雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，發(fā)明人通過添加聚乙二醇和外源性葡聚糖構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系，從而建立了本發(fā)明的方法。該法解決了目前采用硫酸銨沉淀法、膜分離法等分離右旋糖酐蔗糖酶的方法存在酶活回收率低、操作困難、單一方法分離純度低等問題。本發(fā)明綠色環(huán)保、安全高效、操作簡單，耗時短,可適用于短時間內(nèi)快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶。
【專利說明】雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分離工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase,系統(tǒng)分類號EC2.4.1.5)屬于糖酐水解酶70家族(Family70)，由腸膜明串珠菌發(fā)酵獲得，是一種催化蔗糖合成右旋糖酐的糖基轉(zhuǎn)移酶，催化合成的右旋糖酐可作為血漿代用品，在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)均具有廣泛的應(yīng)用。但是， 腸膜明串珠菌發(fā)酵得到的右旋糖酐蔗糖酶含有多種雜質(zhì)，與產(chǎn)物葡聚糖混合在一起，以致粗酶液非常粘稠，給酶的分離純化造成了極大的困難。
[0003]目前，有多種方法可用于右旋糖酐蔗糖酶的分離純化，如硫酸銨沉淀法、超濾、有機溶劑沉淀法、色譜分離等。硫酸銨沉淀法在很大程度上損傷了右旋糖酐蔗糖酶的活性，當(dāng)用質(zhì)量濃度超過80%的硫酸銨處理時，酶活回收率不超過10%。超濾法雖具有較高的酶活回收率，但粗酶液粘度高，易造成膜堵塞，膜通量下降較快，不適合工業(yè)化應(yīng)用。有機溶劑沉淀法的沉淀特異性高于硫酸銨沉淀法，且沉淀不用脫鹽，過濾較為容易，但是容易引起酶的變性失活。色譜分離一般與其他純化方法(如超濾、鹽析、葡聚糖酶降解)等結(jié)合使用，雖然它能得到純度較高的酶，但易造成酶污染、酶活損失嚴(yán)重、處理量少，只能用于實驗室規(guī)模，很難進行工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004] 雙水相萃取是指兩種親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相，利用被分離物在兩相中分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離的技術(shù)，該法具有易分相、價格低廉、萃取高效溫和、無毒、萃取物活性損失小、除雜能力強、萃取率高、可連續(xù)操作、安全方便等優(yōu)點，可廣泛的用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸、多肽、細胞器等產(chǎn)品的分離和純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、快速高效的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，以提高右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率、節(jié)約純化時間。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括以下步驟:
[0007](I)用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶制備右旋糖酐蔗糖酶粗酶液；
[0008](2)向步驟(1)的粗酶液中添加聚乙二醇(PEG)和外源性葡聚糖(Dextran)構(gòu)建 PEG/Dextran雙水相體系；
[0009](3)將步驟(2)的PEG/Dextran雙水相體系低溫靜置分層和高速離心分離；
[0010](4)將步驟(3)分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0011]步驟(1)按以下操作進行:將腸膜明串珠菌CICC21724在43號固體培養(yǎng)基斜面試管中復(fù)活后，接種至43號固體培養(yǎng)基；待長出茁壯的單菌落后，挑取2環(huán)單菌落接種至種子培養(yǎng)基；待菌種繁殖至對數(shù)期時，以2%(v/v)的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)20-26h ;然后將培養(yǎng)液在12000r/min、4°C、20min的條件下離心去除菌體，收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。
[0012]43 號固體培養(yǎng)基配方為蔗糖 130g/L、蛋白胨 2.0g/L、KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/ L、瓊脂20.0g/L, pH7.0-7.2 ;種子培養(yǎng)基配方為蔗糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、 KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/L，pH6.8 ;產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為蔗糖 50g/L、酵母膏 12.5g/L、牛肉膏 20g/L、KH2PO4L Og/L、Na2HP043.6g/L, pH7.0-7.2。
[0013]固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3°C ;種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3°C、150±50r/min，裝液量是所盛容器標(biāo)準(zhǔn)容量的20%。
[0014]步驟(2)中PEG/Dextran雙水相體系構(gòu)成為:粗酶液20mL，加入一定濃度的PEG 溶液和外源性Dextran溶液，用無菌水補足至體系總質(zhì)量為40g ；PEG的分子量為6000， PEG6000的質(zhì)量終濃度(w/w)為15% ；外源性Dextran的分子量為I萬、4萬或7萬， Dextran-TlO的質(zhì)量終濃度(w/w)為0.8%~2.4%, Dextran_T40的質(zhì)量終濃度(w/w)為 0.8% ~2.4%, Dextran-T70 的質(zhì)量終濃度(w/w)為 0.4% ~2.0%。
[0015]步驟(2)中盛放PEG/Dextran雙水相體系采用50mL的Beckman離心管。
[0016]步驟(3)按以下操作進行:構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，均勻混合，置于4V 的冰箱中靜置lh，然后利用高速冷凍離心機在12000r/min、4°C條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用0.02mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.4)稀釋定容至15mL。
[0017]步驟(4)中透析選用分子量為7000Da的透析袋。
[0018]針對目前右旋糖酐蔗糖酶制備過程中存在的問題，發(fā)明人通過添加聚乙二醇和外源性葡聚糖構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系，從而建立了本發(fā)明雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法。該法萃取高效溫和，最佳萃取條件下，右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率可達95.99%，比活力為29.90U/mg，純化倍數(shù)為1.86倍；所得右旋糖酐蔗糖酶中只含有葡聚糖(對酶活有一定的保護和穩(wěn)定作用)，雜質(zhì)少，可用于酶法合成右旋糖酐的研究和生產(chǎn)。同時，本發(fā)明萃取耗時短，操作簡單，可適用于快速分離右旋糖酐蔗糖酶。
