一種廣西莪術(shù)dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種廣西莪術(shù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列，其特征在于所述條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因?yàn)镮TS基因，具有基因序列SEQ?ID?NO.1。測序結(jié)果通過手工校對、序列拼接，并在NCBI中進(jìn)行Blast相似性搜索，確保所得序列為目標(biāo)序列。廣西莪術(shù)的種類鑒定依靠形態(tài)學(xué)和分子鑒定所實(shí)現(xiàn)，從而保證了結(jié)果的可靠性。本發(fā)明提供的廣西莪術(shù)的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列有利于實(shí)現(xiàn)廣西莪術(shù)的快速的鑒定，縮短鑒定時間，提高鑒定準(zhǔn)確性。
【專利說明】—種廣西莪術(shù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種廣西莪術(shù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列。
【背景技術(shù)】
[0002]廣西莪術(shù)CurcumakwangsiensisS.G..Lee et C.F.Liang是姜科中的一種多年生草本植物，廣泛分布于廣西、廣東、云南和四川等地，與蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaμ lisval.和溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling)是中國藥典收載的3種基原莪術(shù)。《中華人民共和國藥典》(2010版)規(guī)定上述三種植物的根狀莖為常用中藥“莪術(shù)”，有行氣破血、消積止痛的功效；其塊根為中藥的“郁金”，具活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃之效。加之莪術(shù)類藥材往往在采集后就地加工，加工后藥材外形相似，形態(tài)辨別困難，致使該類藥材在流通市場上品種混亂現(xiàn)象普遍存在，藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定，因此對廣西莪術(shù)類藥材基原植物的鑒定和限制是非常重要。因此，對其物種和資源進(jìn)行鑒定研究，對促進(jìn)該科植物的開發(fā)和利用具有重要意義。
[0003]DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)是2003年由加拿大動物學(xué)家hebert首次提出，即利用一段DNA片段對物種進(jìn)行鑒定，該技術(shù)自問世以來，因其快速、客觀和操作程序化等特點(diǎn)，引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注，是近年來發(fā)展最迅速的學(xué)科之一。線粒體細(xì)胞色素C氧化亞基(Cytochrome C Oxidase CO I)基因是被公認(rèn)為動物界中標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼，對于植物的DNA barcoding鑒定研究來說，由于植物進(jìn)化歷程中容易發(fā)生雜交及網(wǎng)狀進(jìn)化事件，且同一基因在不同種群中進(jìn)化速率也不一樣，致使植物條形碼的研究比動物要復(fù)雜得多，至今沒有找到一條通用的DNA barcoding序列,推薦較多的序列有ITS、psbA_trnH、ITS2、matK等序列，但這些序列是否適合每一個具體的植物科或?qū)伲行柽M(jìn)行針對性的探索研究。從Baldwin第一次把ITS應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)研究以來，ITS己經(jīng)成為系統(tǒng)發(fā)育重建中最受歡迎的序列之一。ITS之所以能有這么廣的應(yīng)用，在于它自身的一些特點(diǎn):第一，ITS在核基因組中是高度重復(fù)的，千萬個拷貝以串聯(lián)重復(fù)方式出現(xiàn)在一個或多個染色體基因位點(diǎn)上，這樣多的拷貝有利`于擴(kuò)增、克隆和測序。同時，ITS、ITS2分別位于18S —
5.8SrDNA、5.8S — 26SDNA之間，而從細(xì)菌、真菌到高等植物的18S、5.8S、26S rDNA的序列又高度保守，這樣就可以用與它們序列互補(bǔ)的通用引物對ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序。第二，這一基因家族通過不等交換和基因轉(zhuǎn)換，重復(fù)單位間已發(fā)生了位點(diǎn)內(nèi)或位點(diǎn)間的同步進(jìn)化(concerted evolution),即不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致。這個特性可促使根據(jù)ITS序列對種間關(guān)系進(jìn)行精確重建。由于變異較快，ITS不適用于較高分類階元的系統(tǒng)學(xué)研究，而適用于科以下分類階元的系統(tǒng)發(fā)育分析。ITS序列在一些起源古老世代較長的植物類群中的變異較低，也為研究那些間隔區(qū)進(jìn)化速度很慢的古老類群間的系和長世代類群內(nèi)較高階元的系統(tǒng)重建提供了可能性。同時，ITS序列為雜交和多倍化研究提供了契機(jī)。此外，在某些類群，ITS序列已經(jīng)用于種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育研究。迄今為止，已有諸多證明ITS基因在植物的分類鑒定中行之有效。因此可采用ITS基因的DNA條形碼技術(shù)對廣西莪術(shù)進(jìn)行分子鑒定，目前Genbank中只有其它莪術(shù)類的ITS基因序列，至今尚無廣西莪術(shù)的ITS的相關(guān)基因序列。本發(fā)明提供的廣西莪術(shù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列有利于實(shí)現(xiàn)廣西莪術(shù)的快速鑒定，縮短鑒定時間，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種廣西莪術(shù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列。該基因序列的獲得，將大大有助于對其物種和資源進(jìn)行鑒定研究。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種廣西莪術(shù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因，所述條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因?yàn)镮TS，具有如下所述的基因序列SEQ ID N0.1:
【權(quán)利要求】
1.一種廣西莪術(shù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因，其特征在于所述條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因?yàn)镮TS基因，具有如下所述的基因序列ITS SEQ ID N0.1:

2.權(quán)利要求1所述的廣西莪術(shù)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列為:

3.一種廣西莪術(shù)的分子鑒定方法，包括: O從待測的廣西莪術(shù)植物組織中分離提取DNA ； 2)以該DNA為模板用一對引物，正向引物:5’TAG GTG AAC TGC GGA AGG AT 3’，反向引物5’ GTG GTC TCG CCT GAT TGG 3’，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出廣西莪術(shù)ITS基因； 3)然后取適量步驟2的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的ITS基因用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果； 4)如果能特異性擴(kuò)增出600bp的條帶，進(jìn)行切膠回收，連接到T載體上，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，在3500基因測序儀器上進(jìn)行測序； 5)根據(jù)測序結(jié)果，如果與所述基因序列SEQID N0.1的同源性在98%以上，即可判斷所述的待測組織為廣西莪術(shù)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103695536SQ201310600809
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】王娟, 陳旭, 候艷芳, 曾建紅, 付明磊, 刁珂, 白準(zhǔn), 黃鳳香 申請人:桂林醫(yī)學(xué)院