一種微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法。該方法利用乳桿菌BL1對銀杏花粉黃酮苷進行轉化。該菌株兼性厭氧，培養(yǎng)條件簡單，產多種復合酶，生長迅速、繁殖力強、安全高效、能以單一銀杏花粉作為基質進行生長繁殖。銀杏花粉不需要預先破壁處理，銀杏花粉中的黃酮苷不需要復雜的提取純化，而被高效轉化成相應苷元，并且直接以銀杏花粉為原料轉化黃酮苷為相應苷元的能力非常高，三種主要黃酮苷山奈素-3,4'-雙葡萄糖苷、3-O-[6-O-（α-L-鼠李糖基）-β-D-葡糖基]山奈素和山奈酚-3-葡萄糖苷的轉化率達到99%以上。通過轉化可以從銀杏花粉中獲得比原來多100倍以上的山奈酚，大大提高了生物利用率。
【專利說明】一種微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術領域】，特別涉及一種微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法?！颈尘凹夹g】
[0002]銀杏樹又名“公孫樹”，是現存種子植物中最古老的孑遺植物。古老的銀杏樹作為野生資源主要分布在中國，后引種到世界各地。目前國內的銀杏主產區(qū)主要在山東、江蘇、廣西、廣東等地。銀杏全身是寶，銀杏資源的利用在我國歷史悠久，銀杏葉、銀杏果可入藥，《中國藥典》中均有記載。銀杏葉中含有天然活性黃酮及內酯等與人體健康有益的多種成份，具有溶解膽固醇，擴張血管的作用，對改善腦功能障礙、動脈硬化、高血壓、眩暈、耳鳴、頭痛、老年癡呆、記憶力減退等有明顯效果。其防病、治病、健身的價值在明代李時珍的《本草綱目》中早有記載?，F代研究表明，以黃酮為主要有效成分的銀杏葉制劑，具有保護毛細血管通透性、擴張冠狀動脈、恢復動脈血管彈性、降低血清膽固醇、增加冠狀動脈血流量、改善心腦血管循環(huán)、解除平滑肌痙攣、松弛支氣管和抑菌、營養(yǎng)腦細胞及其它器官的作用，而且還有使動脈、末梢血管、毛細血管中的血質與膽固醇維持正常水平的奇特功效。銀杏果營養(yǎng)豐富，每100g鮮果中含蛋白質13.2g,碳水化合物72.6g,脂肪1.3g,且含有維生素C、核黃素、胡蘿卜素、及鈣、磷、鐵、硒、鉀、鎂等多種微量元素，8種氨基酸，具有很高的食用價值、藥用價值和保健價值。但是，銀杏果、銀杏葉中也含有銀杏酸等有毒成分，由此引起的毒副作用限制了其應用范圍。
[0003]近年來銀杏花粉的研究和開發(fā)利用逐漸被科學界所關注。根據目前的研究，銀杏花粉營養(yǎng)非常豐富，藥用成分含量高。含有約23.65%的蛋白質、1.5%的VC、1.3%的VB1、
.6.5%的VB2、1.6%~2.4%黃酮、0.09%~0.38%的內酯及多糖等其它活性成分。發(fā)明人通過毒理試驗表明，銀杏花粉給藥量21.lg/kg時實驗小鼠無不良反應，并且能明顯增加雄性小鼠胸腺系數和脾臟系數，表明服用銀杏花粉的安全范圍較大，并且具有一定的免疫增強作用。所以開發(fā)利用銀杏花粉具有廣闊的應用前景。發(fā)明人對銀杏花粉黃酮成分的進一步研究表明，銀杏花粉黃酮主要由山奈酚為苷元的糖苷類黃酮苷組成，占到總黃酮的95%以上。其中山奈素_3，4’-雙匍萄糖昔、3-0-[6_0- ( a-L-鼠李糖基)-β-D-匍糖基]山奈素、山奈酚-3-葡萄糖苷和3-0- ( a -L-鼠李糖基)山奈素占到銀杏花粉黃酮苷總量的92%左右。但是作為主要黃酮苷元的山奈酚的含量極低，只有25mg/kg左右。
[0004]生物利用度研究表明，天然糖苷類的分子結構并不是其活性發(fā)揮的最佳形式，苷元才是活性發(fā)揮的最佳形式，大部分天然糖苷成分只有在胃酸及人體腸道微生物的作用下分解為苷元，才能夠被人體吸收利用。但是銀杏花粉具有厚厚的花粉壁，耐酸堿并且在人體中停留時間短，在人體中的生物轉化能力較弱，直接服用則生物利用率遠遠低于黃酮苷元。如果能夠在體外將糖苷型銀杏花粉黃酮苷轉變?yōu)檐赵忘S酮，就可以增強銀杏花粉黃酮的生物活性。
[0005]目前黃酮苷的生物轉化主要有酸堿法、酶解法和微生物法。應用最多的是酸堿法，在酸堿條件下使糖苷鍵斷裂，這種方式苷元得率能達到95%以上，但在酸堿條件下黃酮苷元的穩(wěn)定性較差，并且強酸或強堿條件下不易進行工業(yè)化生產，酸堿回收成本高，環(huán)境污染大。酶解法作用條件溫和，而且多采用弱酸性緩沖溶液，黃酮苷元不易變性。但是采用商業(yè)化純酶轉化效果往往不佳，需要多種酶的配合使用，且用酶成本較高，工藝較為復雜。微生物法相對來說工藝簡單，成本低，并且環(huán)境友好，最關鍵就是要尋找到能夠高效轉化黃酮苷并且易于培養(yǎng)、安全性高的微生物。
