一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟：分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV；TGEV+弗氏佐劑制備免疫原；免疫8周齡的產(chǎn)蛋雞，雞胸部肌肉分點(diǎn)注射免疫原1mL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產(chǎn)雞蛋，分離蛋黃；蛋黃加入硫酸葡聚糖，充分?jǐn)嚢?，離心處理；取離心上清，加30％冷乙醇，充分?jǐn)嚢?，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY；抗仔豬腹瀉IgY能有效治療豬傳染性胃腸炎，見(jiàn)效快，效果好。
【專利說(shuō)明】一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥制備【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胃腸炎又稱幼豬的胃腸炎，是一種高度接觸傳染性，傳播迅速，數(shù)日內(nèi)可蔓延全群，以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水，致兩周齡內(nèi)仔豬高死亡率為特征的病毒性傳染病。
[0003]該病1933年在美國(guó)的伊利諾斯州就有相關(guān)報(bào)道，1946年確定病原體為病毒，并對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)的研究。隨后，在日本、英國(guó)、中南美洲、加拿大、朝鮮和菲律賓都相繼報(bào)道了TGEV0目前在北緯30度以北的溫帶至寒帶地區(qū)，均有TGE發(fā)生。我國(guó)的四川、陜西、湖北、北京、吉林、廣州、臺(tái)灣等省市也有本病的發(fā)生。2周齡內(nèi)仔豬死亡率非常高，日齡越小，死亡越快，5周齡以上的豬只死亡率較低，較大的或成年豬發(fā)病幾乎沒(méi)有死亡，但是這些豬往往成為僵豬，飼料報(bào)酬低。TGEV常常與其他疾病混合發(fā)生或繼發(fā)，是引起規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)仔豬腹瀉性死亡的重要原因之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004]TGEV感染時(shí)被吞咽進(jìn)入消化道，抵抗消化道內(nèi)的胃酸和蛋白水解酶進(jìn)入小腸，小腸是TGEV主要的靶器官。TGEV感染腸上皮細(xì)胞后，迅速破壞功能性上皮細(xì)胞，阻礙小腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解。不能被分解的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如乳糖等在腸腔中的大量聚集，致使腸腔內(nèi)滲透壓升高，從而引起腹瀉和脫水。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)未能提供一種有效治療豬傳染性胃腸炎的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)未能提供一種有效治療豬傳染性胃腸炎的藥物的問(wèn)題。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟:
[0008]步驟一，分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV:取發(fā)病仔豬的空腸和腸系膜淋巴結(jié)置于乳缽內(nèi)，剪碎，反復(fù)研磨，加入PH值為7.0的PBS制成1: 5的組織勻漿，-70°C反復(fù)凍融3次；5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾，然后加入雙抗100IU/mL, _70°C保存，備用；
[0009]將處理病料接種于長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞，每個(gè)樣品接種3瓶，37°C吸附I小時(shí)；傾去病毒液，加入含5%血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，觀察4d，不出現(xiàn)病變者繼續(xù)盲傳5代；有細(xì)胞病變者繼續(xù)傳代，直到細(xì)胞病變穩(wěn)定；
[0010]將出現(xiàn)80%細(xì)胞病變者連同培養(yǎng)基一起于-70°c反復(fù)凍融3次；5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾，然后加入雙抗100IU/mL，用于制作TGEV免疫原；
[0011]步驟二，TGEV與`弗氏完全或不完全佐劑按照1:1的比例，振蕩器充分震蕩混勻，即為免疫原；[0012]步驟三，免疫8周齡的產(chǎn)蛋雞，雞胸部肌肉分點(diǎn)注射免疫原lmL，10天后用不完全佐劑免疫原進(jìn)行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐劑免疫原教學(xué)第三次免疫；
[0013]步驟四，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產(chǎn)雞蛋，分離蛋黃；
