一種單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型的建立及活化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種建立單純皰疹病毒I型（HSV-1）體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞模型的方法，其特征包括如下步驟：原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)，HSV-1靜止感染誘導(dǎo)后的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中HSV-1的活化及靜止感染的HSV-1在細(xì)胞內(nèi)成功活化的驗證。本發(fā)明的方法的優(yōu)點在于為研究單純皰疹病毒性角膜炎潛伏和復(fù)發(fā)的機(jī)制以及研制抑制其復(fù)發(fā)的藥物提供了一個經(jīng)濟(jì)、省時、表現(xiàn)均一且重現(xiàn)性良好的HSV-1體外靜止感染細(xì)胞并可成功活化的模型。
【專利說明】一種單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型的建立及活化方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物模型構(gòu)建【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型的建立及活化方法，即用單純皰疹病毒I型(HSV-1)體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞來模擬潛伏期單皰病毒性角膜炎的細(xì)胞模型。
【背景技術(shù)】
[0002]單純皰疹病毒I型(HSV-1)感染角膜所致的單皰病毒性角膜炎是一種嚴(yán)重的致盲性眼病，臨床上尤以基質(zhì)型最為常見。HSV-1的原發(fā)感染通常是無明顯癥狀的，但病毒從此可在宿主體內(nèi)潛伏。最近的研究表明在92%的正常人中可以通過PCR檢測到HSV-1的DNA。HSV-1復(fù)發(fā)感染可以引起眼部病變，反復(fù)復(fù)發(fā)還可以引起角膜瘢痕形成、新生血管化，甚至失明。在美國，每年大約有59萬的新發(fā)病例，其中25-42%的病人初發(fā)1-2年間又復(fù)發(fā)；而在我國城市盲目的調(diào)查中，角膜致盲占第二位，其中HSK引起的占角膜盲的首位(42.5%)。目前對于HSK還沒有根治的藥物或手術(shù)治療方法，最終需要進(jìn)行角膜移植治療，這也是HSK在美國成為穿透性角膜移植手術(shù)數(shù)目第三位的主要原因。研究表明HSK難以治愈的主要原因是HSV-1可以在宿主體內(nèi)建立潛伏，并反復(fù)復(fù)發(fā)，而對于潛伏建立、維持和復(fù)發(fā)的具體機(jī)制還并不清楚，故加強(qiáng)對本病潛伏、復(fù)發(fā)機(jī)制和臨床對策的研究，已成為眼科亟待解決的課題。
[0003]HSV-1具有嗜神經(jīng)特性，三叉神經(jīng)節(jié)是國內(nèi)外公認(rèn)的HSV-1在體內(nèi)的潛伏部位，但更多的實驗證據(jù)和臨床現(xiàn)象表明角膜是HSV-1在體內(nèi)潛伏的又一部位。HSV-1能夠在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏感染是由病毒抗原、神經(jīng)細(xì)胞及宿主免疫反應(yīng)三者共同作用的結(jié)果，然而對于HSV-1在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏的純基礎(chǔ)研究成果并未對解決單皰病毒性角膜炎反復(fù)發(fā)作提出建設(shè)性意見。越來越多的研究表明HSV-1也能夠在角膜內(nèi)潛伏，但目前僅限于在潛伏期宿主角膜內(nèi)可以檢測到病毒核酸或抗原，而對于HSV-1角膜內(nèi)潛伏復(fù)發(fā)的機(jī)理還未有研究。
[0004]要研究HSV-1在角膜內(nèi)潛伏復(fù)發(fā)的機(jī)理，那么建立HSV-1在角膜內(nèi)潛伏復(fù)發(fā)的模型就很有必要。體內(nèi)的動物模型目前已經(jīng)在兔和小鼠角膜內(nèi)成功建立，其方法就是HSV-1感染劃傷的角膜，經(jīng)過炎癥較為嚴(yán)重的急性感染期后，角膜慢慢恢復(fù)透明，感染1-2個月后，HSV-1進(jìn)入潛伏感染，然后利用250-300mJ/cm2強(qiáng)度的UV-B照射角膜，潛伏的HSV-1就可以活化，再次引發(fā)角膜炎。然而體內(nèi)潛伏復(fù)發(fā)的模型并不十分穩(wěn)定，動物間個體差異往往較大；每次的研究都需要一批的動物，造價往往較大；而且前后需要的時間也比較長；體內(nèi)模型對于機(jī)理的研究并沒有細(xì)胞模型那么方便。因此很有必要建立一種HSV-1在角膜細(xì)胞內(nèi)潛伏感染的體外模型的方法，從而更方便準(zhǔn)確的研究單皰病毒性角膜炎潛伏復(fù)發(fā)的機(jī)理，以及探討并評價抑制其反復(fù)復(fù)發(fā)的藥物。而目前為止，尚未見到有HSV-1在角膜細(xì)胞內(nèi)建立體外靜止感染并活化 的模型報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種建立單純皰疹病毒I型體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞模型的方法，以便更準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的研究單皰病毒性角膜炎潛伏復(fù)發(fā)的機(jī)理，并進(jìn)一步尋找抑制其反復(fù)復(fù)發(fā)的藥物，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。[0006]本發(fā)明的方法，包括如下的步驟:
