一種球形酶制品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種球形酶制品及其制備方法，以解決現(xiàn)有在油包水乳液中制備交聯(lián)酶聚集體的方法制得的酶顆粒較大、孔隙率較小的問題。該球形酶制品是由下述原料復合而成：0.4份的酶液、0.1—0.25份的酶活性位點保護劑、0.1～0.35份的表面活性劑、10份的礦物油和0.1～0.2份的交聯(lián)劑。制備方法包括粗酶的純化、乳化液體系、制備交聯(lián)劑、球形酶的形成步驟；本發(fā)明球形酶制備方法具有如下優(yōu)點：1）操作簡單、快速，制備成本低；2）顆粒尺寸易于控制；3）酶活性和穩(wěn)定性有較大幅度提高；4）適宜于多種單一酶或多種酶的固定化，具有一定的通用性；5）有較高的機械性能。
【專利說明】一種球形酶制品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種球形酶制品及基于乳化液的球形酶制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酶作為催化劑被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，從環(huán)境應(yīng)用如污水治理和生物修復、食品和飲料生產(chǎn)等到化學品生產(chǎn)，如此廣闊的應(yīng)用歸功于酶的高選擇性催化性能，而且在催化過程中酶潛在地降低了介質(zhì)中的毒性成分或有害副產(chǎn)物，降低了污水污染和能源消耗。然而，催化劑在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用存在許多缺點，除了高成本外還顯示出游離酶對溫度、PH值、有機溶劑、氧化作用和剪切力的不穩(wěn)定性，而且游離酶不能被回收利用，導致酶的應(yīng)用受到限制。
[0003]通過酶的固定化可以克服上述問題，但傳統(tǒng)有載體固定化方法制備成本相對較高、酶活性損失較大以及載體的存在降低了其對酶的承載量，通過以酶的無載體固定化代替有載體固定化可以大大降低制備成本和增加單位量的酶活性。
[0004]目前有許多無載體固定化催化劑研究成果和專利方法，如交聯(lián)溶解酶、交聯(lián)酶晶體、交聯(lián)酶聚集體和交聯(lián)噴霧干燥酶，尤以交聯(lián)酶晶體和交聯(lián)酶聚集體的研究最為廣泛。董曉毅利用CLEAs技術(shù)對脲酶聚集體進行了固定化，將游離脲酶用硫酸銨沉淀后，以戊二醛作為交聯(lián)劑對其進行化學交聯(lián)，得到交聯(lián)脲酶聚集體；潘力采用氣相平衡法對脂肪酶進行結(jié)晶化后再以2-甲基-2，4戊二醇為沉淀劑、戊二醛為交聯(lián)劑制備出交聯(lián)脂肪酶晶體顆粒應(yīng)用于不對稱有機合成反應(yīng)中，取得較好效果。
[0005]但上述所述幾種固定化方法均存在較多缺陷，如CLEC技術(shù)要求易于結(jié)晶化的高純度酶，因而制備成本高和應(yīng)用范圍有限；而CLEA技術(shù)依賴于酶的初始沉淀，然后再交聯(lián)，該方法雖然制備成本較低、工藝簡單、要求酶純化到一定程度即可，然而CLEA和CELC技術(shù)都存在由于酶顆粒尺寸的增加而引起的擴散限制，造成催化效率不高；另外，現(xiàn)有在油包水乳液中制備交聯(lián)酶聚集體的方法，制得的酶顆粒較大、孔隙率較小而造成小分子底物向顆粒內(nèi)部滲透受阻，催化效率不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種球形酶制品，以解決現(xiàn)有在油包水乳液中制備交聯(lián)酶聚集體的方法制得的酶顆粒較大、孔隙率較小的問題。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種基于乳化液體系的球形酶制品的制備方法。
[0008]一種球形酶制品，是由下述原料復合而成:
按照以下體積份配比復合，0.4份的酶液、
0.1—0.25份的酶活性位點保護劑、
0.1~0.35份的表面活性劑、
10份的礦物油和
0.1~0.2份的交聯(lián)劑；其中酶液為50~100重量份的純化酶溶解于I體積份的緩沖液中而成。
[0009]酶選自脂肪酶或蛋白酶、糖化酶、漆酶等其他酶種。緩沖液選5mmol/L乙醇胺，本發(fā)明所提到的緩沖液是根據(jù)酶種類來選擇的，并根據(jù)酶特性調(diào)節(jié)為所需PH值；緩沖液為市場購買。