[0014]步驟五，蛋黃加入硫酸葡聚糖濃度3.5%，充分?jǐn)嚢瑁?000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清；
[0015]步驟六，上清物加30 %乙醇，充分?jǐn)嚢?，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。 [0016]技術(shù)效果:
[0017]本發(fā)明提供的抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟:分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV ;TGEV+弗氏佐劑制備免疫原；免疫8周齡的產(chǎn)蛋雞，雞胸部肌肉分點(diǎn)注射免疫原lmL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產(chǎn)雞蛋，分離蛋黃；蛋黃加入硫酸葡聚糖，充分?jǐn)嚢?，離心處理；取離心上清，加30%乙醇，充分?jǐn)嚢?，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY ；抗仔豬腹瀉IgY能有效治療豬傳染性胃腸炎，見(jiàn)效快，效果好。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的抗仔豬腹瀉IgY的制備方法的實(shí)現(xiàn)流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定發(fā)明。
[0020]圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的抗仔豬腹瀉IgY的制備方法的實(shí)現(xiàn)流程。
[0021]該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟:
[0022]步驟SlOl，分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV ；
[0023]步驟S102，TGEV+弗氏佐劑制備免疫原；
[0024]步驟S103，免疫8周齡的產(chǎn)蛋雞，雞胸部肌肉分點(diǎn)注射免疫原lmL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；
[0025]步驟S104，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產(chǎn)雞蛋，分離蛋黃；
[0026]步驟S105，蛋黃加入硫酸葡聚糖，充分?jǐn)嚢?，離心處理；
[0027]步驟S106，取離心上清，加30%乙醇，充分?jǐn)嚢?，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。
[0028]本發(fā)明的具體方法為:
[0029]步驟一，分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV:取發(fā)病仔豬的空腸和腸系膜淋巴結(jié)置于乳缽內(nèi)，剪碎，反復(fù)研磨，加入PH值為7.0的PBS制成1: 5的組織勻漿，-70°C反復(fù)凍融3次；5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾，然后加入雙抗100IU/mL, _70°C保存，備用；
[0030]將處理病料接種于長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞，每個(gè)樣品接種3瓶，37°C吸附I小時(shí)；傾去病毒液，加入含5%血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，觀察4d，不出現(xiàn)病變者繼續(xù)盲傳5代；有細(xì)胞病變者繼續(xù)傳代，直到細(xì)胞病變穩(wěn)定；
[0031]將出現(xiàn)80%細(xì)胞病變者連同培養(yǎng)基一起于_70°C反復(fù)凍融3次；5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾，然后加入雙抗100IU/mL，用于制作TGEV免疫原；
[0032]步驟二，TGEV與弗氏完全或不完全佐劑按照1:1的比例，振蕩器充分震蕩混勻，即為免疫原；
[0033]步驟三，免疫8周齡的產(chǎn)蛋雞，雞胸部肌肉分點(diǎn)注射免疫原lmL，10天后用不完全佐劑免疫原進(jìn)行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐劑免疫原教學(xué)第三次免疫；
[0034]步驟四，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產(chǎn)雞蛋，分離蛋黃；
[0035]步驟五，蛋黃加入硫酸葡聚糖濃度3.5 %，充分?jǐn)嚢瑁?000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清；
[0036]步驟六，上清物加30 %乙醇，充分?jǐn)嚢?，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。
[0037]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0038]實(shí)例一:商南縣瑞生實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司豬存欄5000頭，適繁母豬300頭，2012年出現(xiàn)?日齡以內(nèi)仔豬大量腹瀉，發(fā)病率53%，死亡率37%，2013年3月開始試用本技術(shù)試驗(yàn)制劑，至6月，發(fā)病率降至13%，死亡率降至5.3%。
