用于檢測(cè)nqo1基因多態(tài)性的引物、試劑盒及其在病理檢測(cè)上的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)NQO1基因多態(tài)性的引物、試劑盒及其在病理檢測(cè)上的應(yīng)用，所述引物包括從樣本核酸中擴(kuò)增醌氧化還原酶1基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的特異性引物和對(duì)獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物。通過(guò)本發(fā)明的引物、方法和試劑盒，采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，可檢測(cè)出與腫瘤易感性相關(guān)的醌氧化還原酶1基因第四外顯子C465T位點(diǎn)和第六外顯子C609T位點(diǎn)多態(tài)性，特異性好，準(zhǔn)確度高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)NQ01基因多態(tài)性的引物、試劑盒及其在病理檢測(cè)上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及用于醌氧化還原酶I基因NQ01*2(C609T)、NQ01*3(C465T)位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)的引物、試劑盒和在病理檢測(cè)上的應(yīng)用，采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，能對(duì)醌氧化還原酶I基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，特異性好，準(zhǔn)確度高。
【背景技術(shù)】
[0002]醌氧化還原酶I 基因(NADPH:quinone oxidore_ductasel,NQ01)是由 Ernster 和Navazio于1958年首先報(bào)道的，最初被稱(chēng)為DT-硫辛酰胺脫氫酶(DT-diaphorase)。它是絕大多數(shù)真核生物細(xì)胞中普遍存在的一種黃素蛋白酶，能夠解除許多天然和合成化合物的毒性，同時(shí)又能活化一些醌類(lèi)抗腫瘤藥物，因而引起了廣泛關(guān)注。NQOl是一種可誘導(dǎo)的還原酶，酚類(lèi)抗氧化劑、多環(huán)芳烴、偶氮染料、缺氧等外界環(huán)境因素均可以強(qiáng)烈地誘導(dǎo)NQOl表達(dá)。這種可誘導(dǎo)性表達(dá)使得NQOl可能在腫瘤預(yù)防和腫瘤治療上起重要作用。
[0003]20世紀(jì)90年代初，有研究發(fā)現(xiàn)NQ01cDNA609位點(diǎn)上存在C/T單核苷酸多態(tài)性(SNP)，可能改變酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使酶的活性降低，增加了氧自由基的生成。目前發(fā)現(xiàn)人的NQOl基因序列中，引起蛋白質(zhì)編碼氨基酸序列改變的非同義編碼單核苷酸多態(tài)性有三個(gè)，其中包括位于第四外顯子的C465T和第六外顯子的C609T，分別引起所編碼的139位氨基酸由色氨酸(Trp)變?yōu)榫彼?Arg)，187位氨基酸由脯氨酸(Pro)變?yōu)榻z氨酸(Ser)。這些氨基酸序列改變，可能導(dǎo)致了個(gè)體中酶NQOl活性的降低或缺失，減弱了 NQOl對(duì)醌類(lèi)化合物的解毒作用及改變腫瘤對(duì)特定原癌基因及抑癌基因功能的影響，從而使機(jī)體患腫瘤的可能性增加。
[0004]研究發(fā)現(xiàn)，酶NQOl具有2個(gè)野生型等位基因即野生純合子(C/C)的個(gè)體，NQOl酶的活力正常；而具有雜合子(C/T)的個(gè)體酶的活力降低，具有突變純合子(T/T)的個(gè)體NQOl酶的活力則完全消失。
[0005]目前對(duì)于NQ01C465T研究尚不很多。NQ01cDNA465位點(diǎn)上存在C/T單核苷酸多態(tài)性。不同人群NQ01465T等位基因頻率較低(0~0.05)。許多研究還發(fā)現(xiàn)，NQ01C609T基因多態(tài)性頻率在種族分布上有很大差異，基因型為(T/T)的純合子個(gè)體在中國(guó)和其他亞洲人種為18%~20%，大約為高加索人和美籍非洲人的4倍。
[0006]鑒于NQOl與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其第六位外顯子(C609T)和第四位外顯子(C465T)具有非同義編碼單核苷酸多態(tài)性，可引起蛋白質(zhì)編碼的堿基序列改變從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)將有助于進(jìn)一步明確其遺傳背景在腫瘤發(fā)生中的作用，并為腫瘤個(gè)體化治療提供有益的指導(dǎo)。
[0007]在臨床實(shí)驗(yàn)室中，目前檢醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)多態(tài)性的常用方法為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism, RELP)法。該技術(shù)為第一代DNA分子標(biāo)記技術(shù),利用限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開(kāi)DNA分子，即產(chǎn)生特征性的限制性片段，該方法的缺陷在于檢測(cè)靈敏度低且只能檢測(cè)大概型別，不能具體到突變比例。
[0008]本發(fā)明在原有的基礎(chǔ)上進(jìn)行焦磷酸測(cè)序檢測(cè)，不僅能檢測(cè)到多態(tài)性位點(diǎn)的具體突變情況，也能根據(jù)圖譜辨別出突變比例，使檢測(cè)結(jié)果更加具體化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明除了利用兩對(duì)特異性的引物分別對(duì)醌氧化還原酶I基因NQOl的第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增外，還利用一對(duì)焦磷酸測(cè)序引物對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行正向測(cè)序和反向測(cè)序，不僅能夠檢測(cè)到多態(tài)性位點(diǎn)的具體突變情況，也能根據(jù)測(cè)序圖譜辨別出突變比例，使檢測(cè)結(jié)果更加具體化，從而能夠更好地為腫瘤個(gè)體化治療提供有益的指導(dǎo)。 [0010]在進(jìn)行焦磷酸測(cè)序過(guò)程中，四種dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)依序被加入測(cè)序反應(yīng)體系中。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入其中一種。如被加入的dNTP與DNA模板配對(duì)，DNA聚合酶可以催化該dNTP與焦磷酸測(cè)序引物C465T-S或C609T-S的3’端形成共價(jià)鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)(PPi)就被釋放出來(lái)。加入的dNTP和釋放出來(lái)的PPi的摩爾數(shù)是相等的。接著,ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase)催化過(guò)硫酸銨(ammonium persulfate, APS)和 PPi 形成ATP，此ATP和PPi的摩爾數(shù)也是一致的。利用ATP作為能源，熒光素酶(Iuciferase)可將熒光素氧化為氧化熒光素(oxyluciferin)，進(jìn)而發(fā)出與ATP量成正比的可見(jiàn)光信號(hào)。光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測(cè)，并由程序pyrogramTM轉(zhuǎn)為波形訊號(hào)。每個(gè)波峰的高度(光信號(hào))與反應(yīng)中加入的核苷酸數(shù)目成正比。
