一種適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用，通過生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在二穗短柄草中尋找到了作為轉(zhuǎn)基因二穗短柄草定性、定量PCR檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)锽DFIM基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示。該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因可用于定性、定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因二穗短柄草的外源基因，及用于分析外源基因在轉(zhuǎn)基因二穗短柄草種的拷貝數(shù)。
【專利說明】—種適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種適合轉(zhuǎn)基因二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]所謂的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，是某種植物中具有種間特異性、種內(nèi)非特異性、低拷貝數(shù)特征的一類基因。種間特異性指的是選定的基因?qū)τ诖宋锓N是特異的，而在其他物種中具有很低的同源性；種內(nèi)非特異性指的是內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在同一物種的不同栽培種中具有很高的同源性和相似性。例如，在植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測(cè)中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因常被用來作為定量檢測(cè)的內(nèi)對(duì)照，要求內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在不同栽培種中具有種內(nèi)特異性的特點(diǎn)。在對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定量檢測(cè)中，由于定量檢測(cè)的外源基因一般是低拷貝的，因此要求內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因具有低拷貝數(shù)的特點(diǎn)，一般內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)镮~3個(gè)拷貝，最理想的情況是I個(gè)拷貝。
[0003]在植物轉(zhuǎn)基因及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的首要作用是確定檢測(cè)樣品的物種來源。在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中，如果待檢測(cè)的樣品是植物原料，那產(chǎn)品的植物來源是可以很容易從外觀知道。但是對(duì)于植物加工產(chǎn)品，如面粉、食品、植物油等產(chǎn)品，是很難從外觀上分清植物材料的來源。這時(shí)就需要內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因來對(duì)植物產(chǎn)品的來源進(jìn)行鑒定。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因是物種特異性的，可以用來將這一物種與其他的物種以至近源種區(qū)別開來。因此通過建立內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的PCR檢測(cè)系統(tǒng)可以準(zhǔn)確的判斷檢測(cè)樣品中的植物成分來源，為進(jìn)一步分析奠定基礎(chǔ)。
[0004]植物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因可以對(duì)核酸提取的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)過程中，核酸提取的質(zhì)量對(duì)于PCR結(jié)果有非常大的影響。由于植物材料之間有很大的差異，加工程度也不盡相同，因此核酸提`取方法也應(yīng)根據(jù)不同的需要進(jìn)行改進(jìn)。在對(duì)樣品提取的核酸進(jìn)行PCR分析之前，有必要對(duì)DNA提取的效果進(jìn)行充分合理的評(píng)價(jià)，以保證PCR分析的準(zhǔn)確性。對(duì)于DNA質(zhì)量的評(píng)定可以通過分光光度計(jì)法、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和熒光測(cè)定法進(jìn)行。但是這些方法只能對(duì)所抽提的核酸進(jìn)行數(shù)量或質(zhì)量上的粗略估計(jì)，并不能判斷抽提的DNA溶液中是否含有PCR反應(yīng)的抑止因子。設(shè)立內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因作為實(shí)驗(yàn)的一個(gè)對(duì)照是解決這一問題的有效方法。作為對(duì)照的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PCR體系的正常工作與否，可以指示抽提的樣品DNA能否用于進(jìn)行PCR檢測(cè)分析。因此，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因是排除假陰性結(jié)果的有效手段。
[0005]內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量PCR檢測(cè)中起到內(nèi)參照的作用。轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的定量PCR檢測(cè)可以分為兩種方法，即絕對(duì)定量法和相對(duì)定量法。簡(jiǎn)單來說，絕對(duì)定量法獲的結(jié)果，是檢測(cè)樣品中的植物基因組或外源目的基因的絕對(duì)質(zhì)量或拷貝數(shù)。相對(duì)定量法獲的結(jié)果，是檢測(cè)樣品中外源目的基因在樣品基因組DNA中的百分含量，結(jié)果用外源目的基因的拷貝數(shù)和植物基因組拷貝數(shù)的比值表示。在實(shí)際轉(zhuǎn)基因檢測(cè)和各國(guó)標(biāo)簽制度實(shí)施時(shí)，依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)是樣品中的具體轉(zhuǎn)基因相對(duì)含量，其必須通過相對(duì)定量法分析獲得，而絕對(duì)定量在實(shí)際檢測(cè)中則只能作為相對(duì)定量方法的一個(gè)過程。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因用于植物基因組DNA的質(zhì)量或者拷貝數(shù)的定量分析。而且內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因的定量檢測(cè)起著決定性的作用，沒有合適的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因是不可能對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行定量分析的，也不能確定轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品的準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因含量。