[0010]進一步的，所述表面活性劑為Span-20。所述交聯(lián)劑為戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物或戊二醛-乙二胺溶液，所述戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物為由25%戊二醛溶液與3~5%的聚乙烯亞胺溶液按照體積比1:1混合而成，所述戊二醛-乙二胺溶液由25%戊二醛與
0.33!1101/1的乙二胺溶液按照1:1一1: 3的體積比混合而成。其中乙二胺和聚乙烯亞胺的作用是增加酶分子與戊二醛的鏈接長度，可以控制球形酶的顆粒尺寸。
[0011]進一步的，所述酶活性位點保護劑為三丁酸甘油酯.可根據(jù)不同酶選擇不同的酶活性位點保護劑。本發(fā)明所提到的酶活性位點保護劑一般為酶的底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物。
[0012]進一步的,所述的表面活性劑選自Span-20,添加量優(yōu)選0.25ml。表面活性劑也可以是其他Span系列及壬基酚聚氧乙烯醚代替。本發(fā)明所提到的Span-20為非離子型表面活性劑，其作用是增加酶分子的表面疏水性，以利于酶分子朝著油水相界面處遷移。
[0013]一種球形酶制 備方法，包括以下步驟:
本發(fā)明球形酶制品，是在油包水乳化液體系中形成的。
[0014]A、粗酶的純化:采用超濾濃縮-透析法或離子交換柱法，對粗制酶進行純化，然后經(jīng)真空冷凍干燥后作為待固定的純化酶；
B、乳化液體系:該乳化液體系是由油相和水相組分，其中:
水相組分是體積份為0.4份的酶液和0.1-0.25份的酶活性位點保護劑，其中酶液為50~100重量份的純化酶溶解于I體積份的緩沖液中而成；
油相組分為0.1~0.35份的表面活性劑和10份的礦物油，可以磁力攪拌5~lOmin。
[0015]C、制備交聯(lián)劑:交聯(lián)劑戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物是由25%戊二醛溶液與3~5%的聚乙烯亞胺溶液按照體積比1:1混合反應(yīng)2~5min形成；交聯(lián)劑戊二醛-乙二胺是由25%戊二醛與0.33mol/L的乙二胺溶液按照1:1一 1: 3的體積比反應(yīng)5min~15min形成；
D、球形酶的形成:將上述油相組分與水相組分混合，攪拌，然后添加0.1~0.2體積份的交聯(lián)劑進行乳化交聯(lián)，分離得到球形酶，用緩沖液沖洗后得到該酶的球形酶顆粒。
[0016]為了更好的實現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟D球形酶的形成過程中，為了防止交聯(lián)過程中乳化液被破壞，添加交聯(lián)劑后乳化液體系在700rpm轉(zhuǎn)速條件下每隔30min攪拌5min,共進行2h—4h,隨后乳化液體系4000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min,分離得到球形酶；或者在700rpm轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌2~4h ;優(yōu)選在700rpm轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌2~4h。
[0017]為了更好的實現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟D球形酶的形成過程中，分離得到的球形酶，用含有5mmol/L乙醇胺的緩沖液沖洗數(shù)次。作用是清除球形酶顆粒表面和內(nèi)部過剩的戊二醛。
[0018]為了更好的實現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟D球形酶的形成過程中，分離得到的球形酶，用乙醇胺的緩沖液沖洗數(shù)次，再用20mmol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液沖洗以清除未反應(yīng)的
乙醇胺。[0019]本發(fā)明球形酶的制備方法適用于大多數(shù)生物酶，經(jīng)過部分純化后的酶可以用冷凍干燥的方法制成干粉狀，以防酶在溶液狀態(tài)下失活。
[0020]本發(fā)明的原理:在添加有表面活性劑的油包水乳化液體系中，蛋白質(zhì)或酶分子在攪拌條件下由于受到疏水基的促使而集中于液滴球形面上，經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)形成一種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的無載體固定化酶球形顆粒。
