一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：（1）從制種農(nóng)戶的制種棉田里的隨機(jī)抽取待測棉鈴；（2）隨機(jī)抽取步驟（1）得到的棉鈴中的棉籽；（3）分別提取步驟（2）得到的棉籽的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA；（4）分別以步驟（3）得到的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA為模板，采用SSR引物對進(jìn)行鑒定，得到種皮指紋圖譜和種仁指紋圖譜；如果某一待測棉鈴中，抽樣檢測的所有棉籽的種仁指紋圖譜均與種皮指紋圖譜一致，該棉鈴為自交鈴。本發(fā)明具有很大的實(shí)用價(jià)值和推廣價(jià)值。
【專利說明】一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)業(yè)上，雜交種通常具有豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，已得到廣泛的應(yīng)用。雜交棉品種產(chǎn)量高，受到廣大棉農(nóng)的認(rèn)可。由于存在剝大花、自交鈴等問題，雜交種的純度較難保證。近年來，由于農(nóng)村勞動力的轉(zhuǎn)移，棉花制種用工越來越緊缺，用工價(jià)格也越來越高，在這個大背景下，雜交棉制種的質(zhì)量越來越差。
[0003]一般來說，制種公司只能在種子收獲后抽樣去海南加代檢測純度(田間檢測)，存在檢測時間長、異地種植受環(huán)境條件影響大等問題，效果不是很理想。
[0004]近年來，有制種公司采用SSR標(biāo)記來檢測種子純度，與田間檢測相比，縮短了檢測時間，并且避免了異地種植環(huán)境對植株表型的影響。種子公司都是由大量制種農(nóng)戶供種，所以制種公司先要以農(nóng)戶為單位收集大量種子然后趕在播種期前完成檢測和銷售，存著工作量大、批次多、時間緊的現(xiàn)狀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法。
[0006]本發(fā)明提供了一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法，包括如下步驟:
[0007]( I)從制種農(nóng)戶的制種棉`田里的隨機(jī)抽取待測棉鈴；
[0008](2)隨機(jī)抽取步驟(1)得到的棉鈴中的棉籽；
[0009](3)分別提取步驟(2)得到的棉籽的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA ；
[0010](4)分別以步驟(3)得到的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA為模板，采用SSR引物對進(jìn)行鑒定，得到種皮指紋圖譜和種仁指紋圖譜；
[0011]如果某一待測棉鈴中，抽樣檢測的所有棉籽的種仁指紋圖譜均與種皮指紋圖譜一致，該棉鈴為自交鈴。
[0012]所述SSR引物對為CS62引物對、NAU1085引物對、NAUl 102引物對、NAU1255引物對、NAU2274引物對、NAUl 103引物對、NAU2026引物對、NAU2277引物對、NAUl 186引物對和NAUl233引物對中的至少一個；所述CS62引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1085引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1102引物對由序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1255引物對由序列表的序列7所示的單鏈DNA分子和序列表的序列8所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2274引物對由序列表的序列9所不的單鏈DNA分子和序列表的序列10所不的單鏈DNA分子組成；所述嫩仍103引物對由序列表的序列11所示的單鏈DNA分子和序列表的序列12所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2026引物對由序列表的序列13所示的單鏈DNA分子和序列表的序列14所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2277引物對由序列表的序列15所示的單鏈DNA分子和序列表的序列16所示的單鏈DNA分子組成；所述NAUl 186引物對由序列表的序列17所不的單鏈DNA分子和序列表的序列18所不的單鏈DNA分子組成；所述NAU1233引物對由序列表的序列19所不的單鏈DNA分子和序列表的序列20所不的單鏈DNA分子組成。
[0013]所述棉花雜交種為鄂雜棉10號或瑞雜816。
[0014]本發(fā)明還保護(hù)一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種含有自交種的百分率的方法，包括如下步驟:
[0015](I)從制種農(nóng)戶的制種棉田里的隨機(jī)抽取待測棉鈴；
[0016](2)隨機(jī)抽取步驟(1)得到的棉鈴中的棉籽；
[0017](3)分別提取步驟(2)得到的棉籽的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA ；