[0011]基于這種焦磷酸測(cè)序技術(shù)，本發(fā)明提供用于檢測(cè)NQOl基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的引物，其特征在于，所述引物包括從樣本核酸中擴(kuò)增NQOl基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的特異性引物，其堿基序列為:
[0012]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0013]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0014]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0015]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0016]以及對(duì)所獲得的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物，其堿基序列為:
[0017]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0018]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0019]進(jìn)一步地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標(biāo)記。
[0020]進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C 2分鐘；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35個(gè)循環(huán)；68°C 5分鐘。
[0021]本發(fā)明還提供了檢測(cè)NQOl基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的方法在病理檢測(cè)上的應(yīng)用，包括:
[0022](I)提取樣本中的DNA ；
[0023](2)以步驟(1)中的DNA作為模板，使用一對(duì)引物C465T-F和C465T-R擴(kuò)增NQOl基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I ;使用一對(duì)引物C609T-F和C609T-R擴(kuò)增NQOl基因第六外顯子C609T位點(diǎn)片段，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 ；
[0024](3)取步驟⑵中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I和2進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)是否擴(kuò)增成功；[0025](4)若步驟(3)中擴(kuò)增成功，則利用焦磷酸測(cè)序引物C465T-S對(duì)步驟⑵中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I進(jìn)行測(cè)序，利用焦磷酸測(cè)序引物C609T-S對(duì)步驟(2)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2進(jìn)行測(cè)序；
[0026](5)根據(jù)步驟步驟⑷中的焦磷酸測(cè)序結(jié)果，確定NQOl基因的C465T和C609T位點(diǎn)的多態(tài)性，
[0027](6)根據(jù)步驟(5)中的多態(tài)性結(jié)果，確定樣本的病理狀態(tài)；
[0028]其特征在于，所述引物序列為:
[0029]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
[0030]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
[0031 ] C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3'
[0032]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’
[0033]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3'
[0034]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3'。
[0035]進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C 2分鐘；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35個(gè)循環(huán)；68°C 5分鐘。
[0036]本發(fā)明還提供用于檢測(cè)NQOl基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR擴(kuò)增體系、焦磷酸測(cè)序試劑，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增體系包括用于擴(kuò)增基因NQOl第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的特異性引物，其堿基序列為:
[0037]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0038]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0039]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0040]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0041]所述焦磷酸測(cè)序試劑包括對(duì)所獲得的核酸擴(kuò)增片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物，其堿基序列為:
[0042]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0043]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0044]進(jìn)一步地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標(biāo)記。
[0045]進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增體系還包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和純水。
[0046]進(jìn)一步地，所述焦磷酸測(cè)序試劑還包括75%乙醇和DMS0。
[0047]進(jìn)一步地，所述核酸提取試劑包括紅細(xì)胞裂解液。
[0048]本發(fā)明將測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于醌氧化還原酶I基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，設(shè)計(jì)出將NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)多態(tài)性位點(diǎn)包含在內(nèi)的擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為464bp和212bp，隨后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析。
[0049]采用焦磷酸測(cè) 序技術(shù)，通過(guò)本發(fā)明的特異性的擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物，可檢測(cè)出與腫瘤預(yù)防和腫瘤治療相關(guān)的醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位點(diǎn)多態(tài)性，特異性好，準(zhǔn)確度高?？梢杂糜谂R床作為腫瘤發(fā)生的早期預(yù)防、早期診斷的輔助性指標(biāo)及篩選。【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0050]圖1是C465T野生型焦磷酸測(cè)序圖。
[0051]圖2是C609T野生型焦磷酸測(cè)序圖。
[0052]圖3是C609T突變雜合型焦磷酸測(cè)序圖。
[0053]圖4是C609T突變純合型焦磷酸測(cè)序圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:比如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0055]實(shí)施例1:檢測(cè)基因NQOl位點(diǎn)多態(tài)性的引物和試劑盒
[0056]用于醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)的引物，包括從樣本核酸中擴(kuò)增醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位點(diǎn)片段的特異性引物和對(duì)獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物，其中，
[0057]從樣本核酸中擴(kuò)增醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T) >NQOI*3 (C465T)位點(diǎn)片段的特異性引物序列為:
[0058]C465T-F:5’-CTA GCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0059]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0060]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0061]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0062]其中C465T-F和C609T-R為5’端生物素標(biāo)記引物；
[0063]對(duì)獲得的核酸片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物序列為:
[0064]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0065]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0066]采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，通過(guò)兩對(duì)特異性的擴(kuò)增引物C465T-F、C465T-R和C609T-F、C609T-R以及焦磷酸測(cè)序引物，可檢測(cè)出與腫瘤疾病相關(guān)的醌氧化還原酶I基因NQOI*2 (C609T)、NQOI*3 (C465T)位點(diǎn)多態(tài)性。
[0067]一種用于檢測(cè)醌氧化還原酶I基因NQ01*2的C609T、NQ01*3的C465T位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR擴(kuò)增體系、焦磷酸測(cè)序試劑，其中，所述PCR擴(kuò)增體系包括用于擴(kuò)增基因NQOl第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的特異性引物，其堿基序列為:
[0068]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0069]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0070]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0071]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0072]所述焦磷酸測(cè)序試劑包括對(duì)所獲得的核酸擴(kuò)增片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物，其堿基序列為:
[0073]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0074]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。[0075]優(yōu)選地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標(biāo)記。
[0076]優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增體系還包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和純水。
[0077]優(yōu)選地，所述焦磷酸測(cè)序試劑還包括75%乙醇和DMS0。
[0078]優(yōu)選地，所述核酸提取試劑包括紅細(xì)胞裂解液。