[0007]I)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)
[0008]將去掉內(nèi)皮的兔角膜酶解消化處理后，去掉上皮層并剪成小塊，放入細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)的原代角膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞消化液消化后用于后續(xù)的細(xì)胞誘導(dǎo)分化；
[0009]其中所述的酶解消化，是將角膜放入Dispase酶中，4°C孵育過夜；然后放入37°C繼續(xù)消化30分鐘；
[0010]所述的細(xì)胞培養(yǎng)液的組成為DMEM-F12，且添加了 10%(v/v)的FBS、終濃度為100U/mL青霉素和0.lmg/mL的鏈霉素；細(xì)胞經(jīng)消化液為添加有0.25% (w/v)胰酶的0.02% (w/v)EDTA溶液。
[0011]2)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)
[0012]將步驟I)制備的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞先用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞長至單層，然后換細(xì)胞誘導(dǎo)分化液對角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)分化，37°C條件下誘導(dǎo)分化7-10天，3-4天換液一次；
[0013]所述的細(xì)胞誘導(dǎo)分化液為DMEM-F12，且添加有1% (w/v)BSA, 50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，青鏈霉素雙抗(終濃度分別為100U/mL和0.lmg/mL)
[0014]3) HSV-1靜止感染誘導(dǎo)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞
[0015]HSV-1靜止感染角膜基質(zhì)細(xì)胞前一天，將細(xì)胞誘導(dǎo)分化液換成靜止感染維持液，37°C孵育24hrs，然后加入0.1-1M0I的HSV-1，37°C感染過夜；吸棄HSV-1后加入新的靜止感染維持液繼續(xù)培養(yǎng)9天完成細(xì)胞模型的建立。
[0016]其中靜止感染維持液為DMEM-F12，且加入1%BSA，50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF, 100 u M阿昔洛韋ACV，青鏈霉素雙抗終(濃度分別為100U/mL和0.lmg/mL)；
[0017]本發(fā)明還提供構(gòu)建的單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型的活化方法，是向細(xì)胞模型中加入病毒激活因子Forskolin在37 °C孵育完成活化。
[0018]本發(fā)明的單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型活化的驗證，是利用FITC直標(biāo)的抗HSV-1的抗體對HSV-1病毒抗原進(jìn)行免疫熒光檢測；或提取激活組和未激活組細(xì)胞的總RNA，利用試劑盒反轉(zhuǎn)錄后成cDNA后，采用HSV-1病毒包膜糖蛋白gC的探針引物通過Realtime-PCR對HSV-1病毒mRNA進(jìn)行檢測，從而確定HSV-1活化與否。
[0019]本發(fā)明的模型建立方法具有很好的重現(xiàn)性，在原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞獲得后，HSV-1在體外細(xì)胞內(nèi)潛伏和活化的整個實驗流程大約需要20天的時間，相比HSV-1在體內(nèi)動物水平建立潛伏感染就需要45天的時間來說省時多了。最關(guān)鍵的是動物水平個體差異較大，每一只動物都需要監(jiān)測和評估，從而進(jìn)行HSV-1成功潛伏感染并能成功復(fù)發(fā)動物模型篩選，而細(xì)胞水平則表現(xiàn)較為一致，不存在個體差異較大的困擾。綜上，本發(fā)明方法對于研究單純皰疹病毒性角膜炎潛伏和復(fù)發(fā)的機(jī)制以及研制抑制其復(fù)發(fā)的藥物提供了一個經(jīng)濟(jì)省時、表現(xiàn)均一且重現(xiàn)性良好的HSV-1體外靜止感染細(xì)胞，并可成功活化的模型。【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:不同培養(yǎng)時期的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)圖。
[0021]A.從兔角膜基質(zhì)組織塊中剛爬出的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0022]B.爬出的細(xì)胞長滿6孔板時的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0023]圖2 ；HSV-1靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞不同時期的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0024]A、誘導(dǎo)分化前的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞；
[0025]B、誘導(dǎo)分化后的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞；
[0026]C、HSV-1靜止感染后9天的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞；
[0027]D、HSV-1激活后2天的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞。