[0006]目前，在利用天然植物原料中的黃酮苷生成相應的苷元方面的報道如下。CN101845467A公開了一種山奈酚的提取方法，主要是把堿提和酶解相結合提取山奈酚。伍毅等采用β_葡萄糖苷酶水解銀杏葉提取物，使糖苷型黃酮轉化為苷元型黃酮。劉萍等采用酶法水解沙棘糖苷中的糖基使其變成苷元，提高了抗氧化活性。該方法為:沙棘黃酮糖苷經過α -鼠李糖苷酶(I IU)、β -葡萄糖苷酶(2 IU)、木聚糖酶(1.5 IU)、纖維素酶(15IU)、果膠酶(0.5 IU)、a-淀粉酶(2 IU)組成的復合酶預處理后，黃酮糖苷轉化率僅為0.23%，再用柚苷酶水解可獲得高含量的黃酮苷元，轉化率達85%以上。微生物發(fā)酵生物轉化糖苷方面，田天麗采用根霉Τ-34固態(tài)發(fā)酵轉化虎杖，最佳條件下虎杖苷轉化率達到98%。CN101575575A公開了一株點青霉菌及其在生物轉化桑葉黃酮苷中的應用，黃酮苷轉化率最高可達57%。目前微生物法生物轉化黃酮苷的研究多集中在利用真菌進行生物轉化上，并且生物轉化率不一，最高的是利用根霉Τ-34達到虎杖苷轉化率98%。 [0007]乳酸菌是一類安全性很高的微生物，常被用于食品及藥品的生產。一部分乳酸菌為不可培養(yǎng)菌或厭氧菌，不能培養(yǎng)或培養(yǎng)條件苛刻，但也有一部分乳酸菌培養(yǎng)條件簡單，能在食品基質上生長，并且兼性厭氧，對培養(yǎng)條件要求不高，從這部分乳酸菌中篩選菌株進行黃酮苷的轉化比利用真菌安全性更高。采用微生物法轉化銀杏花粉黃酮苷的研究未見報道。
[0008]乳桿菌BLl是由本發(fā)明專利的 申請人:山東省農業(yè)科學院農產品研究所從泡菜中分離鑒定并保存的一株耐酸性乳酸細菌(劉孝永，裘紀瑩，孫欣，等.泡菜中兩株乳酸菌的分離鑒定及其混合培養(yǎng)初探.山東農業(yè)科學[J]，2012，44(9):85-89)。上述文章僅對其分離鑒定進行了報道。但是沒有報道該菌株的功能。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明克服了現有的生物轉化黃酮苷方法方面存在的不足，提供了一種利用微生物(乳桿菌BLl)轉化銀杏花粉黃酮苷的方法。乳桿菌BLl能在單一銀杏花粉培養(yǎng)基上生長繁殖，具有高效轉化銀杏花粉黃酮苷為黃酮苷元的能力。通過本發(fā)明的生物轉化，銀杏花粉不需要預先破壁處理，銀杏花粉中的黃酮苷不需要復雜的提取純化，而被高效轉化成相應苷元。其中主要黃酮苷(山奈素_3，4’-雙葡萄糖苷、3-0-[6-0- ( a-L-鼠李糖基)-β-D-葡糖基]山奈素、山奈酚-3-葡萄糖苷)的轉化率均高達99%以上，主要轉化產物山奈酚的含量可提高100倍以上。
[0010]本發(fā)明的技術方案是:一種微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法，其特征是，
(1)菌株活化:乳桿菌BLl在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，分離單菌落轉接MRS斜面培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)24~72小時備用；
(2)液體菌種:由斜面接種于液體MRS培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)18~24小時，得液體菌種；
(3)發(fā)酵基質的配制:銀杏花粉過100目篩，按銀杏花粉10~40重量份，水100重量份的比例配制并攪拌均勻；
(4)發(fā)酵:將發(fā)酵基質于115°C滅菌15~20min，冷卻至常溫，以1%~8%體積比接種液體菌種，30°C~37°C靜置培養(yǎng)2~12天，得銀杏花粉黃酮苷的高效轉化液。
[0011]進一步地，本發(fā)明的優(yōu)選技術方案是:所述步驟(3)發(fā)酵基質的配制為:按銀杏花粉20重量份，水100重量份的比例配制并攪拌均勻；