[0006]轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)常影響目的基因的表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性。因此，轉(zhuǎn)基因研究中關(guān)鍵的一步就是檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)，以篩選出拷貝數(shù)少或單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株供進(jìn)一步的研究或育種利用。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測(cè)主要是Southern雜交法，但該方法工作量大，需要的DNA材料較多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且經(jīng)常要用到放射性同位素等具有潛在危險(xiǎn)的藥品。近年來，利用高通量、快速、靈敏的定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)逐漸受到科研人員的青睞。該方法根據(jù)Ct (cycle thresholds)值與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值成反比線性關(guān)系的原理，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得Ct值與起始模板數(shù)的相關(guān)性方程，將樣品的Ct值代入該方程就可獲得目的基因的起始模板數(shù)，通過與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因起始模板數(shù)的比較，就可知道基因組中該外源基因拷貝數(shù)。
[0007]內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性和定量PCR檢測(cè)及拷貝數(shù)檢測(cè)中都有非常重要的作用，國(guó)際上對(duì)于植物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的研究也發(fā)展的非?？?。到目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道的用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因共有27個(gè)。其中大豆的Lectin基因是最早用于轉(zhuǎn)基因抗草苷膦大豆GTS40-3-2檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，Lectin基因是大豆中特有的凝集素基因，通過對(duì)Lectin基因的檢測(cè)，確定檢測(cè)樣品中是否含有大豆來源和判斷檢測(cè)樣品DNA的質(zhì)量，并在轉(zhuǎn)基因大豆定量檢測(cè)中作為定量?jī)?nèi)參照。玉米的Zein、zssIIb、hmgA、Invertase和Adhl基因都曾被用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測(cè)，也有文章對(duì)玉米的這幾個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)上述幾個(gè)基因都適合于轉(zhuǎn)基因玉米的定性PCR檢測(cè)，但是目前還未發(fā)現(xiàn)關(guān)于對(duì)二穗短柄草內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的報(bào)道。
[0008]二穗短柄草是一種冷季型溫帶禾本科植物，在一些地方也常常作為一種牧草，該種植物由于具備株型矮小、自花授粉、種子不散落，生命周期短、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，近年來被作為一種新型的禾本科模式植物，因此轉(zhuǎn)基因二穗短柄草技術(shù)也迅速發(fā)展。由于外源基因的拷貝數(shù)對(duì)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)影響較大，因此當(dāng)拿到一個(gè)轉(zhuǎn)基因植株時(shí)首先要對(duì)它的外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，傳統(tǒng)的拷貝數(shù)分析是利用Southern檢測(cè)技術(shù)，該種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且成本較高，如果要對(duì)大量的材料進(jìn)行分析，工作量比較大。因此近年出現(xiàn)了利用定量PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因植物基因外源基因拷貝數(shù)分析，該種技術(shù)可以彌補(bǔ)Southern檢測(cè)技術(shù)的不足，尤其適合對(duì)大量材料進(jìn)行高通量檢測(cè)。除此之外二穗短柄草也可以作為一種牧草，因此轉(zhuǎn)基因二穗短柄草也可能被加工成飼料，在對(duì)飼料進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的時(shí)候也需要該種植物的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。但是目前國(guó)際上尚未有適合二穗短柄草外源基因檢測(cè)和拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的報(bào)道。因此，篩選適合二穗短柄草外源基因檢測(cè)和拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)Υ龠M(jìn)二穗短柄草轉(zhuǎn)基因研究意義十分重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)和拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用，克服目前尚未有適合二穗短柄草外源基因檢測(cè)和拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的現(xiàn)狀。
[0010]本發(fā)明所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)和拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，是二穗短柄草內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因BDFIM基因，其序列如SEQ ID NOl所示，并根據(jù)BDFIM基因序列設(shè)計(jì)定性、定量PCR檢測(cè)的引物對(duì)BDFM-F/BDFM-R，設(shè)計(jì)Southern探針進(jìn)行BDFM基因拷貝數(shù)分析，用于轉(zhuǎn)基因二穗短柄草檢測(cè)，其中，定性PCR檢測(cè)和定量PCR檢測(cè)的引物對(duì)相同，其序列如SEQ ID N02所示和SEQ ID N03所示，Southern探針序列如SEQ ID N04所示。
[0011]本發(fā)明的適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的應(yīng)用，用于定性、定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因二穗短柄草的外源基因。
[0012]本發(fā)明的適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的應(yīng)用，用于分析外源基因在轉(zhuǎn)基因二穗短柄草中的拷貝數(shù)。
[0013]進(jìn)一步，本發(fā)明設(shè)計(jì)了利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)BDFM基因測(cè)定二穗短柄草外源基因拷貝數(shù)的引物對(duì)HPT-F/HPT-R，其序列分別如SEQ ID N05所示和SEQ ID N06所示。