[0039]星光良種豬繁養(yǎng)殖有限公司豬存欄10000頭，適繁母豬800頭，2012年5月開始試用本試驗(yàn)制劑，與前期相比，初生仔豬腹瀉發(fā)病率減少26%，死亡率減少17%，7日齡仔豬成活率達(dá)到94%，顯著提高了公司的經(jīng)濟(jì)效益。
[0040]丹鳳縣山凹凹生態(tài)發(fā)展有限公司豬存欄7000頭，適繁母豬500頭，2013年5月試用本技術(shù)試驗(yàn)制劑，7日齡以內(nèi)仔豬腹瀉發(fā)病率減少30.6%，死亡率減少25.3%，本制劑能使初生仔豬獲得對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒強(qiáng)有力的免疫力，有效降低因豬傳染性胃腸炎導(dǎo)致的大量死亡。
[0041]新起源牧業(yè)有限公司豬存欄2000頭，適繁母豬1000頭，2012年9月試用本技術(shù)的試驗(yàn)制劑后，發(fā)病率和死亡率顯著降低，分別比前期降低36%和30%，顯著防止了仔豬的腹瀉的發(fā)生。
[0042]本發(fā)明實(shí)施例提供的抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟:分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV ;TGEV+弗氏佐劑制備免疫原；免疫8周齡的產(chǎn)蛋雞，雞胸部肌肉分點(diǎn)注射免疫原lmL，10天后第二次免疫，第二次免疫10天后第三次免疫；第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產(chǎn)雞蛋，分離蛋黃；蛋黃加入硫酸葡聚糖，充分?jǐn)嚢?，離心處理；取離心上清，加30 %乙醇，充分?jǐn)嚢?，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY ;抗仔豬腹瀉IgY能有效治療豬傳染性胃腸炎，見(jiàn)效快，效果好。
[0043]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種抗仔豬腹瀉IgY，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的配方組成:按照1: 5的比例用無(wú)菌生理鹽水將卵黃粉(純度> 95% )稀釋。
2.如權(quán)利要求1所述的抗仔豬腹瀉IgY，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的使用方法為:仔豬出生后，立即口服1.0mL，3小時(shí)后再允許仔豬吃初乳。
3.一種抗仔豬腹瀉IgY的制備方法，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟: 步驟一，分離純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV:取發(fā)病仔豬的空腸和腸系膜淋巴結(jié)置于乳缽內(nèi)，剪碎，反復(fù)研磨，加入PH值為7.0的PBS制成1: 5的組織勻漿，_70°C反復(fù)凍融3次；5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾，然后加入雙抗100IU/mL，-70°C保存，備用； 將處理病料接種于長(zhǎng)成單層的ST細(xì)胞，每個(gè)樣品接種3瓶，37°C吸附I小時(shí)；傾去病毒液，加入含5%血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，觀察4d，不出現(xiàn)病變者繼續(xù)盲傳5代；有細(xì)胞病變者繼續(xù)傳代，直到細(xì)胞病變穩(wěn)定； 將出現(xiàn)80%細(xì)胞病變者連同培養(yǎng)基一起于_70°C反復(fù)凍融3次；5000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾，然后加入雙抗100IU/mL，用于制作TGEV免疫原； 步驟二，TGEV與弗氏完全或不完全佐劑按照1:1的比例，振蕩器充分震蕩混勻，即為免疫原； 步驟三，免疫8周齡的產(chǎn)蛋雞，雞胸部肌肉分點(diǎn)注射免疫原lmL，10天后用不完全佐劑免疫原進(jìn)行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐劑免疫原教學(xué)第三次免疫；` 步驟四，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產(chǎn)雞蛋，分離蛋黃； 步驟五，蛋黃加入硫酸葡聚糖濃度3.5 %，充分?jǐn)嚢瑁?000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清； 步驟六，上清物加30%乙醇，充分?jǐn)嚢瑁x心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。
【文檔編號(hào)】C07K16/02GK103724429SQ201310718916
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】敬曉棋, 黃光東, 張瓊, 陳生葉 申請(qǐng)人:黃光東