一種真核表達(dá)時(shí)酶切回收的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種真核表達(dá)時(shí)酶切回收pcDNA3.1(-)的方法。具體步驟為：首先與目的基因連接并鑒定陽(yáng)性,重溫質(zhì)粒,應(yīng)用EcoRI和BamHI對(duì)pcDNA3.1(-)進(jìn)行雙酶切反應(yīng),反應(yīng)體系為50μl:質(zhì)粒20μl,EcoRI、BamH各I1μl,10×kBuffer5μl加水至50μl。本發(fā)明的有益效果是，基因測(cè)序能夠證實(shí)RT-PCR產(chǎn)物包含VEGF-CcDNA全長(zhǎng)。重組pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全長(zhǎng)序列。結(jié)論:成功構(gòu)建了人類VEGF-C真核表達(dá)載體并檢測(cè)到載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
【專利說明】—種真核表達(dá)時(shí)酶切回收的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生化的實(shí)驗(yàn)方法，具體來說，一種真核表達(dá)時(shí)酶切回收PCDNA3.1 (-)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)屬VEGF/PDGF家族成員，其受體為VEGFR -2，VEGFR -3。VEGF通過VEGFR -2調(diào)節(jié)血管和淋巴管的增生，而VEGFR-3表達(dá)則局限于淋巴管內(nèi)皮，VEGF -C為VEGFR-2的結(jié)合，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的所需濃度遠(yuǎn)高于VEGFR -C，因此，VEGFR -3是淋巴管增生特異性調(diào)節(jié)因子，用VEGF -C轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VEGF -C的高表達(dá)可以選擇性地引起淋巴管增生，經(jīng)研究，VEGF -C表達(dá)與腫瘤淋巴管增生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系是VEGF -C高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移，其機(jī)理是VEGF -C促進(jìn)了腫瘤周圍及間質(zhì)的淋巴管生長(zhǎng)以及腫瘤組織中淋巴管增生。為進(jìn)一步研究VEGF -C在淋巴管增生中的作用及其機(jī)制，我們構(gòu)建了攜帶人VEGF -C cDNA的基因片段的真核表達(dá)載體，研究了它在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，為探討VEGF -C與淋巴管增生的關(guān)系，VEGF -C基因用于治療淋巴水腫和某些癌腫的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服上述技術(shù)問題，我們提出了以下技術(shù)方案:
一種真核表達(dá)時(shí)酶切回收pc DNA3.1 (-)的方法，與目的基因連接并鑒定陽(yáng)性，重溫質(zhì)粒，應(yīng)用EcoR I和BamH I對(duì)pc DNA3.1 (-)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為50 μ 1:質(zhì)粒 20 μ 1，EcoR 1、BamH 各 I I μ 1，IOXk Buffer 5μ I 加水至 50 μ I。37°C 水浴酶切反應(yīng)2.5 μ I, 65°C水浴滅活30min，取10 μ I反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；連接體系為10 μ 1，目的DNA片段I μ 1，pcDNA 3.1㈠雙酶切回收片段I μ 1，T4連接酶I μ 1，10XBuffer I μ I,加dH20至10 μ I。反應(yīng)條件:16 °C過夜，將連接后的pcDNA3.1㈠轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞200 μ I中鋪于LA平板，37°C孵育16h ;隨機(jī)挑取LA平板上幾個(gè)單菌落，分別接種于5ml LA培養(yǎng)液，37°C 180r/min震蕩培養(yǎng)過夜，按質(zhì)粒提取說明提取質(zhì)粒，加入EcoR I和BamH I行雙酶切反應(yīng)。酶切體系:質(zhì)粒20 μ 1，EcoR 1.BamH
I各 I μ 1，IOXk Buffer 5 μ 1，加 dH20 至 50 μ 1，37°C水浴酶切反應(yīng) 2.5h, 65°C水浴滅活30min,取10 μ I反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠反應(yīng)，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。
[0004]本發(fā)明的有益效果是，基因測(cè)序能夠證實(shí)RT -PCR產(chǎn)物包含VEGF -C cDNA全長(zhǎng)。重組pcDNA3.1(-)中含有VEGF -C cDNA全長(zhǎng)序列，Western -blotting檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)上清中以及細(xì)胞內(nèi)有VEGF -C蛋白存在。結(jié)論:成功構(gòu)建了人類VEGF -C真核表達(dá)載體并檢測(cè)到載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0005]具體步驟為:首先與目的基因連接并鑒定陽(yáng)性，重溫質(zhì)粒，應(yīng)用EcoR I和BamHI對(duì)pc DNA3.1(-)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為50 μ 1:質(zhì)粒20 μ I，EcoR I ,BamH各I 1μ I, IOXk Buffer 5μ I加水至50 μ I。37°C水浴酶切反應(yīng)5 μ 1，65°C水浴滅活30min,取10 μ I反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；連接體系為10 μ I，目的DNA片段I μ I, pcDNA 3.1 (-)雙酶切回收片段 I μ I，Τ4 連接酶 I μ I，10 XBuffer I μ I，加dH20至10 μ I。反應(yīng)條件:16 °C過夜，將連接后的pcDNA3.1 (-)轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞200 μ I中鋪于LA平板，37°C孵育16h;隨機(jī)挑取LA平板上幾個(gè)單菌落，分別接種于5ml LA培養(yǎng)液，37°C 180r/min震蕩培養(yǎng)過夜，按質(zhì)粒提取說明提取質(zhì)粒，加入EcoRI和BamH I行雙酶切反應(yīng)。酶切體系:質(zhì)粒20 μ 1，EcoR 1、BamH I各Ιμ?，IOXkBuffer 5μ I,加dH20至50μ1，37 °C水浴酶切反應(yīng)2.5h，65°C水浴滅活30min，取10μ1反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠反應(yīng)，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。本發(fā)明的有益效果是，基因測(cè)序能夠證實(shí)RT -PCR產(chǎn)物包含VEGF -C cDNA全長(zhǎng)。
[0006]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種真核表達(dá)時(shí)酶切回收的方法，其特征在于，與目的基因連接并鑒定陽(yáng)性，重溫質(zhì)粒，應(yīng)用EcoR I和BamH I對(duì)pc DNA3.1 (-)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為50 μ 1:質(zhì)粒 20 μ I，EcoR 1、BamH 各 I I μ 1，IOXk Buffer 5μ I 加水至 50 μ I ;37°C 水浴酶切反應(yīng)2.5 μ 1，65°C水浴滅活30min，取10 μ I反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；連接體系為10 μ I,目的DNA片段Ιμ?，pcDNA 3.1 (-)雙酶切回收片段I μ I，Τ4連接酶I μ I，10XBuffer I μ I，加dH20至10 μ I ;反應(yīng)條件:16 °C過夜，將連接后的pcDNA3.1 (-)轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞200 μ I中鋪于LA平板，37°C孵育16h ;隨機(jī)挑取LA平板上幾個(gè)單菌落，分別接種于5ml LA培養(yǎng)液，37°C 180r/min震蕩培養(yǎng)過夜，按質(zhì)粒提取說明提取質(zhì)粒，加入EcoR I和BamH I行雙酶切反應(yīng)；酶切體系:質(zhì)粒20 μ 1，EcoR 1、BamH I各1μ I , IOXk Buffer 5 μ I,加 dH20 至 50μ1, 37 °C水浴酶切反應(yīng) 2.5h，65°C水浴滅活30min,取10 μ I反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠反應(yīng)，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103602660SQ201310519305
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王景文 申請(qǐng)人:王景文