[0014]進(jìn)一步，本發(fā)明所述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因-BDFM基因具備種內(nèi)一致性，即所有的二穗短柄草品種均含有BDFIM基因；所述BDFIM基因還具備種間特異性，即在其它物種里沒有該基因；通過Southern雜交還證明了 BDFM基因在二倍體二穗短柄草基因組中的拷貝數(shù)是I。
[0015]本發(fā)明利用生物信息學(xué)手段對(duì)BDFM基因序列進(jìn)行分析，獲取了二穗短柄草的內(nèi)源基因BDF頂序列，其序列如SEQ ID NOl所示。通過利用定性、定量PCR法分別對(duì)14種不同品種的二穗短柄草和16種其它物種進(jìn)行檢測(cè)，證明二穗短柄草BDFM基因種間特異性、種內(nèi)非特異性的特點(diǎn)；通過利用Southern雜交方法對(duì)7種不同品種二穗短柄草進(jìn)行BDFM基因拷貝數(shù)分析，結(jié)果表明3種不同品種二倍體二穗短柄草中BDFIM基因都是I個(gè)拷貝，在4種不同品種多倍體二穗短柄草中BDFIM基因是多拷貝。由于目前用于二穗短柄草轉(zhuǎn)基因研究的受體材料以二倍體為主，所以，BDFIM基因符合內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的低拷貝特點(diǎn)，通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明=BDFIM基因符合內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特點(diǎn)。
[0016]本發(fā)明的通過對(duì)二穗短柄草的外源基因HPT基因進(jìn)行拷貝數(shù)分析，進(jìn)一步證明了該BDFIM基因可以作為二穗短柄草的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
[0018]本發(fā)明通過生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在二穗短柄草中尋找到了作為轉(zhuǎn)基因二穗短柄草外源基因檢測(cè)和拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因-BDFM基因，該BDFM基因具有種內(nèi)一致性、種間特異性、低拷貝數(shù)的特點(diǎn)，符合內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的標(biāo)準(zhǔn)要求，適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為BDFIM片段的核苷酸序列及定性、定量PCR引物位置。
[0020]圖2為BDFM基因種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果，其中，M為marker，I為BD21，2為BD21-3，3 為 BDl-1,4 為 BD29_1，5 為 BD18_1，6 為 BD23_1，7 為 BD26_1，8 為 BD13_1，9 為BD2-3,10 為 BD20-1,11 為 BD10-1，12 為 BD28,13 為 BD25-1，14 為 BD19-2，15 為陰性對(duì)照。
[0021]圖3為BDF頂基因種間特異性鑒定結(jié)果，其中M為Marker，I為二穗短柄草，2為月季，3為棉花，4為黑麥草，5為康乃馨，6為麥冬，7為非洲菊，8為狗牙根，9為煙草，10為玉米，11為水稻，12為大 豆,13為小麥，14為大麥,15為擬南芥。
[0022]圖4為BDFM基因種內(nèi)非特異性定量鑒定結(jié)果。
[0023]圖5為BDFM基因種間特異性定量鑒定結(jié)果。[0024]圖6為Southern-Blot分析內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)，其中I為Bd21_3，2為Bd21，3
為 Bd29-1，4 為 Bdl9-2，5 為 Bd20_l，6 為 Bd28，7 為 BdlO-1，8 為空白對(duì)照。
[0025]圖7為BdFM基因?qū)崟r(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。
[0026]圖8為BdF頂基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0027]圖9為HPT基因?qū)崟r(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線。
[0028]圖10為HPT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但所述實(shí)施例不限制本
發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)說明的是，以下實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管
參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明
的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋
在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0030]實(shí)施例1
[0031]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0032]1.1植物材料
[0033]二穗短柄草:選用的二穗短柄草材料為二倍體植株和多倍體植株，詳見表1。
[0034]表1實(shí)驗(yàn)中所選用的二穗短柄草材料
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，其特征在于，所述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)锽DF頂基因，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，其特征在于，針對(duì)所述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列設(shè)計(jì)定性、定量PCR檢測(cè)的引物，設(shè)計(jì)Southern探針進(jìn)行BDFIM基因拷貝數(shù)分析，用于轉(zhuǎn)基因二穗短柄草檢測(cè)，其中，定性、定量PCR檢測(cè)的引物對(duì)相同，其序列如SEQ ID N02所示和SEQ ID N03所示，Southern探針序列如SEQ IDN04所示。
3.如權(quán)利要求1所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的應(yīng)用，其特征在于，用于定性、定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因二穗短柄草的外源基因。
4.如權(quán)利要求1所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的應(yīng)用，其特征在于，用于分析外源基因在轉(zhuǎn)基因二穗短柄草中的拷貝數(shù)。
5.如權(quán)利要求4所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測(cè)及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的應(yīng)用，其特征在于，分析外源基因在轉(zhuǎn)基因二穗短柄草種的拷貝數(shù)所用的引物對(duì)為HPT-F/HPT-R，其序列如 SEQ` ID N05 所示和 SEQ ID N06 所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525922SQ201310454983
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】?jī)?chǔ)昭慶, 朱宏 申請(qǐng)人:上海辰山植物園