一種規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種規(guī)模化培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，藻種室內(nèi)培養(yǎng)一定量的發(fā)狀念珠藻，將藻種室培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液按體積比1:1到1:5接種至戶外已經(jīng)加入營養(yǎng)鹽的管式光生物反應(yīng)器中，同時補(bǔ)加適量營養(yǎng)鹽；戶外按1:1-1:5的比例進(jìn)行逐級放大培養(yǎng)，放大的同時補(bǔ)加營養(yǎng)鹽，最終采收。本發(fā)明對傳統(tǒng)培養(yǎng)藍(lán)藻的BG11培養(yǎng)基進(jìn)行了改進(jìn)，使培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻生長速度更快，結(jié)果表明，該方法簡單實(shí)用，發(fā)狀念珠藻生長速率快，操作可控，不易發(fā)生污染，可以實(shí)現(xiàn)對發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的穩(wěn)定地連續(xù)生產(chǎn)。
【專利說明】一種規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法。【背景技術(shù)】
[0002]發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)俗名發(fā)菜，是一種極端陸生固氮藍(lán)細(xì)菌,具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，其熱水浸提物一發(fā)菜多糖具有抗癌和抗病毒活性。天然條件下野生發(fā)菜生長速度緩慢，遠(yuǎn)不能滿足市場的需求，無節(jié)制的亂采濫挖導(dǎo)致了嚴(yán)重的土壤沙漠化。自2000年起，我國政府出于保護(hù)發(fā)菜資源和生態(tài)環(huán)境的目的，全面禁止發(fā)菜的采收和銷售。因此，為實(shí)現(xiàn)發(fā)菜這種資源的可持續(xù)利用，必須探索人工培養(yǎng)技術(shù)，以進(jìn)行發(fā)菜的工業(yè)化生產(chǎn)，滿足市場需求。
[0003]發(fā)狀念珠藻人工培養(yǎng)主要集中在兩個方面:固態(tài)培養(yǎng)和細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)。發(fā)菜細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)能夠提高發(fā)狀念珠藻的生長速度，培養(yǎng)條件容易控制，并在培養(yǎng)過程中同時積累胞外多糖和莢膜多糖。
[0004]目前，實(shí)現(xiàn)光合自養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞較大規(guī)模培養(yǎng)的方法主要是開放池式培養(yǎng)系統(tǒng)和氣升式封閉培養(yǎng)系統(tǒng)，但規(guī)模都較小，僅限于實(shí)驗室中培養(yǎng)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處在于，提供一種生長速度更快、方法簡單實(shí)用、操作可控的規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，本方法采用戶外條件下管式光生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻。
[0006]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
[0007]一種規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，步驟如下
[0008]⑴培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻種子液；
[0009]⑵將培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻種子液按體積比1:1到1:3接種至戶外光生物反應(yīng)器中；
[0010]⑶戶外光生物反應(yīng)器按比例為1:1一1:5進(jìn)行放大培養(yǎng)，最終采收。
[0011]2、根據(jù)權(quán)利要求書I所述的規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基配方為:無水氯化鈣0.02-0.03g/L ;七水硫酸鎂0.8-1.0g/L ;硝酸鈉1.0-1.5g/L ;七水硫酸亞鐵0.005-0.01g/L ;九水硅酸鈉0.5-0.6g/L ;磷酸二氫鉀0.1-0.2g/L ;碳酸氫鈉 0.5-2.0g/L ；EDTA 二鈉 0.01-0.02g/L。
[0012]而且，所述培養(yǎng)基用水為經(jīng)膜過濾的地下井水。
[0013]而且，所述分階段培養(yǎng)的步驟如下:
[0014]第一階段:藻種室內(nèi)罐徑為30cm,高120cm的氣升式光生物反應(yīng)器,外置光源,光照強(qiáng)度30001ux，25°C，接種密度10%條件下培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞60L，經(jīng)過培養(yǎng)至密度為0D4200.8 ；
[0015]第二階段:將在藻種室內(nèi)培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻細(xì)胞濃縮收集后接種到戶外自然光下，管徑為Φ50的150L管式光生物反應(yīng)器中補(bǔ)充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，控制溫度< 30°C，光照強(qiáng)度控制在400001ux以下，通過二氧化碳在線控制儀控制pH為8.0-9.0，經(jīng)培養(yǎng)，培養(yǎng)濃度至 0D420 值 0.9 ;