[0028]圖3:免疫熒光檢測HSV-1靜止感染和激活狀態(tài)下的病毒顆粒。
[0029]A、原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞在HSV-1靜止感染時細(xì)胞中HSV-1抗原；
[0030]B、HSV-1被活化后細(xì)胞中的病毒HSV-1抗原。
[0031]圖4 =Realtime-PCR檢測HSV-1靜止感染和激活狀態(tài)下HSV-1的mRNA。
[0032]圖5 =Realtime-PCR檢測HSV-1靜止感染和激活狀態(tài)下人IL-17的mRNA。
【具體實施方式】
[0033]為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
及特點，茲舉例以下實施例，并配合附圖詳細(xì)說明，請參閱附圖1-5。下述實施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)實驗方法。
[0034]本發(fā)明采用原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞建立HSV-1體外靜止感染角膜基質(zhì)細(xì)胞的模型，構(gòu)建方法的步驟為原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)，HSV-1靜止感染誘導(dǎo)后的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中HSV-1的活化及靜止感染的HSV-1在細(xì)胞內(nèi)成功活化的驗證。
[0035]實施例1HSV-1體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞模型的建立，如圖1-4所示。
[0036]1)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
[0037]無菌條件下取新西蘭大白兔眼球(2個)，無菌生理鹽水中反復(fù)沖洗，放入含有妥布霉素(1000U/mL)的生理鹽水中浸泡15分鐘，無菌生理鹽水反復(fù)沖洗5min。沿角膜緣剪下角膜，在顯微鏡下撕除角膜內(nèi)皮，然后將角膜放入盛有Dispase酶(2.4U/mL)的24孔板中，放在4°C冰箱內(nèi)孵育過夜。次日再移入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)消化30分鐘。然后，將角膜移入盛有無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，利用平鑷撕去已消化完全的上皮層。將角膜基質(zhì)用角膜剪剪成2_2左右的小塊，平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM-F12，10%FBS，青鏈霉素雙抗)潤過的6孔板中，每孔放4塊。組織塊放于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁2hr后，補(bǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液浸過組織塊。然后繼續(xù)放37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱，等待基質(zhì)細(xì)胞從組織塊內(nèi)爬出，3-4天換液一次。待角膜基質(zhì)細(xì)胞長滿6孔板時，將角膜組織塊重新移入新的6孔板繼續(xù)上述培養(yǎng)，將角膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)消化液(0.25%胰酶-0.0296EDTA)消化后，傳代于新的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以用于后續(xù)的細(xì)胞誘導(dǎo)分化。圖1顯示的是剛從兔角膜基質(zhì)組織塊中爬出的基質(zhì)細(xì)胞(A)和長滿6孔板時的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞(B)形態(tài)圖，剛爬出的兔原代角膜基質(zhì)細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則三角形，長滿6孔板時細(xì)胞形態(tài)基本變?yōu)殚L梭形。
[0038]2)體外培養(yǎng)的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)
[0039]接種于24孔板的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞先用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞長至單層，然后換細(xì)胞誘導(dǎo)分化液(DMEM-F12，1%BSA, 50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，青鏈霉素雙抗)對角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)分化，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)誘導(dǎo)分化7-10天，3-4天換液一次。圖2A所示為誘導(dǎo)分化前的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)與原代分離剛長滿6孔板時一樣，為長梭形；圖2B所示為誘導(dǎo)分化后的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)雖仍是不規(guī)則的長梭形，但已有點變圓，而且細(xì)胞向周圍伸發(fā)出很多類似神經(jīng)絲的絲狀體。[0040]3) HSV-1靜止感染誘導(dǎo)后的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞
[0041]HSV-1靜止感染角膜基質(zhì)細(xì)胞前一天，將細(xì)胞誘導(dǎo)分化液換成靜止感染維持液(DMEM-Fl2,1%BSA, 50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，100 u M阿昔洛韋ACV，青鏈霉素雙抗)，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24hrs，然后加入0.1-1M0I的HSV-1 (Mckrae)，37°C感染過夜。次日，吸棄HSV-1，加入新的靜止感染維持液繼續(xù)培養(yǎng)9天，2-3天換液一次。HSV-1體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞模型建立。圖2C所示為HSV-1靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞9天時的細(xì)胞形態(tài)，與誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)類似，只是細(xì)胞更加變圓一些，而且神經(jīng)絲狀體也更長一些。
[0042]4)體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中HSV-1的活化
[0043]向HSV-1靜止感染的細(xì)胞中加入病毒激活因子Forskolin50 U M,不加Forskolin的作同步對照。加入Forskolin的實驗組37°C孵育1_2天后，即可觀察到HSV-1活化,細(xì)胞產(chǎn)生CPE。圖2D所示為HSV-1經(jīng)Forskolin激活后2天的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)為典型的細(xì)胞病變狀態(tài)，細(xì)胞變圓變空泡，成簇，脫落。
[0044]5)靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的HSV-1活化的驗證
[0045]HSV-1靜止感染和HSV-1經(jīng)Forskolin活化的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，加入山羊血清封閉Ihr后，PBS洗3遍，加入FITC直標(biāo)的抗HSV-1的抗體(1:100稀釋，DAKO, Carpinteria，USA)，37 °C孵育Ihr后，PBS洗3遍，直接放激光共聚焦顯微鏡下觀察HSV-1病毒顆粒(陽性應(yīng)顯綠色熒光)。圖3所示為細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)檢測H SV-1病毒顆粒，經(jīng)Forskolin激活的細(xì)胞中可以檢測到HSV-1抗原(綠色熒光)，未經(jīng)活化的對照組檢測不到綠色熒光。同時利用常規(guī)Trizol提取RNA的方法提取HSV-1靜止感染和HSV-1經(jīng)Forskolin活化的原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的總RNA，利用PrinieScripl^ 1ststrand cDNA synthesis kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后利用HSV-1病毒的包膜糖蛋白gC的探針引物(R，5' -GATGTTGTACCCGGTCACGAA-3 ' ;F，5' -TAGGGCCAACACTAAAGA-3 ' ；P,5' -TGTTGGCCTTCATGACCCTTGTGAA-3')通過 Realtime-PCR 對 HSV-1 病毒 mRNA 進(jìn)行檢測，從而確定HSV-1活化。圖4所示為通過Realtime-PCR對HSV-1病毒的mRNA進(jìn)行檢測，HSV-1被激活后，細(xì)胞內(nèi)HSV-1的mRNA比靜止感染時顯著增多。
[0046]在本發(fā)明中，采用了經(jīng)典CPE，細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)檢測HSV-1抗原，Realtime-PCR檢測HSV-1的mRNA三種方法對HSV-1在原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中體外靜止感染與成功活化進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明本發(fā)明所建立的HSV-1體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的模型中HSV-1確實處于一種相對靜止的潛伏感染狀態(tài)，而且靜止的HSV-1可以被激活活化，致使細(xì)胞產(chǎn)生CPE反應(yīng)。本發(fā)明所建立的模型有很好的重現(xiàn)性，而且在細(xì)胞水平的實驗相對動物水平的實驗更經(jīng)濟(jì)、省時，且表現(xiàn)的一致性更好。
[0047]實施例2:本發(fā)明所建立的HSV-1體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞模型用于單皰病毒性角膜炎潛伏-復(fù)發(fā)的相關(guān)細(xì)胞因子研究[0048]HSV-1體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞模型的建立同實施例1中1-4的方法，然后將激活組和未激活對照組的細(xì)胞分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Realtime-PCR檢測各種細(xì)胞因子，包括Thl型細(xì)胞因子IFN- y，Th2型細(xì)胞因子IL-4，Thl7型細(xì)胞因子IL-17，以及前期炎性因子IL-6，TNF-a，以及各種受體TLR，NLR等相關(guān)因子的表達(dá)情況，從而確定在HSV-1在角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)活化過程中發(fā)揮作用的細(xì)胞因子，免疫細(xì)胞類型和相關(guān)的信號通路。對病毒性角膜炎病發(fā)時發(fā)揮重要作用的Thl7型細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示HSV-1被激活后IL-17的表達(dá)量比靜止期明顯升高，這和體內(nèi)動物HSK模型由潛伏到復(fù)發(fā)的IL-17表達(dá)變化一致(圖5)。