[0079]實(shí)施例2 =DNA提取
[0080]DNA提取試劑:紅細(xì)胞裂解液，血液基因組DNA抽提試劑盒(TIANGEN公司)。
[0081]操作步驟:取500ul全血，放入到1.5ml的離心管中，加入Iml紅細(xì)胞裂解液。上下翻轉(zhuǎn)，使完全混勻，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)15秒后放入離心機(jī)中離心,離心速率為5000rpm, IOmin.。倒掉上層液，可見(jiàn)離心管底部有血色沉淀。加入500ul紅細(xì)胞裂解液，重復(fù)此裂解步驟一次。離心5000rpm, 5min,吸去上清，留下白細(xì)胞沉淀，加200uL緩沖液GA,振蕩至徹底混勻。加A 20 u I蛋白酶K溶液，混勻。加入200 ill緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加人200iU無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(~13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500 U I緩沖液GD (使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12，OOOrpm(~13，400 Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700 U I漂洗液PW (使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12，OOOrpm(~13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 u I漂洗液PW，12，OOOrpm(~13，400 Xg)離心30秒，倒掉廢液。將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(~13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加IOOiU洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(~13，400 Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。最終，獲得所提取的DNA。
[0082]實(shí)施例3:PCR擴(kuò)增
[0083]對(duì)實(shí)施例2中所提取的DNA利用PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物。[0084]對(duì)醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)位點(diǎn)片段進(jìn)行擴(kuò)增所用的PCR擴(kuò)增體系為2*Bufferl0u 1，dNTP4 U 1，腳酶0.411 1，上游引物 C609T-F1 y 1，下游引物 C609T-R1 y 1，純水2.6 ii I,加I ii I模板DNA到19 ii I擴(kuò)增體系中，總體積為20 u 10
[0085]對(duì)醌氧化還原酶I基因NQ01*3 (C465T)位點(diǎn)片段進(jìn)行擴(kuò)增所用的PCR擴(kuò)增體系為2*Bufferl0u 1，dNTP4 U 1，腳酶0.411 1，上游引物 C465T-F1 y 1，下游引物 C465T-R1 y 1，純水2.6 ii I,加I ii I模板DNA到19 ii I擴(kuò)增體系中，總體積為20 u 10
[0086]常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C 2分鐘；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35個(gè)循環(huán)；68°C 5分鐘。
[0087]實(shí)施例4:瓊脂糖凝膠電泳
[0088]取實(shí)施例3中的DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物3 iU進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)是否擴(kuò)增成功，對(duì)清晰較亮的目的條帶進(jìn)行后續(xù)焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。
[0089]實(shí)施例5:焦磷酸測(cè)序[0090]焦憐酸測(cè)序試劑:75%乙醇，DenaturationSolution,Annealing Buffer,BindingBuffer,I Xffash Buffer, Streptavidin Sepharase High Performance (bead), PyroMarkGold Q96Reagents(E\S\dNTP)，DMS0(二甲基亞砜)，焦磷酸測(cè)序引物 C465T-S 和 C609T-S，其中除焦磷酸測(cè)序引物之外，均采購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司。
[0091]焦磷酸測(cè)序步驟:利用焦磷酸測(cè)序試劑，對(duì)經(jīng)過(guò)實(shí)施例4中的電泳方法確認(rèn)擴(kuò)增成功的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，具體測(cè)序步驟按照PyroMark Gold Q96(美國(guó)QIAGEN公司)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其中利用焦磷酸測(cè)序引物C465T-S對(duì)醌氧化還原酶I基因NQOl的第四外顯子C465T位點(diǎn)片段進(jìn)行反向測(cè)序，利用焦磷酸測(cè)序引物C609T-S對(duì)第六外顯子C609T位點(diǎn)片段進(jìn)行正向測(cè)序。
[0092]針對(duì)醌氧化還原酶1基因NQOl的第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，分別利用焦磷酸測(cè)序引物C465T-S和C609T-S進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序圖譜分析和確定這兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。
[0093]實(shí)施例6:臨床樣本病理狀態(tài)分析
[0094]取臨床送檢的4份樣本,依次編號(hào)為I號(hào)樣本、2號(hào)樣本、3號(hào)樣本和4號(hào)樣本。按照實(shí)施例2至實(shí)施例5的方法，利用引物C465T-S和C609T-S分別對(duì)I號(hào)樣本、2號(hào)樣本、3號(hào)樣本和4號(hào)樣本中的NQOl基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
