一種仔豬腹瀉抗性相關的分子標記檢測方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子標記制備【技術領域】，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇應用于豬腹瀉抗性性狀相關的分子標記的檢測及應用。所述的分子標記由基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。在序列表SEQ?ID?NO：1的第625bp處有一個G/T的堿基突變，導致PCR-RFLP-BshN1多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴增基因DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性的檢測方法。本發(fā)明為豬腹瀉抗性性狀標記輔助選擇提供了新的分子標記。
【專利說明】一種仔豬腹瀉抗性相關的分子標記檢測方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，涉及一種包含如SEQ ID NO:1所示仔豬基因核苷酸的核酸分子。本發(fā)明還涉及如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列中的單核苷酸多態(tài)性位點以及檢測所述單核苷酸多態(tài)性位點的方法。
【背景技術】
[0002]研究表明，GPI與生物體很多疾病有關。已知的與人沉積在老年性癡呆、感染性蛋白質疾病(包括人的 Creutzfeld-Jakob 病，Gerstmann-straussler-scheinker 綜合癥，庫魯病和綿羊及山羊的瘙癢癥等)、類風濕關節(jié)炎、非洲昏睡病、瘧疾、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥、慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等有直接關系。
[0003]在白念珠菌耐藥基因研究中，GPII被認為與耐藥有關(麻志萍等，2008)。在朊蛋白的有關研究中，GPI錨定位點的移除可減少對感染性朊蛋白疾病的易感性，保護了可溶性的PrPc轉變?yōu)橹С指腥拘噪玫鞍讖椭频姆肿?張?zhí)瑁?008)。還有研究表明，缺氧狀態(tài)下，YC-1抑制人胰腺癌PC-3細胞血管內皮生長因子(VEGF)和GPI基因轉錄與其抑制HIF-1 α蛋白的表達有關，YC-1能夠抑制人胰腺癌PC-3細胞生長和增殖。同時有實驗表明，在鼠的肝臟內腔隙中存在GP1-PLD，在移去肝臟以后，酶的活性明顯下降，在緊接著移植入肝后，酶的活性明顯增加，在嚴重肝疾病時，酶的活性依賴于肝的合成儲備功能，說明肝是其主要來源。在病毒性肝炎及支氣管炎肺炎時，其活性明顯上升，說明GP1-PLD也可作為一個急性期反應物。競爭性RT-PCR監(jiān)測在不同惡性程度腫瘤細胞中GP1-PLD mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)釋放大量腫瘤可溶性預后標記物的卵巢癌細胞與釋放少量標記物的卵巢癌細胞相比，其GP1-PLDmRNA 的表達水平明顯增加(Xiao Guang-fen，2010)。
[0004]人的GPIl基因包含11個外顯子，定位于16pl3.3，靠近α血紅蛋白基因座，GPII基因在組織和細胞中的表達無所不在，尤其在骨髓、胎兒肝臟等造血組織中的表達顯著高于其他組織。GPIl基因目前已被確認是GPI生物合成的必需組成部分。GPI編碼產物與糖基磷脂酰肌醇的合成密切相關。在生物體的免疫、代謝等多個方面發(fā)揮重要的作用?？梢灶A見，由于GPIl基因對于GPI合成的重要性，GPIl基因對于生物體的疾病有著非常重要的調控作用。而目前對豬GPIl基因的結構和功能的研究卻還不太深入。
[0005]本發(fā)明選擇豬GPIl基因作為豬腹瀉抗性性狀的候選基因，以3個外來豬種(杜洛克豬、大白豬、長白豬)和I個本地豬種(寧鄉(xiāng)豬)為試驗材料，采用PCR-RFLP方法對GPIl基因G/T位點的基因頻率、基因型頻率進行檢測，并分析其遺傳結構，初步探討該基因與腹瀉抗性性狀的相關性。目前國內外關于豬GPIl基因的相關研究很少。本發(fā)明將找到與仔豬腹瀉抗性有關的遺傳標記，為篩選ETEC F4抗性豬提供可行的標記輔助選擇方法，為選育ETEC F4抗性豬配套系提供理論研究依據(jù)。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于找到與仔豬腹瀉抗性有關的遺傳標記，為篩選ETEC F4抗性豬提供可行的標記輔助選擇方法，為ETEC F4抗性豬的早期選種提供依據(jù)，為選育ETEC F4抗性豬配套系提供理論研究依據(jù)。
[0007]本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn):