[0018](4)分別以步驟(3)得到的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA為模板，采用SSR引物對進(jìn)行鑒定，得到種皮指紋圖譜和種仁指紋圖譜；
[0019]如果某一待測棉鈴中，抽樣檢測的所有棉籽的種仁指紋圖譜均與種皮指紋圖譜一致，該棉鈴為自交鈴；待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種含有自交種的百分率=自交鈴數(shù)量/待測棉鈴總數(shù)量X 100%。
[0020]所述SSR引物對為CS62引物對、NAU1085引物對、NAUl 102引物對、NAU1255引物對、NAU2274引物對、NAUl 103引物對、NAU2026引物對、NAU2277引物對、NAUl 186引物對和NAUl233引物對中的至少一個；所述CS62引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1085引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1102引物對由序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1255引物對由序列表的序列7所示的單鏈DNA分子和序列表的序列8所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2274弓丨物對由序列表的序列9所不的單鏈DNA分子和序列表的序列10所不的單鏈DNA分子組成；所述嫩仍103引物對由序列表的序列11所示的單鏈DNA分子和序列表的序列12所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2026引物對由序列表的序列13所示的單鏈DNA分子和序列表的序列14所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2277引物對由序列表的序列15所示的單鏈DNA分子和序列表的序列16所示的單鏈DNA分子組成；所述NAUl 186引物對由序列表的序列17所不的單鏈DNA分子和序列表的序列18所不的單鏈DNA分子組成；所述NAU1233引物對由序列表的序列19所不的單鏈DNA分子和序列表的序列20所不的單鏈DNA分子組成。
[0021]所述棉花雜交種為鄂雜棉10號或瑞雜816。
[0022]本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法在鑒定雜交棉純度中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明還保護(hù)一種引物組，由所述CS62引物對、所述NAU1085引物對、所述NAUl 102引物對、所述NAU1255引物對、所述NAU2274引物對、所述NAUl 103引物對、所述NAU2026引物對、所述NAU2277弓丨物對、所述NAU1186引物對和所述NAU1233引物對中的至少一個引物對組成。[0024]本發(fā)明還保護(hù)所述引物組在如下(a)或(b)中的應(yīng)用:(a)檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法；(b)檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種含有自交種的百分率。所述棉花雜交種為鄂雜棉10號或瑞雜816。
[0025]雜交種的制備過程中，將母本去雄后授予父本的花粉，長出的棉鈴中含有棉籽，棉籽的種皮(由胚珠的珠被發(fā)育來)應(yīng)為母本的指紋圖譜，而棉籽的種仁應(yīng)為F1代的指紋圖譜。如果某一棉鈴中，所有棉籽的種仁(或所有抽樣檢測的棉籽的種仁)的指紋圖譜與母本的指紋圖譜一致，說明此棉鈴為自交鈴。如果某一棉鈴中，棉籽的種仁有的為母本的指紋圖譜，有的為F1代的指紋圖譜，說明此棉鈴為剝大花所制的棉鈴，在剝花之前已部分授粉。如果某一棉鈴中，棉籽的種仁均為F1代的指紋圖譜，說明此棉鈴為目的雜交種。
[0026]由于本發(fā)明提供的方法與現(xiàn)有方法相比具有如下優(yōu)點(diǎn):(I)可以提前1-2個月時間，為種子的銷售贏得時間；(2)對檢測不合格的農(nóng)戶提前淘汰，省去加工和運(yùn)輸?shù)馁M(fèi)用；
(3)棉鈴殼厚，不易散失水分，比葉片好保存，異地取樣也不會氧化變質(zhì)，可以在棉花制種后期到制種農(nóng)戶田間隨機(jī)取棉鈴，帶回實(shí)驗(yàn)室后統(tǒng)一檢測。
[0027]本發(fā)明具有很大的實(shí)用價(jià)值和推廣價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為采用CS 62引物對擴(kuò)增的電泳圖譜。
[0029]圖2為采用NAU1085引物對擴(kuò)增的電泳圖譜。
[0030]圖3為采用NAU1102引物對擴(kuò)增的電泳圖譜。
[0031]圖4為采用NAU1255引物對擴(kuò)增的電泳圖譜。
[0032]圖5為采用NAU2274引物對擴(kuò)增的電泳圖譜。
[0033]圖6為采用NAU1103引物對擴(kuò)增的電泳圖譜。
[0034]圖7為采用NAU2026引物對擴(kuò)增的電泳圖譜。
[0035]圖8為采用NAU2277引物對擴(kuò)增的電泳圖譜。