【具體實施方式】
[0019]以下各實施例所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下:
[0020]固體培養(yǎng)基配方為蔗糖130g/L、蛋白胨 2.0g/L、KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/L、 瓊脂20.0g/L, pH7.0-7.2 ;種子培養(yǎng)基配方為蔗糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、 KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/L，pH6.8 ;產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為蔗糖 50g/L、酵母膏 12.5g/L、牛肉膏 20g/L、KH2PO4L 0g/L、Na2HP043.6g/L, pH7.0-7.2。
[0021]固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3°C ;種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3°C、150±50r/min，裝液量是所盛容器標(biāo)準(zhǔn)容量的20%。
[0022]實施例1
[0023]將腸膜明串珠菌CICC21724在43號固體培養(yǎng)基斜面試管中復(fù)活后，接種至43號固體培養(yǎng)基；待長出茁壯的單菌落后，挑取2環(huán)單菌落接種至種子培養(yǎng)基；待菌種繁殖至對數(shù)期時，以2%(v/v)的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)20-26h ;然后將培養(yǎng)液在12000r/ min、4°C、20min的條件下離心去除菌體，收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。
[0024]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman離心管中，分別加入12mL質(zhì)量濃度50%的PEG6000溶液和1.60mL質(zhì)量濃度20%的Dextran-TlO溶液，使其質(zhì)量終濃度(w/w)分別為15%和0.8%，用無菌水補足至體系總質(zhì)量為40g，構(gòu)建成PEG/Dextran雙水相體系。構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，充分搖勻均勻混合，置于4°C的冰箱中靜置Ih使得分相充分，然后利用高速冷凍離心機在12000r/min、4°C條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用 0.02mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.4)稀釋定容至15mL，測得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率為79.61%，比活力為25.90U/mg，純化倍數(shù)為1.61倍。然后，選用分子量為7000Da的透析袋，將分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0025]實施例2
[0026]制備右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同實施例1。
[0027]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman離心管中，分別加入12mL質(zhì)量濃度50%的 PEG6000溶液和4.80mL質(zhì)量濃度20%的Dextran-TlO溶液，使其質(zhì)量終濃度(w/w)分別為15%和2.4%，用無菌水補足至體系總質(zhì)量為40g，構(gòu)建成PEG/Dextran雙水相體系。構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，充分搖勻均勻混合，置于4°C的冰箱中靜置Ih使得分相充分，然后利用高速冷凍離心機在12000r/min、4°C條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用 0.02mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.4)稀釋定容至15mL，測得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率為66.81%，比活力為20.23U/mg，純化倍數(shù)為1.26倍。然后，選用分子量為7000Da的透析袋，將分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0028]實施例3
[0029]制備右旋糖酐 蔗糖酶粗酶液同實施例1。
[0030]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman離心管中，分別加入12mL質(zhì)量濃度50%的 PEG6000溶液和1.28mL質(zhì)量濃度25%的Dextran_T40溶液，使其質(zhì)量終濃度(w/w)分別為15%和0.8%，用無菌水補足至體系總質(zhì)量為40g，構(gòu)建成PEG/Dextran雙水相體系。構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，充分搖勻均勻混合，置于4°C的冰箱中靜置Ih使得分相充分，然后利用高速冷凍離心機在12000r/min、4°C條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用
0.02mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.4)稀釋定容至15mL，測得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率為89.90%,比活力為32.58U/mg,純化倍數(shù)為1.48倍。然后，選用分子量為7000Da的透析袋，將分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0031]實施例4
[0032]制備右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同實施例1。
[0033]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman離心管中，分別加入12mL質(zhì)量濃度50%的 PEG6000溶液和3.20mL質(zhì)量濃度20%的Dextran_T40溶液，使其質(zhì)量終濃度(w/w)分別為15%和2.0%，用無菌水補足至體系總質(zhì)量為40g，構(gòu)建成PEG/Dextran雙水相體系。構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，充分搖勻均勻混合，置于4°C的冰箱中靜置Ih使得分相充分，然后利用高速冷凍離心機在12000r/min、4°C條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用
0.02mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.4)稀釋定容至15mL，測得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率為72.39%，比活力為23.04U/mg，純化倍數(shù)為1.05倍。然后，選用分子量為7000Da的透析袋，將分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0034]實施例5