[0008]利用比較基因組學方法，根據(jù)發(fā)明人提交到GenBank的GPIl基因序列(收錄號為JX125039)和人的GPIl基因的保守區(qū)設計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片段利用測序技術發(fā)現(xiàn)SNP，并利用PCR — RFLP進行基因分型，再利用獨立性卡方檢驗對檢測的該基因SNPs與腹瀉抗性的關聯(lián)度進行分析，以檢驗該SNPs的實際應用效果。
[0009](I)PCR引物設計與序列獲得
[0010]利用Primer Premier軟件，根據(jù)不同物種的GPII基因的保守序列制備了檢測上述序列表SEQ ID NO:1基因片段突變的引物對，所述的引物對的正向引物為5' -CTTGGAGCTAAG CAGTGATGTG-3'，反向引物為 5' -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3'。該引物對的退火溫度為62°C，以豬的基因組DNA為模板，構建20 μ L的擴增體系，經(jīng)過預變性、變性一退火一延伸33個循環(huán)以及后延伸的反應過程，獲得了目的片段，片段核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所述。
[0011](2) SNP發(fā)現(xiàn)與檢測方法建立
[0012]發(fā)明人通過對擴增序列測序，得到了一種與仔豬腹瀉抗性相關的基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所述。序列表SEQ ID NO:1序列的625bp處有I個G/T的堿基突變，導致PCR-RFLP-BshNl多態(tài)性，PCR產物經(jīng)BshNl酶切后，顯示出GG、GT和TT
二種基因型。
[0013]發(fā)明設計了擴增包含該 SNPs的引物，經(jīng)分析G/T位點的突變可以采用BshNl進行酶切檢測多態(tài)性。在擴增的809bp的片段上，存在I個BshNl的酶切位點，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后結果顯示，在GPIl基因的G/T位點存在3種基因型，GG型(809bp)、GT型(345bp、464bp、809bp)和 TT 基因型(345bp、464bp)。
[0014](3)基因型一腹瀉抗性關聯(lián)分析
[0015]利用獨立性卡方檢驗對基因型與腹瀉性狀進行關聯(lián)分析，分析表明在杜洛克豬、長白豬、大白豬中T基因為優(yōu)勢等位基因，T基因頻率分別為1，0.99,0.97，而在寧鄉(xiāng)豬中G基因為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為0.85。GPIl基因的基因型分布在以這四個豬種為代表的中外豬種中差異較大，三個外來品種的仔豬的基因型分布與寧鄉(xiāng)豬中的分布差異極顯著(P < 0.01)，仔豬外顯子的兩種基因型TT型、GT型間的腹瀉抗性差異顯著(0.0Kp< 0.05)，尤其在大白豬、長白豬外顯子的兩種基因型TT型、GT型間的腹瀉抗性差異極顯著(P <0.01)，表明杜洛克、長白豬、大白豬TT基因型的腹瀉個體非常集中，在杜洛克、長白豬、大白豬這三個品種豬中TT型將可能是腹瀉抗性的參考遺傳標記。
[0016]利用上述制備的與豬腹瀉抗性相關的分子標記對不同豬品種的腹瀉情況進行了關聯(lián)分析的應用，從而完成了本發(fā)明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1 GPII基因SNPs位點的PCR擴增產物
[0018]圖2 GPII基因SNPs位點的酶切電泳結果
[0019]泳道1，5，6，7，9，12:GG基因型;泳道2，3，4，11:GT基因型;泳道8，10:TT基因型；【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步地解釋，但【具體實施方式】并不對本發(fā)明做任何限定。
[0021]實施例1:
[0022]1.引物設計
[0023]利用比較基因組學方法根據(jù)豬的GPIl基因(GenBank收錄號為JX125039)的第I外顯子，以該基因在GenBank作BLAST，序列比對后篩選出GPIl基因候選SNPs位點，選取GPIl基因的第625bp候選SNPs位點，以JX125039.seq序列為標準，設計引物，運用PCR —RFLP技術驗證該位點的存在。
[0024]引物序列M-F:5' -CTTGGAGCTAAGCAGTGATGTG-3'，
[0025]M-R:5/ -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3'
[0026]2.PCR條件的DNA提取