進一步地，本發(fā)明的優(yōu)選技術方案是:所述步驟(4)發(fā)酵為:將發(fā)酵基質于115°C滅菌15min，冷卻至常溫，以4%體積比接種液體菌種，37°C靜置培養(yǎng)4_10天，得銀杏花粉黃酮苷的高效轉化液。
[0012]進一步地，銀杏花粉黃酮苷高效轉化液進一步提取純化得到天然山奈酚。
[0013]本發(fā)明涉及的乳桿菌BLl兼性厭氧，培養(yǎng)條件簡單(能在普通MRS培養(yǎng)基上生長)，產多種復合酶，生長迅速、繁殖力強、安全高效、能以單一銀杏花粉作為基質進行生長繁殖，并且生物轉化銀杏花粉黃酮苷為相應苷元的能力非常高，三種主要黃酮苷山奈素_3，4’-雙匍萄糖昔、3-0-[6-0- ( a -L-鼠李糖基)~β -D-匍糖基]山奈素和山奈酚-3-葡萄糖苷的轉化率均達到99%以上，高于目前文獻報道或專利公開的方法。通過轉化可以從銀杏花粉中獲得比原來多100倍以上的山奈酚，大大提高了銀杏花粉的生物利用率。銀杏花粉黃酮苷高效轉化液進一步提取純化可得到天然山奈酚，山奈酚具有抗癌、提高免疫能力、降血糖、抗菌等多種生物活性，可廣泛應用于醫(yī)藥行業(yè)或者作為保健食品添加劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為銀杏花粉生物轉化前后的HPLC圖譜。(A)生物轉化之前，(B)采用乳桿菌BLl進行生物轉化之后；1:山奈素-3，4’-雙匍萄糖昔,2:3-0-[6-0- ( a -L-鼠李糖基)_ β -D-匍糖基]山奈素，3:山奈酌.-3-匍萄糖昔，4:3-0- ( a -L-鼠李糖基)山奈素，5:山奈酚。`【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不限于此。
[0016]實施例1:本發(fā)明涉及的乳桿菌BLl的活化和液體菌種制備
MRS固體培養(yǎng)基為:蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母膏2.5 g，葡萄糖2.5 g，檸檬酸三銨1.0 g，乙酸鈉1.56 g，乙酸鉀1.125 g，磷酸氫二鈉0.815 g，四水硫酸錳0.125 g,七水硫酸鎂0.29 g，吐溫80為0.5 ml，瓊脂10 g，蒸餾水500 ml,pH6.5，121°C滅菌20
mirio
[0017]MRS斜面培養(yǎng)基為:同MRS固體培養(yǎng)基。
[0018]液體MRS培養(yǎng)基為:為MRS固體培養(yǎng)基組分中去掉瓊脂。
[0019]在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，分離單菌落轉接MRS斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24~48小時進行菌株活化；由斜面接種于液體MRS培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)18~24小時，得到液體菌種，其有益活菌數可以達到109cfu/mL。
[0020]實施例2:本發(fā)明涉及的黃酮苷生物轉化工藝
銀杏花粉過100目篩，按銀杏花粉20重量份，水100重量份的比例配制并攪拌均勻得到發(fā)酵基質；將發(fā)酵基質于115°C滅菌15min，冷卻至常溫，以4%體積比接種乳桿菌BLl液體菌種，37°C靜置培養(yǎng)4天，得銀杏花粉黃酮苷的高效轉化液。
[0021]實施例3:本發(fā)明涉及的黃酮苷生物轉化工藝
銀杏花粉過100目篩，按銀杏花粉30重量份，水100重量份的比例配制并攪拌均勻得到發(fā)酵基質；將發(fā)酵基質于115°C滅菌20min，冷卻至常溫，以2%體積比接種乳桿菌BLl液體菌種，34°C靜置培養(yǎng)10天，得銀杏花粉黃酮苷的高效轉化液。
[0022]實施例4:本發(fā)明涉及的黃酮苷生物轉化工藝
銀杏花粉過100目篩，按銀杏花粉25重量份，水100重量份的比例配制并攪拌均勻得到發(fā)酵基質；將發(fā)酵基質于115°C滅菌20min，冷卻至常溫，以6%體積比接種乳桿菌BLl液體菌種，37°C靜置培養(yǎng)3天，得銀杏花粉黃酮苷的高效轉化液。
[0023]實施例5:銀杏花粉黃酮苷高效轉化液進一步提取純化得到天然山奈酚
