一種快速檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈中等抗性水平菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈中抗菌株的方法，可用于引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗性群體的動態(tài)監(jiān)測及流行預警。本發(fā)明是以環(huán)介導恒溫擴增技術(LAMP)為基礎建立起來的一種快速檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株的分子技術。該檢測方法通過在禾谷鐮孢菌對多菌靈的中抗菌株(F167Y)的β2微管蛋白上設計2對特異性引物，進行LAMP擴增，根據(jù)反應產(chǎn)物顏色判定是否為禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株。如果顏色為天藍色(有擴增產(chǎn)物)為禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株；如果顏色為紫色(無擴增產(chǎn)物)則為禾谷鐮孢菌敏感菌株。本發(fā)明簡便、快速、成本低，對小麥赤霉病菌抗性風險評估及合理用藥具有重要的現(xiàn)實意義。
【專利說明】一種快速檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈中等抗性水平菌株的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明是基于環(huán)介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)對禾谷鐮孢菌的多菌靈中等抗性水平菌株的快速分子檢測方法,可用于禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性群體發(fā)展的動態(tài)監(jiān)測與抗性風險評估，進行抗藥性小麥赤霉病的流行預測，為小麥赤霉病的防治提供用藥指導。
【背景技術】
[0002]環(huán)介導恒溫擴增反應(LAMP)是2000年由日本學者Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸體外擴增技術，廣泛應用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術原理是:利用一套(4種)特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應，60?65 °C范圍60min內(nèi)，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。羥基萘酚藍(HNB)是一種金屬離子指示劑，根據(jù)反應液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色，陰性(沒有擴增出產(chǎn)物)時為紫色，陽性(有產(chǎn)物擴增)時為天藍色。LAMP方法的最大特點就是實現(xiàn)恒溫擴增，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器；擴增反應極快，一般在I小時內(nèi)完成；擴增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，通過肉眼即可判定結果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度高、特異性強；操作簡便、快捷，極適于病原的快速診斷及檢測。
[0003]小麥赤霉病是一類由禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)引起的一種分布較廣、破壞性較強的世界性病害，嚴重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。多年來，小麥赤霉病主要采用苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的復配劑進行化學防治。但是隨著使用年限和頻率的增長，田間逐漸產(chǎn)生了抗藥性群體，從而導致該病防效下降。經(jīng)過多年的研究，南京農(nóng)業(yè)大學植物藥理學和病害防控實驗室發(fā).現(xiàn)小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性菌株主要是由禾谷鐮孢菌β2_微管蛋白基因(FGSG06611.3)突變造成，該基因編碼第167位和200位氨基酸密碼子的突變分別為TTT (Phe) — TAT (Tyr)和TTC(Phe) — TAC(Tyr)。第167位或者200位氨基酸密碼子的突變可引起禾谷鐮孢菌對多菌靈中等抗藥性的產(chǎn)生，其中第167位突變占所有抗藥性突變類型總量的95%以上，成為病原菌產(chǎn)生田間抗藥性的主要原因。
[0004]病原菌在自然界的數(shù)量巨大，抗藥性個體在群體中的比例達到3%時，即可引起抗藥性病害流行，導致藥劑防治失敗。傳統(tǒng)的檢測方法需要分離培養(yǎng)病原菌，然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再根據(jù)藥劑對菌絲生長的抑制作用鑒別抗藥性。本發(fā)明在抗藥性機制研究的基礎上，基于LAMP技術能快速、準確檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗藥性。該檢測方法具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點，能大大提高檢測效率，對小麥赤霉病的有效防治、抗藥性流行預警具有重要的現(xiàn)實意義。然而，經(jīng)檢索目前國內(nèi)外尚未有禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株的LAMP快速分子檢測的相關報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]已報道的禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株的鑒定及檢測方法存在費時、費力、成本高的缺點。針對這一缺點，根據(jù)禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株的基因型，通過實驗條件優(yōu)化，建立了一種快速檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株的方法。該方法具有簡便、快速、省時省力、靈敏度高等特點，對小麥赤霉病的合理用藥、控制病害發(fā)生與流行、減少經(jīng)濟損失具有實用價值。
[0006]田間采集的多菌靈中抗禾谷鐮孢菌菌株的95%以上的突變類型是由于禾谷鐮孢菌的32微管蛋白基因編碼的第167位氨基酸密碼子突變造成的。本發(fā)明所述的快速檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈中等抗性水平菌株的分子生物學方法，步驟是:
[0007](I)在禾谷鐮孢菌的β 2微管蛋白基因上包括167位氨基酸的序列設計I對外引物和I對內(nèi)引物，利用該引物在恒溫條件下，進行LAMP擴增；
[0008]①LAMP反應所用的外引物對:
【權利要求】
1.一種基于LAMP技術快速檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈中等抗性水平菌株的分子生物學方法，步驟是: (1)運用兩對特異性引物對待鑒定真菌的基因組DNA進行LAMP恒溫擴增，其中所述的兩對特異性引物的堿基序列分別是: LAMP反應所用的外引物對:
F3:TTCCAGCTGACGCACTCT
B3:ACAGAAGGTCTCGTCAGAGT LAMP反應所用的內(nèi)引物對(含人為引入錯配堿基):
FIP:TGCGATCGGGGAACTCCTCG_TGGTACCGGTTCCGGTATG
BIP:A ?CCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA (2)對上述LAMP擴增產(chǎn)物觀察其顏色變化，并在3.0 %瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀察擴增結果； (3)鑒定是否為禾谷鐮孢菌抗多菌靈菌株；如果LAMP擴增產(chǎn)物顯示天藍色，這時電泳圖譜應為梯狀條帶，判定為禾谷鐮孢菌抗多菌靈菌株；如果擴增產(chǎn)物為紫色，這時電泳圖譜無條帶擴增，判定為禾谷鐮孢菌敏感菌株。
2.根據(jù)權利要求1所述快速檢測禾谷鐮孢菌抗多菌靈菌株的方法，其特征在于:步驟(I)所述的LAMP反應總體積為10 μ L,反應體系是:及yr DNA 聚合酶(8U/nL) 0.3 μ?IOxThermoPol1.0 pLMgCl2 (25mM)1.6 μ?dNTP (IOmM)1.0 μιFIP (40 μΜ)0.4 μιBIP (40 μΜ)0.4 μ?F3 (ΙΟμΜ)0.2 μΕΒ3 (ΙΟμΜ)0.2 μ?甜菜堿(8 Μ)1.2 uLHNB (2.5 mM)0.6 μ?基因組DNA0.5 μL(IH2O (滅菌蒸館水)2.6 pL。
3.根據(jù)權利要求1所述快速檢測禾谷鐮孢菌抗多菌靈菌株的方法，其特征在于:步驟(I)所述的LAMP反應恒溫擴增條件是:63°C 60min,80°C IOmin0
【文檔編號】C12Q1/04GK103436628SQ201310431741
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權日:2013年9月23日
【發(fā)明者】周明國, 段亞冰, 葛常艷, 張曉柯 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學