[0027]DNA樣品來自4個品種共183頭，其中新五豐原種豬場杜洛克豬26頭、大白豬55頭、長白豬34頭；地方品種寧鄉(xiāng)豬68頭。取小塊供試豬耳組織提取DNA。
[0028]PCR 條件:
[0029]PCR 反應體系(總 體積 20 μ L):10Xbuffer2 μ L, 2mmol/L dNTPsl.6 μ L, 20mmol/L MgCl2L 6 μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L，DNA 模板(IOOng/ μ L) I μ L，上下游引物(IOpmoI/ μ L)各 0.5 μ L，ddH2012.4 μ L。
[0030]反應程序:94°C預變性5min ;94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸50s，共33個循環(huán)；72 C后延伸5min,最后4 C保存。
[0031]取10 μ L PCR擴增產物，加2 μ L溴酚藍上樣緩沖液混勻后，點樣于1%的瓊脂糖凝膠(含0.05%ΕΒ)上，然后點6 μ LlOObp DNA Markers作為參照。5V/cm電泳0.5~1.0h。電泳結束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴增結果并拍照，結果如圖1所示。將純化后的PCR產物后送鉬尚生物技術公司測序。
[0032]3.PCR 產物的 BshNl 酶切
[0033]在IOul PCR產物中加入8ullOX內切酶緩沖液、0.2ul限制性內切酶和2ul雙蒸水，總體積為20.2ul，37°C消化4-10h。G/T位點用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，5V/cm電壓電泳0.5h，紫外燈下觀察結果并拍照，酶切結果如圖2，擴增產物進行測序，序列如SEQ ID NO:I所示，擴增片斷為豬GPIl基因的87bp到895bp之間，為第I外顯子的片斷，共809bp，為PCR-RFLP-BshNl分子標記，圖2是本發(fā)明中GPIl基因，PCR-RFLP的三種基因的TT、GT和GG電泳結果。圖中M =DNA分子量標準(DL20001adder)
[0034]PCR-RFLP-BshNl多態(tài)性在各品種中的分布情況如下表1所示，由表1可以看出，在杜洛克豬、長白豬、大白豬中T基因為優(yōu)勢等位基因，T基因頻率分別為1，0.99,0.97，而在寧鄉(xiāng)豬中G基因為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為0.85。從四個品種的基因型頻率分布來看，TT基因型在外來品種的杜洛克豬、長白豬、大白豬中的分布占優(yōu)勢，而在寧鄉(xiāng)豬中，兩個基因型的分布差異較大；卡方檢驗結果表明，本試驗中的三個外來品種杜洛克豬、長白豬和大白豬均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，屬于平衡群體；而本地豬種寧鄉(xiāng)豬不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),不屬于平衡群體。[0035]表1不同品種GPIl基因G/T位點的Hardy-Weinberg平衡檢驗
[0036]
【權利要求】
1.一種仔豬腹瀉抗性相關的GPIl基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。
2.根據(jù)權利要求1所述的仔豬腹瀉抗性相關的GPIl基因片段，其特征在于，序列表SEQID NO:1的625bp處有I個G/T的堿基突變，導致PCR-RFLP-BshNl多態(tài)性。
3.檢測權利要求2所述的一種仔豬腹瀉抗性相關的GPIl基因片段突變的引物對，其特征在于:所述的引物對的正向引物為Y -CTTGGAGCTAAGCAGTGATGTG-3 ,，反向引物為5' -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3'。
4.制備如權利要求2所述的仔豬腹瀉抗性相關的GPIl基因片段的方法，按照以下步驟: 利用權利要求3所述的引物進行PCR擴增，PCR產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用限制性內切酶BshNl對PCR產物進行酶切鑒定，最后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測TT、GT和GG基因型的分布。
5. 權利要求2所述的仔豬腹瀉抗性相關的基因片段在豬分子標記輔助選擇中的應用。
【文檔編號】C12N15/10GK103525822SQ201310502527
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權日:2013年10月23日
【發(fā)明者】何俊, 張珈榕, 馬海明, 蔣雋, 賀長青 申請人:湖南農業(yè)大學