[0016]第三階段:將150L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移到戶外管徑為Φ 110的500L管式光生物反應(yīng)器中，同時補(bǔ)加150L培養(yǎng)時1/3的營養(yǎng)鹽,控制溫度(30°C，光照強(qiáng)度控制在600001ux以下，通過二氧化碳在線控制儀控制pH為8.0-9.0，經(jīng)培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為0D420值0.9 ;
[0017]第四階段:將500L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移到戶外管徑為Φ150的1000L管式光生物反應(yīng)器中，同時補(bǔ)加500L培養(yǎng)時1/3的營養(yǎng)鹽，控制溫度(30°C,光照強(qiáng)度控制在800001ux以下,補(bǔ)充培養(yǎng)基,通過二氧化碳在線控制儀控制pH為8.0-9.0,經(jīng)培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為0D420值0.9 ;
[0018]第五階段: 將1000L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移至沉淀池進(jìn)行沉淀去掉上清液，藻泥洗滌2~3次，對洗滌完畢的藻泥收集進(jìn)行噴霧干燥，收集藻粉；
[0019]所述步驟一至步驟五采用的培養(yǎng)基為:無水氯化鈣，0.027g/L ;七水硫酸鎂0.8g/L ;硝酸鈉1.5g/L ;七水硫酸亞鐵0.01g/L ;九水硅酸鈉0.6g/L ;磷酸二氫鉀0.15g/L ;碳酸氫鈉 1.0g/L ；EDTA 二鈉 0.02g/L。
[0020]而且，所述培養(yǎng)液中通入食品級二氧化碳調(diào)節(jié)其pH值，使其維持發(fā)狀念珠藻生長的 pH 值為 8.0-9.0。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
[0022]1、本發(fā)明得到的發(fā)狀念珠藻細(xì)胞可以用作開發(fā)保健品，制成傳統(tǒng)發(fā)菜食品以及提取發(fā)菜多糖用于醫(yī)藥或保健品等用途。
[0023]2、本發(fā)明首次采用管式光生物反應(yīng)器將微藻進(jìn)行戶外培養(yǎng)，以前都是實(shí)驗室人造光源下的小規(guī)模培養(yǎng)，光生物反應(yīng)器具有單位體積藻液受光面積大、藻細(xì)胞分布均勻、光和效率較高、不易污染、溫度、PH等條件容易控制且維護(hù)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
[0024]3、本發(fā)明對傳統(tǒng)培養(yǎng)藍(lán)藻的BGll培養(yǎng)基進(jìn)行了改進(jìn)，轉(zhuǎn)移的戶外培養(yǎng)，利用自然界光源，使培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻生長速度更快，通過實(shí)地驗證結(jié)果表明，本方法簡單實(shí)用，發(fā)狀念珠藻生長速率快、操作可控、不易發(fā)生污染，可以實(shí)現(xiàn)對發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的穩(wěn)定地連續(xù)生產(chǎn)。
[0025]具體實(shí)施案例
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]一種規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，步驟如下:
[0028]⑴室內(nèi)恒溫恒光照強(qiáng)度下培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻；⑵將室內(nèi)培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻液按體積比1:1到1:3接種至戶外光生物反應(yīng)器中；ω戶外光生物反應(yīng)器按比例為1:1一1:5進(jìn)行放大培養(yǎng)，最終采收。
[0029]所采用的培養(yǎng)基配方為改良的BGll培養(yǎng)基配方為:無水氯化鈣，0.02-0.03g/L ；七水硫酸鎂0.8-1.0g/L ;硝酸鈉1.0-1.5g/L ;七水硫酸亞鐵0.005-0.01g/L ;九水硅酸鈉
0.5-0.6g/L ;磷酸二氫鉀 0.1-0.2g/L ;碳酸氫鈉 0.5-2.0g/L ；EDTA 二鈉 0.01-0.02g/L ;培養(yǎng)基用水為經(jīng)膜過濾的地下井水。通過向培養(yǎng)液中通入食品級二氧化碳調(diào)節(jié)其PH值，使其維持發(fā)狀念珠藻生長的最適PH值。[0030]具體步驟如下
[0031]以下步驟采取的培養(yǎng)基為:無水氯化鈣，0.027g/L ;七水硫酸鎂0.8g/L ;硝酸鈉
1.5g/L ;七水硫酸亞鐵0.01g/L ;九水娃酸鈉0.6g/L ;磷酸二氫鉀0.15g/L ;碳酸氫鈉1.0g/L ；EDTA 二鈉0.02g/L ;培養(yǎng)基用水為經(jīng)膜(膜的孔徑)過濾的地下井水。上述培養(yǎng)基未添加微量元素。以下各步驟均采用上述培養(yǎng)基。
[0032]第一階段:藻種室內(nèi)罐徑為30cm，高120cm的氣升式光生物反應(yīng)器，外置光源，光照強(qiáng)度30001uX，250C，接種密度10%條件下培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞60L，經(jīng)過八天培養(yǎng)，細(xì)胞密度為0D4200.8 ；
[0033]第二階段:將在藻種室內(nèi)培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻細(xì)胞濃縮收集后接種到戶外自然光下，管徑為Φ50的150L管式光生物反應(yīng)器中補(bǔ)充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，控制溫度< 30°C，光照強(qiáng)度控制在400001ux以下，通過二氧化碳在線控制儀控制pH為8.0-9.0，經(jīng)六天培養(yǎng)，培養(yǎng)濃度至 0D420 {t0.9 ；