[0036]圖9為采用CS62引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0037]圖10為采用NAU1085引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0038]圖11為采用NAUl 102引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0039]圖12為采用NAU1255引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0040]圖13為采用NAU2274引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0041]圖14為采用NAUl 103引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0042]圖15為采用NAU2026引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0043]圖16為采用NAU2277引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0044]圖17為采用NAU1186引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
[0045]圖18為采用NAU1233引物對擴(kuò)增的帶型放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0047]鄂雜棉10號(種子)為F1代，即將鄂雜棉10號的母本去雄后授予鄂雜棉10號的父本的花粉獲得的F1代種子，購自湖北惠民農(nóng)業(yè)科技有限公司。瑞雜816為F1代，即瑞雜816的母本去雄后授予瑞雜816的父本的花粉獲得的Fl代。瑞雜816的父本:濟(jì)南鑫瑞種業(yè)科技有限公司。瑞雜816的母本:濟(jì)南鑫瑞種業(yè)科技有限公司。
[0048]實(shí)施例1、
[0049]將鄂雜棉10號(種子)播種于田間，自然種植。待植株長出棉鈴后，隨機(jī)取一個代表植株，從該植株上隨機(jī)取2個葉片和I個棉鈴。從該棉鈴中隨機(jī)取24個棉籽。分別取每個棉籽的種皮和種仁。
[0050]1、分別提取各個樣本(葉片、種皮或種仁)的基因組DNA。
[0051]2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，分別采用8個SSR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0052]8個SSR引物對見表1。
[0053]表1 8個SSR引物對的核苷酸序列
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法，包括如下步驟: (1)從制種農(nóng)戶的制種棉田里隨機(jī)抽取待測棉鈴； (2)隨機(jī)抽取步驟(1)得到的棉鈴中的棉籽； (3)分別提取步驟(2)得到的棉籽的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA； (4)分別以步驟(3)得到的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA為模板，采用SSR引物對進(jìn)行鑒定，得到種皮指紋圖譜和種仁指紋圖譜； 如果某一待測棉鈴中，抽樣檢測的所有棉籽的種仁指紋圖譜均與種皮指紋圖譜一致，該棉鈴為自交鈴。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述SSR引物對為CS62引物對、NAU1085引物對、NAUl 102引物對、NAU1255引物對、NAU2274引物對、NAUl 103引物對、NAU2026引物對、NAU2277引物對、NAUl 186引物對和NAU1233引物對中的至少一個；所述CS62引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1085引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1102引物對由序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1255引物對由序列表的序列7所示的單鏈DNA分子和序列表的序列8所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2274引物對由序列表的序列9所示的單鏈DNA分子和序列表的序列10所示的單鏈DNA分子組成；所述嫩仍103引物對由序列表的序列11所不的單鏈DNA分子和序列表的序列12所不的單鏈DNA分子組成；所述NAU2026引物對由序列表的序列13所示的單鏈DNA分子和序列表的序列14所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2277引物對由序列表的序列15所示的單鏈DNA分子和序列表的序列16所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1186引物對由序列表的序列17所示的單鏈DNA分子和序列表的序列18所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1233引物對由序列表的序列19所示的單鏈DNA分子和序列表的序列20所不的單鏈DNA分子組成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述棉花雜交種為鄂雜棉10號或瑞雜816。