取IL銀杏花粉轉化液中加入1.5-4公斤的無水乙醇，于40-80°C加熱回流提取或超聲波提取20-40分鐘，過濾，濾渣用60-80%乙醇水溶液重復提取1-3次。收集濾液，減壓蒸餾除去乙醇，剩余水溶液先用等量石油醚萃取3次，再用等量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相得到黃酮粗提物。采用石油醚-乙酸乙酯為洗脫溶劑反復硅膠柱層析，合并山奈酚含量較高組分，既得天然山奈酚。
[0024]實施例6:本發(fā)明涉及的銀杏花粉黃酮成分的檢測
樣品預處理:原始發(fā)酵基質或實施例1的高效轉化液中加入5倍體積的無水乙醇，充分混勻后采用100-500W，40Hz，控溫40_80°C超聲波提取30min。冷卻至室溫，10000轉冷凍離心lOmin，取2mL上清液用0.45um的濾膜過濾，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025]HPLC檢測條件:將預處理樣品溶液注入液相色譜儀，采用C18色譜柱，進樣量1OuL;流動相:0.2%乙酸水溶液(A)-乙腈(B)，O~1Omin 12%~15%流動相B線性梯度，10~20min 15%~18%流動相B線性梯度，20~30min 18%~21%流動相B線性梯度，30~40min 21%~32%流動相B線性梯度，40~50min 32%~55%流動相B線性梯度，50~80min 55%~65%流動相B線性梯度,80~85min 65%流動相B等度，體積流量1mL/min,柱溫30°C ;檢測波長265nm。
[0026]檢測結果如圖1所示。從圖1可以看出:銀杏花粉的主要黃酮苷(山奈素_3，4’ -雙匍萄糖昔、3-0_[6_0- ( a-L-鼠李糖基)-β-D-匍糖基]山奈素、山奈酌' _3_匍萄糖昔)的轉化率均高達99%以上；主要轉化產物山奈酚的含量可提高100倍以上。
【權利要求】
1.一種微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法，其特征是，利用乳桿菌BLl發(fā)酵銀杏花粉，將其中的黃酮苷轉化為相應苷元。
2.如權利要求1所述的微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法，其特征是， (1)菌株活化:乳桿菌BLl在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，分離單菌落轉接MRS斜面培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)24~72小時備用； (2)液體菌種:由斜面接種于液體MRS培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)18~24小時，得液體菌種； (3)發(fā)酵基質的配制:按銀杏花粉10~40重量份，水100重量份的比例配制并攪拌均勻； (4)發(fā)酵:將發(fā)酵基質高溫滅菌，冷卻至常溫，以1%~8%體積比接種液體菌種，30°C~37°C靜置培養(yǎng)2~12天，得銀杏花粉黃酮苷的高效轉化液。
3.如權利要求2所述的微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法，其特征是，所述步驟(3)將銀杏花粉過100目篩。
4.如權利要求2所述的微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法，其特征是，所述步驟(4)將發(fā)酵基質于115°C高溫滅菌15-20min。
5.如權利要求4所述的微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法，其特征是，所述步驟(4)將發(fā)酵基質于115°C滅菌15min，冷卻至常溫，以4%的體積比接種液體菌種，37°C靜置培養(yǎng)4-10天，得銀杏花粉黃酮苷的高效轉化液。
6.如權利要求2-5中任意一項所述的微生物轉化銀杏花粉黃酮苷的方法，其特征是，所述步驟(3)按銀杏花粉20重量份，水100重量份的比例配制并攪拌均勻。
【文檔編號】C12P17/06GK103614429SQ201310578541
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權日:2013年11月19日
【發(fā)明者】陳相艷, 裘紀瑩, 陳蕾蕾, 王未名, 劉孝永, 周慶新 申請人:山東省農業(yè)科學院農產品研究所