提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)是一種提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法；所述培養(yǎng)基原料配方為：葡萄糖或果糖，蛋白胨或酵母侵粉，Ba2+、Ca2+或K+，Vc或VB1，膠體幾丁質(zhì)，KH2PO4，余量為水；培養(yǎng)方法包括將蘇云芽孢桿菌接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液，將制得的發(fā)酵種子液按接種于所述培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50～100mL，接種量5～15mL，于26℃，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明培養(yǎng)基條件溫和，易于控制；提供的用于蘇云芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，具有幾丁質(zhì)酶產(chǎn)率高，幾丁質(zhì)酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)是一種提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌,其在生長(zhǎng)周期的穩(wěn)定期形成的芽胞及伴胞晶體使其獨(dú)具特性。由于蘇云金芽胞桿菌制劑對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)有特異性毒殺作用，且對(duì)人畜安全、不危害環(huán)境，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和衛(wèi)生害蟲(chóng)的防治上得到了廣泛應(yīng)用。
[0003]許多Bt菌除了合成殺蟲(chóng)晶體蛋白外，也能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。Bt幾丁質(zhì)酶不僅具有殺蟲(chóng)增效作用，對(duì)病原真菌也有抑制作用，具有防治農(nóng)作物病蟲(chóng)害的作用；幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好前景，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但由于Bt菌株幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量普遍較低，制約了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，提高Bt幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量是幾丁質(zhì)酶開(kāi)發(fā)應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有Bt菌株幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量普遍較低的問(wèn)題，提供一種提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基原料配方為:17~25g/L葡萄糖或果糖，17~25g/L蛋白胨或酵母侵粉，4X l(T4mol/L Ba2+、Ca2+ 或 K+，0.01w%Vc 或 VB1,100ml/L 膠體幾丁質(zhì)，KH2PO40.6 (g/L)，余量為水。
[0006]進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基原料配方為:20g/L葡萄糖或果糖，17g/L蛋白胨或酵母侵粉，4X l(T4mol/L Ba2\Ca2+ 或 K+，0.01w%Vc 或 Vbi，100ml/L 膠體幾丁質(zhì)，KH2PO40.6 (g/L)，余量為水。
[0007]進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基的pH值為5.5~7.0。
[0008]進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基的pH值為6.5。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
步驟一、將蘇云芽孢桿菌接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；
步驟二、將步驟一中制得的發(fā)酵種子液按接種于所述培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50~100mL，接種量5~15mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。
[0010]進(jìn)一步的,所述步驟一中的種子培養(yǎng)基的原料含有:150g/L淀粉,葡萄糖20g/L。
[0011]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明培養(yǎng)基條件溫和，易于控制；提供的用于蘇云芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，具有幾丁質(zhì)酶產(chǎn)率高，幾丁質(zhì)酶活力高等優(yōu)點(diǎn)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0012]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0013]實(shí)施例1
蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵方法 (O發(fā)酵種子的制備 (A)菌種和培養(yǎng)基 菌種:蘇云芽孢桿菌；
斜面培養(yǎng)基=PDA培養(yǎng)基；
液體種子培養(yǎng)基:土豆150g，葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL,自然pH，1.0lMPa，滅菌20mino
[0014](B)種子液制備 將斜面上的純種蘇云芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到多個(gè)250mL三角瓶中，其中裝有IOOmL培養(yǎng)基，然后在27°C，在往復(fù)式震蕩搖床轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)培養(yǎng)4d，帶菌絲生長(zhǎng)健壯，菌液呈粘稠狀時(shí)，說(shuō)明種子已經(jīng)生長(zhǎng)好了。
[0015](2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:按照培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制，即2g葡萄糖，2g蛋白胨，0.083gBaCl2 (4X10-4mol/L Ba2+)，0.3g KH2PO4,0.01g Vc,蒸餾水定容至 1000mL, pH 6.5，
1.0 IMPa,滅菌 20min。
[0016]將上一步驟中制備的蘇云芽孢桿菌發(fā)酵種子液，按培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件，接種量15mL接種于250mL三角瓶中，瓶中裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)液；搖床溫度:26 0C ±1°C，轉(zhuǎn)速 160 r/min ；
發(fā)酵周期:4d ；
菌株蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定:
取ImL菌體培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，8000rpm離心lOmin。取200 μ L上清液加入200 μ L含10%膠體幾丁質(zhì)的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)，50°C水浴lh。加入200 μ L l%Na0H溶液終止反應(yīng)，混勻后8000rpm離心IOmin ;取上清400 μ L于新的離心管中，加入等體積的DNS試劑溶液，混勻后沸水浴IOmin ;以沒(méi)有反應(yīng)的培養(yǎng)液作對(duì)照，測(cè)OD535值。
[0017]一個(gè)酶活力單位定義為50°C、pH 6.0條件下反應(yīng)Imin產(chǎn)生I μ gN_乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)所需要的酶量，酶活力測(cè)定結(jié)果均為3次以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。
[0018]測(cè)定結(jié)果表明:蘇云芽孢桿菌生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶活為4.0IU/mL以上，該實(shí)施例表明本發(fā)明的搖瓶實(shí)驗(yàn)工藝良好。
[0019]實(shí)施例2
蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵方法 (O發(fā)酵種子的制備 (A)菌種和培養(yǎng)基 菌種:蘇云芽孢桿菌；斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基；