[0049]實施例3:本發(fā)明所建立的HSV-1體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞模型用于評價抑制單皰病毒性角膜炎潛伏-復(fù)發(fā)的藥物作用研究
[0050]HSV-1體外靜止感染原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞模型的建立同實施例1中1-3的方法，在用Forskolin激活HSV-1的同時設(shè)置3組加入不同濃度的抗病毒活性物質(zhì)，不加Forskolin和只加Forskolin作為對照，然后觀察角膜基質(zhì)細(xì)胞形成CPE的時間，以及提取RNA，利用Realtime-PCR檢測HSV-1的量，從而確定此抗病毒活性物質(zhì)的有效性及有效濃度。實驗檢測了臨床常用抗HSV-1病毒的藥物阿昔洛韋ACV對從靜止期被激活后的HSV-1的殺傷效果，發(fā)現(xiàn)加ACV后有效的保護(hù)了角膜基質(zhì)細(xì)胞免受活化的病毒感染。上述結(jié)果表明本發(fā)明方法構(gòu)建的模型可以有效的用于HSV-1的病理學(xué)研究。
【權(quán)利要求】
1.一種單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型的建立方法，包括如下的步驟: 1)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 將去掉內(nèi)皮的兔角膜酶解消化處理后,去掉上皮層并剪成小塊,放入細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)的原代角膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞消化液消化后用于后續(xù)的細(xì)胞誘導(dǎo)分化； 2)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo) 將步驟I)制備的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞先用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞長至單層，然后換細(xì)胞誘導(dǎo)分化液對角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)潛質(zhì)誘導(dǎo)分化，37°C條件下誘導(dǎo)分化7-10天，3-4天換液一次； 3)HSV-1靜止感染誘導(dǎo)原代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞 HSV-1靜止感染角膜基質(zhì)細(xì)胞前一天，將細(xì)胞誘導(dǎo)分化液換成靜止感染維持液，37°C孵育24hrs，然后加入0.1-1MOI的HSV-1，37°C感染過夜；吸棄HSV-1后加入新的靜止感染維持液繼續(xù)培養(yǎng)9天完成細(xì)胞模型建立。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的I)中的酶解消化，是將角膜放入Dispase酶中，4°C孵育過夜；然后放入37°C繼續(xù)消化30分鐘完成的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的I)中的細(xì)胞培養(yǎng)液的組成為DMEM-F12，且添加了 10% (v/v)的FBS、終濃度為100U/mL青霉素和0.lmg/mL的鏈霉素；細(xì)胞經(jīng)消化液為添加有0.25% (w/v)胰酶的0.02% (w/v) EDTA溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的2)中細(xì)胞誘導(dǎo)分化液為DMEM-F12，且添加有l(wèi)%(w/v)BSA，50n`g/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，終濃度分別為100U/mL和0.1mg/mL的青霉素和鏈霉素。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的2)中的細(xì)胞誘導(dǎo)分化液為DMEM-F12，且添加有1% (w/v) BSA, 50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，終濃度分別為100U/mL和0.lmg/mL的青霉素和鏈霉素。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的2)中的靜止感染維持液為DMEM-F12，且加入1%BSA，50ng/mL注射用鼠神經(jīng)生長因子NGF，100 u M阿昔洛韋ACV，終濃度分別為100U/mL和0.lmg/mL的青霉素和鏈霉素。
7.一種單皰病毒潛伏感染細(xì)胞模型；其特征在于，所述的模型是由權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建的。
8.權(quán)利要求7所述模型的活化方法，其特征在于，是向細(xì)胞模型中加入病毒激活因子Forskolin在37°C孵育完成活化。
【文檔編號】C12N5/071GK103667175SQ201310574457
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月17日
【發(fā)明者】趙格, 陳豪, 袁青, 謝立信 申請人:山東省眼科研究所