[0021]本發(fā)明提供的球形酶制備方法較其它無載體固定化酶相比，具有如下優(yōu)點:1)操作簡單、快速，制備成本低；2)顆粒尺寸易于控制；3)酶活性和穩(wěn)定性有較大幅度提高；4)適宜于多種單一酶或多種酶的固定化，具有一定的通用性；5)有較高的機械性能。
[0022]本發(fā)明所形成的球形酶制品為穩(wěn)定性較好、高酶活的具有空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球形酶制品，可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護、生物傳感、檢測、有機合成及醫(yī)藥生產(chǎn)等諸多領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0024]下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明球形酶制品是在油包水乳化液體系中形成的，本發(fā)明實施例以脂肪酶作為實驗用酶。
[0026]實施例1
A、粗酶的純化:采用超濾濃縮-透析法或離子交換柱法對粗脂肪酶進行部分純化，然后經(jīng)真空冷凍干燥后作為待固定的純化脂肪酶；
B、乳化液體系:該乳化液體系是由油相和水相組分，其中:
水相組分:取酶液0.4ml，然后向其中加入0.1ml脂肪酶酶活性位點保護劑三丁酸甘油酯；酶液由IOOmg純化脂肪酶溶解于Iml濃度為20mmol/L、pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液中制成；
油相組分:0.25ml的Span-20加入到IOml礦物油中，磁力攪拌lOmin。
[0027]C、制備交聯(lián)劑:25%戊二醛溶液與3%的聚乙烯亞胺溶液按照體積比1:1混合反應(yīng)2min，形成戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物；
D、球形酶的形成:將上述油相組分與水相組分混合，于磁力攪拌器上在1500rpm轉(zhuǎn)速條件下攪拌lmin，然后添加0.15 ml戊二醛-聚乙烯亞胺溶液進行乳化交聯(lián)，為了防止交聯(lián)過程中乳化液被破壞，乳化液體系在700rpm轉(zhuǎn)速條件下每隔30min攪拌5min,持續(xù)2h,隨后乳化液體系4000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min,分離得到球形酶,然后用含有5mmol/L乙醇胺的緩沖液沖洗數(shù)次后，再用濃度為20mmol/L的Tris-HCl緩沖液沖洗以清除未反應(yīng)的乙醇胺，即可得到脂肪酶球形酶顆粒。
[0028]本實施例以脂肪酶作為實驗酶，用相應(yīng)國標方法或國際通用的酶活測定方法檢測球形酶酶活。結(jié)果是本實施例1所得脂肪酶球形酶酶活殘留率最高，為86.3%。
[0029]實施例2
重復實施例1的步驟，有以下不同點:制備交聯(lián)劑的反應(yīng)時間不同，25%戊二醛溶液與3%的聚乙烯亞胺溶液的混合反應(yīng)時間為5min。然后測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，所得脂肪酶球形酶酶活殘留率為85.8%。
[0030]實施例3
重復實施例1的步驟，有以下不同點:制備交聯(lián)劑的原料濃度不同，聚乙烯亞胺溶液的濃度為5%，然后測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，所得脂肪酶球形酶酶活殘留率為73.4%。
[0031]實施例4
與實施例3有以下不同點:制備交聯(lián)劑的反應(yīng)時間不同為5min，然后測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，所得脂肪酶球形酶酶活殘留率為72.6%。
[0032]實施例5
重復實施例1的步驟，交聯(lián)劑的用量仍為0.15ml，有以下不同點:交聯(lián)劑的選擇不同，交聯(lián)劑為25%戊二醛與0.33mol/L的乙二胺溶液按照1:1的體積比反應(yīng)lOmin，然后測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，酶活殘留率為78.6%。
[0033]實施例6