[0035]制備右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同實施例1。[0036]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman離心管中，分別加入12mL質(zhì)量濃度50%的 PEG6000溶液和0.80mL質(zhì)量濃度20%的Dextran_T70溶液，使其質(zhì)量終濃度(w/w)分別為15%和0.4%，用無菌水補足至體系總質(zhì)量為40g，構(gòu)建成PEG/Dextran雙水相體系。構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，充分搖勻均勻混合，置于4°C的冰箱中靜置Ih使得分相充分，然后利用高速冷凍離心機在12000r/min、4°C條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用
0.02mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.4)稀釋定容至15mL，測得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率為67.84%，比活力為15.25U/mg，純化倍數(shù)為1.14倍。然后，選用分子量為7000Da的透析袋，將分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0037]實施例6
[0038] 制備右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同實施例1。
[0039]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman離心管中，分別加入12mL質(zhì)量濃度50%的 PEG6000溶液和4.0OmL質(zhì)量濃度20%的Dextran_T70溶液，使其質(zhì)量終濃度(w/w)分別為15%和2.0%，用無菌水補足至體系總質(zhì)量為40g，構(gòu)建成PEG/Dextran雙水相體系。構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，充分搖勻均勻混合，置于4°C的冰箱中靜置Ih使得分相充分，然后利用高速冷凍離心機在12000r/min、4°C條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用
0.02mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.4)稀釋定容至15mL，測得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率為58.42%，比活力為13.62U/mg，純化倍數(shù)為1.02倍。然后，選用分子量為7000Da的透析袋，將分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
【權(quán)利要求】
1.一種雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于包括以下步驟:(1)用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶制備右旋糖酐蔗糖酶粗酶液；(2)向步驟(1)的粗酶液中添加聚乙二醇和外源性葡聚糖構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系;(3)將步驟(2)的PEG/Dextran雙水相體系低溫靜置分層和高速離心分離；(4)將步驟(3)分離的下相透析濃縮即得右旋糖酐蔗糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(1)按以下操作進行:將腸膜明串珠菌CICC21724在43號固體培養(yǎng)基斜面試管中復(fù)活后，接種至43號固體培養(yǎng)基；待長出茁壯的單菌落后，挑取2環(huán)單菌落接種至種子培養(yǎng)基；待菌種繁殖至對數(shù)期時，以2%的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)20-26h ;然后將培養(yǎng)液在12000r/min、4°C、20min的條件下離心去除菌體,收集上清液即得右旋糖酐鹿糖酶粗酶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于:所述43號固體培養(yǎng)基配方為蔗糖130g/L、蛋白胨2.0g/L、KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/ L、瓊脂20.0g/L，pH7.0-7.2 ;所述種子培養(yǎng)基配方為蔗糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨IOg/ L、KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/L，pH6.8 ;所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為蔗糖 50g/L、酵母膏 12.5g/ L、牛肉膏 20g/L、KH2PO4L Og/L、Na2HP043.6g/L, pH7.0-7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于:所述固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3°C;所述種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種的條件為25±3°C、150±50r/min，裝液量是所盛容器標(biāo)準(zhǔn)容量的20%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(2)中PEG/Dextran雙水相體系構(gòu)成為:粗酶液20mL，加入一定濃度的PEG溶液和外源性Dextran溶液，用無菌水補足至體系總質(zhì)量為40g的分子量為6000，PEG6000 的質(zhì)量`終濃度為15% ;所述外源性Dextran的分子量為I萬、4萬或7萬,Dextran-TlO的質(zhì)量終濃度為0.8%~2.4%, Dextran-T40的質(zhì)量終濃度為0.8%~2.4%，Dextran_T70的質(zhì)量終濃度為0.4%~2.0%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(2)中盛放PEG/Dextran雙水相體系采用50mL的Beckman離心管。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(3)按以下操作進行:構(gòu)建PEG/Dextran雙水相體系后，均勻混合，置于4°C的冰箱中靜置Ih，然后利用高速冷凍離心機在12000r/min、4°C條件下離心20min后，倒掉上相，將下相用0.02mol/L pH5.4的醋酸鈉緩沖液稀釋定容至15mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相萃取快速分離純化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步驟(4)中透析選用分子量為7000Da的透析袋。
【文檔編號】C12N9/10GK103571806SQ201310560298
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】陳山, 劉玫, 梁贏, 張義平, 姚曉麥, 浦媛媛, 鄒青松, 黃磊, 謝政, 相萍萍 申請人:廣西大學(xué)