌株16S rDNA鑒定:提取總DNA，用細菌16S rDNA通用引物擴增，得到的基因序列為1500 bp,經(jīng)測序比對,為金色鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens),命名為K13,于2013年8月19日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8047。
[0007](4)菌株發(fā)酵條件初步優(yōu)化:利用單因素及正交實驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方為羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白胨3-5%，硝酸鈉
0.3%，磷酸氫二鉀0.04%,氯化鈉0.05%,搖床培養(yǎng)條件為:初始pH值為10.0，接種量10%，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，裝液量30ml/250ml，發(fā)酵周期64h，產(chǎn)角蛋白酶活力達到44.2U/ml。
[0008](5)粗酶性質(zhì)研究:分別研究了作用溫度和作用PH對該酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)該角蛋白酶的最適作用溫度為50-60°C，最適pH為8.5，且該酶在堿性(pH7.0-10.0)環(huán)境中酶活力穩(wěn)定(土 10%)。該酶為中溫堿性角蛋白酶。
[0009](6)角蛋白酶活力的測定方法:取一 18ml試管，依次加入粗酶液(發(fā)酵上清液)1.0mU0.05mol/l的pH Tris-HCl緩沖液2.0ml、羊毛粉底物IOmg, 37°C恒溫振蕩水浴鍋反應(yīng)lh，加入0.4mol/l的三氯乙酸2.0mL終止反應(yīng)，離心取上清液于280nm測定其吸光值。以37°C恒溫振蕩前添加三氯乙酸的反應(yīng)管作對照。[0010]酶活力定義:在上述反應(yīng)體系中，280nm下的吸光度值增加0.01個單位為I個酶活力單位(U/ml)。
[0011]其中步驟(1)中所述的初篩培養(yǎng)基為(g/L):羊毛粉5，K2HP04 LNaCl 0.5，瓊脂粉20 ;步驟(2)中所述的復(fù)篩搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L):羊毛粉10，K2HPO4 0.4，NaCl 0.5。
[0012]本發(fā)^^所'1飽Pseuckmionas xanthomarina DNl為反硝化細菌,可廣泛應(yīng)用于各種富營養(yǎng)化水體的凈化。
【具體實施方式】
[0013]實施例1角蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選與鑒定
1、培養(yǎng)基配方
(I)初篩培養(yǎng)基(g/Ι):羊毛粉5，K2HPO4 LNaCl 0.5，瓊脂粉20。
[0014](2)種子液體培養(yǎng)基
高氏培養(yǎng)基(g/Ι):可溶性淀粉 20，KNO3 I, NaCl 0.5，K2HPO4 0.5，M gS04 7H20 0.5， FeSO4.7 H2O 0.01。
[0015]LB培養(yǎng)基(g/Ι):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。
[0016]察氏培養(yǎng)基(g/Ι):蔗糖30，NaNO3 3，K2HPO4 I, M gS04 7H20 0.5, KCl 0.5，F(xiàn)eSO4 7H2O 0.01。
[0017](3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/Ι):羊毛粉 10，K2HPO4 0.4，NaCl 0.5
2、平板初篩及角蛋白活力測定
從江南大學(xué)附近農(nóng)村羊圈采集土壤樣品，取I g 土樣添加到10 ml生理鹽水及幾粒玻璃珠的50 ml三角瓶中，搖床振蕩15 min待土樣分散后,靜置5 min,吸取I ml 土壤懸液至9 ml稀釋液(無菌生理鹽水)，得到10_2稀釋度懸液，依次按10倍稀釋法稀釋至10_7，由此制得各稀釋度土壤懸液。分別吸取各稀釋度懸液0.1 ml至初篩培養(yǎng)基平板(放置過夜，無雜菌生長)，于30°C恒溫培養(yǎng)3d，用接種環(huán)逐個挑取生長較大的形態(tài)各異的菌落至新的初篩培養(yǎng)基平板，反復(fù)劃線分離至單菌落。
[0018]經(jīng)初步分離純化，得到32株菌，其中13株為放線菌，18株為細菌，I株為真菌，選擇生長較良好的菌株繼續(xù)培養(yǎng)，最終得到18株菌。
[0019]3、搖瓶復(fù)篩
將初篩得到的18株菌株，分別采用高氏培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基進行培養(yǎng)活化制備種子液，按2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，300C，220 r/min培養(yǎng)64 h，測定發(fā)酵上清液角蛋白酶的活力，發(fā)現(xiàn)13號菌酶活力較高,為3.9 U/ml ο
[0020]4、16S rDNA 鑒定
提取總DNA，用細菌16S rDNA通用引物擴增，得到的基因序列為1500 bp，經(jīng)測序比對，與的金色鏈霉菌的16S rDNA序列同源性高達99%，初步判斷其為金色鏈霉菌{Streptomyces aureofaciens)，命名為 K13。
[0021]實施例2菌株發(fā)酵條件初步優(yōu)化
利用單因素及正交實驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方為羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白胨3-5%，硝酸鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.04%,氯化鈉0.05%，搖床培養(yǎng)條件為:初始pH值為10.0，接種量10%，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，裝液量30ml/250ml，發(fā)酵周期64h。其產(chǎn)角蛋白酶活力達到44.2U/ml，較優(yōu)化前提高了
10.3 倍。
[0022]實施例3粗酶性質(zhì)研究
初步研究了所產(chǎn)角蛋白酶的粗酶性質(zhì)，分別研究了作用溫度(30、40、45、50、55、60、70及80°C)和作用pH (3.0-10.0)對該酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)該角蛋白酶的最適作用溫度為50-60°C，最適pH為8.5，且該酶在堿性(pH7.0-10.0)環(huán)境中酶活力穩(wěn)定(± 10%)。該酶為中溫堿性角蛋白酶。`
【權(quán)利要求】
1.一株角蛋白酶產(chǎn)生菌株金色鏈霉菌（Streptomyces atfreo/acie/75.),命名為K13,現(xiàn)保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8047，保藏日期為2013年8月19日。
2.權(quán)利要求1所述菌株的培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)基為:羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白胨3-5%，硝酸鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.04%,氯化鈉0.05%,搖床培養(yǎng)條件為:初始pH值為10.0，接種量10%，培養(yǎng)溫度30°C，轉(zhuǎn)速220r/min，裝液量30ml/250ml，發(fā)酵周期64h，產(chǎn)角蛋白酶活力達到44.2U/ml。
3.權(quán)利要求1所述菌株所產(chǎn)的角蛋白酶為中溫堿性角蛋白酶，最適作用溫度為50-60°C，最適pH為8.5，且該酶在堿性(pH7.0-10.0)環(huán)境中酶活力穩(wěn)定。
【文檔編號】C12N9/52GK103642739SQ201310701537
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】張旦旦, 王月, 史勁松, 許正宏, 張曉梅 申請人:江南大學(xué)