與實施例5有以下不同點:25%戊二醛與0.33mol/L的乙二胺溶液的體積比不同為1: 2的體積比，反應(yīng)時間不同為5min，測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，酶活殘留率達到68.6%。
[0034]實施例7
與實施例5有以下不同點:25%戊二醛與0.33mol/L的乙二胺溶液的體積比不同為1:
3的體積比，測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，酶活殘留率達到60.4%。
[0035]對比例I
重復實施例1的步驟，有以下不同點:交聯(lián)劑的選擇不同，以25%戊二醛溶液為交聯(lián)劑，測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活。結(jié)果顯示:所得脂肪酶球形酶的酶活殘留率為43.4%。
[0036]說明本發(fā)明實施例的效果明顯比對比例的酶活殘留率高。
[0037] 對于交聯(lián)劑不同添加量的選擇見以下實施例8-11。
[0038]實施例8
重復實施例1的步驟，有以下不同點:添加0.1 ml的戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物進行乳化交聯(lián)。測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，酶活殘留率為79.3%。
[0039]實施例9
重復實施例1的步驟，有以下不同點:添加0.2ml的戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物進行乳化交聯(lián)。測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，酶活殘留率為73.5%。
[0040]實施例10
與實施例5有以下不同點:添加0.1 ml戊二醛-乙二胺聚合物進行乳化交聯(lián)。然后測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活。結(jié)果如表2所示，當Glu-EDA的添加量為0.1 ml時,酶活殘留率為59%。
[0041]實施例11
與實施例5有以下不同點:添加0.2 ml戊二醛-乙二胺聚合物進行乳化交聯(lián)，測定該脂肪酶球形酶的表觀酶活，酶活殘留率為62%。
[0042]實施例1、8_11結(jié)果表明:實施例中在脂肪酶球形酶制備中以戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物為交聯(lián)劑，交聯(lián)劑添加量為0.15 ml時，所得球形酶酶活殘留率最高。
[0043]攪拌方式的選擇見以下實施例12 — 14:
實施例12
重復實施例1的步驟，有以下不同點:乳化液體系的攪拌時間為持續(xù)攪拌4h，用帶有測微尺的光學顯微鏡檢測球形酶顆粒尺寸。結(jié)果顯示:該球形酶顆粒大小平均值為270微米，并有少許球形酶顆粒聚集成較大顆粒。
[0044]實施例13
重復實施例1的步驟，有以下不同點:加入交聯(lián)劑后置于磁力攪拌器上，不是每隔30min攪拌5min，持續(xù)4h，而是在4°C溫度條件下連續(xù)攪拌2h。然后用帶有測微尺的光學顯微鏡測定球形酶顆粒的大小。結(jié)果顯示:該球形酶顆粒大小平均值為120微米，且無球形酶顆粒聚集現(xiàn)象。
[0045]實施例14
重復實施例1的步驟，有以下不同點:油相與水相混合，加入交聯(lián)劑后置于磁力攪拌器上，700rpm攪拌lOmin，在4°C條件下靜置10h。然后用帶有測微尺的光學顯微鏡測定球形酶顆粒的大小。結(jié)果顯示:該球形酶顆粒大小平均值為660微米，并有大量的球形酶顆粒聚集成較大顆粒。
[0046]實施例12-14的結(jié)果表明:實施例13的效果最好。
[0047]酶液濃度的選擇 見 實施例15及對比例2:
實施例15
重復實施例1的步驟，有以下不同點:制備酶液的純化酶的用量不同，為50mg，然后測定球形酶酶活和蛋白質(zhì)含量，并計算球形酶酶活回收率。球形酶酶活回收率是52%。
[0048]對比例2
重復實施例1的步驟，有以下不同點:制備酶液的純化酶的用量不同，為150mg。測定球形酶酶活和蛋白質(zhì)含量，并計算球形酶酶活回收率。顯示當用Iml緩沖液中溶解150 mg純化酶時，在油相中無法充分分散，影響球形酶的形成。
[0049]實施例1和實施例15及對比例2結(jié)果表明:實施例1中純化酶的用量為IOOmg時，所得球形酶酶活殘留率最高 。