[0034]第三階段:將150L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移到戶外管徑為Φ 110的500L管式光生物反應(yīng)器中，同時補(bǔ)加150L培養(yǎng)時1/3的營養(yǎng)鹽,控制溫度(30°C，光照強(qiáng)度控制在600001ux以下，通過二氧化碳在線控制儀控制pH為8.0-9.0，經(jīng)八天培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為0D420值0.9 ;
[0035]第四階段:將500L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移到戶外管徑為Φ150的1000L管式光生物反應(yīng)器中，同時補(bǔ)加500L培養(yǎng)時1/3的營養(yǎng)鹽，控制溫度(30°C,光照強(qiáng)度控制在800001ux以下,補(bǔ)充培養(yǎng)基,通過二氧化碳在線控制儀控制pH為
8.0-9.0,經(jīng)五天培養(yǎng)至細(xì)胞濃·度為0D420值0.9 ;
[0036]第五階段:將1000L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移至沉淀池進(jìn)行沉淀去掉上清液，藻泥洗滌2~3次；
[0037]對洗滌完畢的藻泥收集進(jìn)行噴霧干燥，收集藻粉；
[0038]清洗管式光生物反應(yīng)器。
【權(quán)利要求】
1.一種規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，其特征在于:步驟如下 ⑴培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻種子液； ⑵將培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻種子液按體積比1:1到1:3接種至戶外光生物反應(yīng)器中； ⑶戶外光生物反應(yīng)器按比例為1:1一1:5進(jìn)行放大培養(yǎng)，最終采收。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基配方為:無水氯化鈣0.02-0.03g/L ;七水硫酸鎂0.8-1.0g/L ;硝酸鈉1.0-1.5g/L ;七水硫酸亞鐵0.005-0.01g/L ;九水硅酸鈉0.5-0.6g/L ;磷酸二氫鉀0.1-0.2g/L ;碳酸氫鈉0.5-2.0g/L ；EDTA 二鈉 0.01-0.02g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的規(guī)模化培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基用水為經(jīng)膜過濾的地下井水。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，其特征在于:所述分階段培養(yǎng)的步驟如下: 第一階段:藻種室內(nèi)罐徑為30cm，高120cm的氣升式光生物反應(yīng)器，外置光源，光照強(qiáng)度30001ux，25°C，接種密度10%條件下培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞60L，經(jīng)過培養(yǎng)至密度為0D4200.8 ； 第二階段:將在藻種室內(nèi)培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻細(xì)胞濃縮收集后接種到戶外自然光下，管徑為φ50的150L管式光生物反應(yīng)器中補(bǔ)充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，控制溫度< 30°C，光照強(qiáng)度控制在400001ux以下，通過二氧化碳在線控制儀控制pH為8.0-9.0,經(jīng)培養(yǎng)，培養(yǎng)濃度至0D420 值 0.9 ; 第三階段:將150L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移到戶外管徑為φ--υ的500L管式光生物反應(yīng)器中，同時補(bǔ)加150L培養(yǎng)時1/3的營養(yǎng)鹽，控制溫度≤30°C，允照強(qiáng)度控制在600001ux以下,通過二氧化碳在線控制儀控制pH為8.0-9.0,經(jīng)培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為0D420值0.9 ; 第四階段:將500L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移到戶外管徑為φ150的1000L管式光生物反應(yīng)器中，同時補(bǔ)加500L培養(yǎng)時1/3的營養(yǎng)鹽，控制溫度≤30°C,光照強(qiáng)度控制在800001ux以下，補(bǔ)充培養(yǎng)基，通過二氧化碳在線控制儀控制pH為8.0-9.0，經(jīng)培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為0D420值0.9 ; 第五階段:將1000L管式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的發(fā)狀念珠藻藻液轉(zhuǎn)移至沉淀池進(jìn)行沉淀去掉上清液，藻泥洗滌2~3次，對洗滌完畢的藻泥收集進(jìn)行噴霧干燥，收集藻粉； 所述步驟一至步驟五采用的培養(yǎng)基為:無水氯化鈣，0.027g/L ;七水硫酸鎂0.8g/L ;硝酸鈉1.5g/L ;七水硫酸亞鐵0.01g/L ;九水娃酸鈉0.6g/L ;磷酸二氫鉀0.15g/L ;碳酸氫鈉1.0g/L ；EDTA 二鈉 0.02g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的規(guī)?；囵B(yǎng)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)液中通入食品級二氧化碳調(diào)節(jié)其PH值，使其維持發(fā)狀念珠藻生長的pH值為8.0-9.0。
【文檔編號】C12N1/20GK103710280SQ201310561422
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】賈士儒, 肖玉朋, 戴玉杰, 鄭行, 呂和鑫, 岳利芳, 李清亮, 韓培培, 譚之磊 申請人:天津科技大學(xué)