[0095]NQOl基因第四外顯子C465T位點(diǎn)野生型的基因序列為T(mén)TC￡GG。經(jīng)測(cè)定I號(hào)樣本中的NQOl基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序結(jié)果如圖1所示，所得序列為:CC￡GAA,即圖1中的方框作標(biāo)記。多態(tài)性位點(diǎn)為G,由于為反向測(cè)序,可知I號(hào)樣本為C465T野生型。針對(duì)NQOl基因第四外顯子C465T的突變雜合型和突變純合型的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際相同。
[0096]NQOl基因第六外顯子C609T位點(diǎn)野生型的基因序列為AA￡CTC。經(jīng)測(cè)定2號(hào)樣本中的NQOl基因第六外顯子C609T位點(diǎn)片段擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序結(jié)果如圖2所示，所得序列為:AA￡CTC，即圖2中的方框作標(biāo)記。多態(tài)性位點(diǎn)為C，該位點(diǎn)為正向測(cè)序，可知2號(hào)贗本為C609T野生型。
[0097]NQOl基因第六外顯子C609T位點(diǎn)突變雜合型的基因序列為AAI/￡CTC。經(jīng)測(cè)定，3號(hào)樣本中的NQOl基因第六外顯子C609T位點(diǎn)片段擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序結(jié)果如圖3所示，所得序列為:AAI/￡CTC，即圖3中的方框作標(biāo)記。多態(tài)性位點(diǎn)為T(mén)/C，該位點(diǎn)為正向測(cè)序，可知3好樣本為C609T突變雜合型。
[0098]NQOl基因第六外顯子C609T位點(diǎn)突變純合型的基因序列為AAJCTC。經(jīng)測(cè)定4號(hào)樣本中的片段擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序結(jié)果如圖4所示，所得序列為:AAICTC，即圖4中的方框作標(biāo)記。多態(tài)性位點(diǎn)為T(mén)，該位點(diǎn)為正向測(cè)序，可知4號(hào)樣本為C609T突變純合型。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)NQOl基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的引物，其特征在于，所述引物包括從樣本核酸中擴(kuò)增NQOl基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的特異性引物，其堿基序列為:
C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ 以及對(duì)所獲得的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物，其堿基序列為:
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C2分鐘；98°C10 秒，60°C 20 秒，68°C 20 秒，35 個(gè)循環(huán)；68°C 5 分鐘。
4.一種檢測(cè)NQOl基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的方法在病理檢測(cè)上的應(yīng)用，包 括: (1)提取樣本中的DNA; (2)以步驟(1)中的DNA作為模板，使用一對(duì)引物C465T-F和C465T-R擴(kuò)增NQOl基因第四外顯子C465T位點(diǎn)片段，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I ;使用一對(duì)引物C609T-F和C609T-R擴(kuò)增NQOl基因第六外顯子C609T位點(diǎn)片段，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 ； (3)取步驟⑵中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I和2進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測(cè)是否擴(kuò)增成功； (4)若步驟(3)中擴(kuò)增成功，則利用焦磷酸測(cè)序引物C465T-S對(duì)步驟(2)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I進(jìn)行測(cè)序，利用焦磷酸測(cè)序引物C609T-S對(duì)步驟(2)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2進(jìn)行測(cè)序; (5)根據(jù)步驟步驟⑷中的焦磷酸測(cè)序結(jié)果，確定NQOl基因的C465T和C609T位點(diǎn)的多態(tài)性； (6)根據(jù)步驟(5)中的多態(tài)性結(jié)果，確定樣本的病理狀態(tài)； 其特征在于，所述引物序列為:
C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C2分鐘；98°C10秒，60°C 20 秒，68°C 20 秒，35 個(gè)循環(huán)；68°C 5 分鐘。
6.用于檢測(cè)NQOl基因的C609T和C465T位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR擴(kuò)增體系、焦磷酸測(cè)序試劑，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增體系包括用于擴(kuò)增基因NQOl第四外顯子C465T位點(diǎn)片段和第六外顯子C609T位點(diǎn)片段的特異性引物，其堿基序列為:C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ 所述焦磷酸測(cè)序試劑包括對(duì)所獲得的核酸擴(kuò)增片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的引物，其堿基序列為:
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標(biāo)記。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增體系還包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和純水。
9.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述焦磷酸測(cè)序試劑還包括75%乙醇和DMSO。
10.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸提取試劑包括紅細(xì)胞裂解液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667447SQ201310539817
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】鐘丹, 薛群, 陳奕磊 申請(qǐng)人:武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司