[0050]通過本發(fā)明實施例與對比例的比較，說明本發(fā)明所制的球形酶都具有較高的酶活回收率。
【權(quán)利要求】
1.一種球形酶制品，其特征在于它是由下述原料復合而成: 按照以下體積份配比復合，0.4份的酶液、 0.1—0.25份的酶活性位點保護劑、 0.1~0.35份的表面活性劑、 10份的礦物油和 0.1~0.2份的交聯(lián)劑； 其中酶液為50~100重量份的純化酶溶解于I體積份的緩沖液中而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種球形酶制品，其特征在于:所述表面活性劑為Span-20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種球形酶制品，其特征在于:所述交聯(lián)劑為戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物或戊二醛-乙二胺溶液，所述戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物為由25%戊二醛溶液與3~5%的聚乙烯亞胺溶液按照體積比1:1混合而成，所述戊二醛-乙二胺溶液由25%戊二醛與0.33mol/L的乙二胺溶液按照1:1一 I: 3的體積比混合而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種球形酶制品，其特征在于:所述酶活性位點保護劑為三丁酸甘油酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種球形酶制品，其特征在于:所述的表面活性劑選自Span-20，添加量優(yōu)選0.25體積份。
6.一種球形酶制備方法`，其特征在于包括以下步驟: A、粗酶的純化:對粗制酶進行純化，然后經(jīng)真空冷凍干燥后作為待固定的純化酶； B、乳化液體系:該乳化液體系是由油相和水相組分，其中水相組分是體積份為0.4份的酶液和0.1—0.25份的酶活性位點保護劑，其中酶液為50~100重量份的純化酶溶解于I體積份的緩沖液中而成； 油相組分為0.1~0.35份的表面活性劑和10份的礦物油； C、制備交聯(lián)劑:交聯(lián)劑戊二醛-聚乙烯亞胺共聚物是由25%戊二醛溶液與3~5%的聚乙烯亞胺溶液按照體積比1:1混合反應(yīng)2~5min形成；交聯(lián)劑戊二醛-乙二胺是由25%戍二醒與0.33mol/L的乙二胺溶液按照1:1一 1: 3的體積比反應(yīng)5min~15min形成； D、球形酶的形成:將上述油相組分與水相組分混合，攪拌，然后添加0.1~0.2體積份的交聯(lián)劑進行乳化交聯(lián)，分離得到球形酶，用緩沖液沖洗后得到該酶的球形酶顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種球形酶制備方法，其特征在于:所述步驟D球形酶的形成過程中，添加交聯(lián)劑后乳化液體系在700rpm轉(zhuǎn)速條件下每隔30min攪拌5min,共進行2h—4h,隨后乳化液體系4000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min,分離得到球形酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種球形酶制備方法，其特征在于:所述步驟D球形酶的形成過程中，添加交聯(lián)劑后乳化液體系在在700rpm轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌2~4h。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的球形酶制備方法，其特征在于:所述步驟D球形酶的形成過程中，分離得到的球形酶，用含有5mmol/L乙醇胺的緩沖液沖洗數(shù)次。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的球形酶制備方法，其特征在于:所述步驟D球形酶的形成過程中，分離得到的球形酶，用乙醇胺的緩沖液沖洗數(shù)次，再用20mmol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液沖洗以清除未反應(yīng)的乙醇胺。
【文檔編號】C12N11/08GK103484445SQ201310453870
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】魏甲乾, 張文齊, 陳娟 申請人:甘肅省科學院生物研究所