液體種子培養(yǎng)基:土豆150g，葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL,自然pH，1.0lMPa，滅菌20mino
[0020](B)種子液制備
將斜面上的純種蘇云芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到多個(gè)250mL三角瓶中，其中裝有IOOmL培養(yǎng)基，然后在27°C，在往復(fù)式震蕩搖床轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)培養(yǎng)4d，帶菌絲生長(zhǎng)健壯，菌液呈粘稠狀時(shí)，說(shuō)明種子已經(jīng)生長(zhǎng)好了。
[0021](2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:按照培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制，即2g果糖，2g酵母侵粉,0.083gCaCl2 (4Xl(T4mol/L Ca2+),0.3g KH2PO4,0.01g VB1,蒸餾水定容至 1000mL, pH 6.5，
1.0IMPa,滅菌 20min。
[0022]將上一步驟中制備的蘇云芽孢桿菌發(fā)酵種子液，按培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件，接種量15mL接種于250mL三角瓶中，瓶中裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)液；搖床溫度:26 °C ±1°C，轉(zhuǎn)速 160r/min ；
發(fā)酵周期:4d ；
菌株蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定:
取ImL菌體培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，8000rpm離心lOmin。取200 μ L上清液加入200 μ L含10%膠體幾丁質(zhì)的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)，50°C水浴Ih。加入200 μ L l%Na0H溶液終止反應(yīng)，混勻后8000rpm離心IOmin ;取上清400 μ L于新的離心管中，加入等體積的DNS試劑溶液，混勻后沸水浴IOmin ;以沒(méi)有反應(yīng)的培養(yǎng)液作對(duì)照，測(cè)OD535值。
[0023]一個(gè)酶活力單位定義為50°C、pH 6.0條件下反應(yīng)Imin產(chǎn)生I μ gN_乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)所需要的酶量，酶活力測(cè)定結(jié)果均為3次以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。
[0024]測(cè)定結(jié)果表明:蘇云芽孢桿菌生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶活為4.0IU/mL以上，該實(shí)施例表明本發(fā)明的搖瓶實(shí)驗(yàn)工藝良好。
[0025]實(shí)施例3
蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵方法 (O發(fā)酵種子的制備 (A)菌種和培養(yǎng)基 菌種:蘇云芽孢桿菌；
斜面培養(yǎng)基=PDA培養(yǎng)基；
液體種子培養(yǎng)基:土豆150g，葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL,自然pH，1.0lMPa，滅菌20mino
[0026](B)種子液制備 將斜面上的純種蘇云芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到多個(gè)250mL三角瓶中，其中裝有IOOmL培養(yǎng)基，然后在27°C，在往復(fù)式震蕩搖床轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)培養(yǎng)4d，帶菌絲生長(zhǎng)健壯，菌液呈粘稠狀時(shí)，說(shuō)明種子已經(jīng)生長(zhǎng)好了。
[0027](2)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基:按照培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制，即2g果糖，2g酵母侵粉,0.083g KCl(4Xl(T4mol/L K+)，0.3g KH2PO4,0.01g Vbi，蒸餾水定容至 lOOOmL，pH 6.5，1.0lMPa，滅菌20mino
[0028]將上一步驟中制備的蘇云芽孢桿菌發(fā)酵種子液，按培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件，接種量15mL接種于250mL三角瓶中，瓶中裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)液；搖床溫度:26 0C ±1°C，轉(zhuǎn)速 160r/min ；
發(fā)酵周期:4d ；
菌株蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定:
取ImL菌體培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，8000rpm離心lOmin。取200 μ L上清液加入200 μ L含10%膠體幾丁質(zhì)的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)，50°C水浴Ih。加入200 μ L l%NaOH溶液終止反應(yīng)，混勻后8000rpm離心IOmin ;取上清400 μ L于新的離心管中，加入等體積的DNS試劑溶液，混勻后沸水浴IOmin ;以沒(méi)有反應(yīng)的培養(yǎng)液作對(duì)照，測(cè)OD535值。 [0029]一個(gè)酶活力單位定義為50°C、pH 6.0條件下反應(yīng)Imin產(chǎn)生I μ gN_乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)所需要的酶量，酶活力測(cè)定結(jié)果均為3次以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。
[0030]測(cè)定結(jié)果表明:蘇云芽孢桿菌生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶活為4.0IU/mL以上，該實(shí)施例表明本發(fā)明的搖瓶實(shí)驗(yàn)工藝良好。
[0031]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基原料配方為:17~25g/L葡萄糖或果糖，17~25g/L蛋白胨或酵母侵粉，4X10_4mol/L Ba2+、Ca2+或K+，0.01w%Vc 或 Vbi，100ml/L 膠體幾丁質(zhì)，KH2PO4 0.6 (g/L)，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基原料配方為:20g/L葡萄糖或果糖，17g/L蛋白胨或酵母侵粉，4X10_4mol/L Ba2+、Ca2+或K+，0.01w%Vc 或 Vbi，100ml/L 膠體幾丁質(zhì)，KH2PO40.6 (g/L)，余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求根據(jù)權(quán)利要求2所述提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的pH值為5.5~7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求根據(jù)權(quán)利要求3所述提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的PH值為6.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求根據(jù)權(quán)利要求1~4所述提高蘇云芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、將蘇云芽孢桿菌接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液； 步驟二、將步驟一中制得的發(fā)酵種子液按接種于所述培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50~1OOmL,接種量5~15mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利5所述蘇云芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，其特征在于，所述步驟一中的種子培養(yǎng)基的原料含有:150g/L淀粉，葡萄糖20g/L。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK103667217SQ201310644572
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】段升華 申請(qǐng)人:中山奈德生物科技有限公司