4.一種檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種含有自交種的百分率的方法，包括如下步驟: (1)從制種農(nóng)戶的制種棉田里的隨機(jī)抽取待測棉鈴； (2)隨機(jī)抽取步驟(1)得到的棉鈴中的棉籽； (3)分別提取步驟(2)得到的棉籽的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA； (4)分別以步驟(3)得到的種皮的基因組DNA和種仁的基因組DNA為模板，采用SSR引物對進(jìn)行鑒定，得到種皮指紋圖譜和種仁指紋圖譜； 如果某一待測棉鈴中，抽樣檢測的所有棉籽的種仁指紋圖譜均與種皮指紋圖譜一致，該棉鈴為自交鈴；待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種含有自交種的百分率=自交鈴數(shù)量/待測棉鈴總數(shù)量X 100%。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述SSR引物對為CS62引物對、NAU1085引物對、NAUl 102引物對、NAU1255引物對、NAU2274引物對、NAUl 103引物對、NAU2026引物對、NAU2277引物對、NAUl 186引物對和NAU1233引物對中的至少一個；所述CS62引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1085引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1102引物對由序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1255引物對由序列表的序列7所示的單鏈DNA分子和序列表的序列8所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2274引物對由序列表的序列9所示的單鏈DNA分子和序列表的序列10所示的單鏈DNA分子組成；所述嫩仍103引物對由序列表的序列11所不的單鏈DNA分子和序列表的序列12所不的單鏈DNA分子組成；所述NAU2026引物對由序列表的序列13所示的單鏈DNA分子和序列表的序列14所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2277引物對由序列表的序列15所示的單鏈DNA分子和序列表的序列16所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1186引物對由序列表的序列17所示的單鏈DNA分子和序列表的序列18所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1233引物對由序列表的序列19所示的單鏈DNA分子和序列表的序列20所不的單鏈DNA分子組成。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述棉花雜交種為鄂雜棉10號或瑞雜816。
7.權(quán)利要求1至6中任一所述的方法在鑒定雜交棉純度中的應(yīng)用。
8.一種引物組，由CS62引物對、NAU1085引物對、NAUl 102引物對、NAU1255引物對、NAU2274引物對、NAUl 103引物對、NAU2026引物對、NAU2277引物對、NAUl 186引物對和NAUl233引物對中的至少一個引物對組成；所述CS62引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1085引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1102引物對由序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1255引物對由序列表的序列7所示的單鏈DNA分子和序列表的序列8所示的單鏈DNA分子組成； 所述NAU2274引物對由序列表的序列9所示的單鏈DNA分子和序列表的序列10所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1103引物對由序列表的序列11所示的單鏈DNA分子和序列表的序列12所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2026引物對由序列表的序列13所示的單鏈DNA分子和序列表的序列14所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU2277引物對由序列表的序列15所不的單鏈DNA分子和序列表的序列16所不的單鏈DNA分子組成；所述NAUl 186引物對由序列表的序列17所示的單鏈DNA分子和序列表的序列18所示的單鏈DNA分子組成；所述NAU1233引物對由序列表的序列19所不的單鏈DNA分子和序列表的序列20所不的單鏈DNA分子組成。
9.權(quán)利要求8所述所述引物組的應(yīng)用，為如下(a)或(b): Ca)檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種中是否有自交種的方法；(b)檢測待測制種農(nóng)戶制備的棉花雜交種含有自交種的百分率。所述棉花雜交種為鄂雜棉10號或瑞雜816。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述棉花雜交種為鄂雜棉10號或瑞雜
816。
【文檔編號】C12N15/11GK103589799SQ201310574535
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】付小瓊, 楊付新, 葉武威 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所