一種利用嗜熱芽孢桿菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)的制作方法
【專利摘要】一種利用嗜熱芽孢桿菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)，屬于食品加工技術(shù)、生物制藥技術(shù)和化學(xué)工程【技術(shù)領(lǐng)域】。該組菌種具有產(chǎn)生高活性胞外甲殼素脫乙?；负图讱に亟到饷傅纳飳W(xué)特性并高效降解甲殼素。主要過程：首先將保存的斜面菌種接種到以甲殼素為唯一碳源的雙層平板上，46℃培養(yǎng)24h，然后按一定接種量接入以甲殼素為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行液體種子培養(yǎng)，46℃培養(yǎng)72h，作為生產(chǎn)菌種再按一定比例接入以甲殼素為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中。這種技術(shù)可降解甲殼素生產(chǎn)殼聚糖、不同分子量的殼寡糖、葡萄糖胺(氨基葡萄糖)和乙酰氨基葡萄糖及其他相關(guān)產(chǎn)品，還可生產(chǎn)甲殼素脫乙酰基酶和甲殼素降解酶。
【專利說明】—種利用嗜熱芽抱桿菌(Thermophi I i c Baci I I us)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]—種利用嗜熱芽孢桿菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)，屬于食品加工技術(shù)、生物制藥技術(shù)和化學(xué)工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]浙江省是我國的海洋大省，水產(chǎn)業(yè)在我省的經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位，每年海水養(yǎng)殖的蝦蟹類產(chǎn)量超過6萬噸，遠(yuǎn)洋捕撈的蝦蟹類超過80萬噸。甲殼素是水產(chǎn)加工中產(chǎn)量較大的副產(chǎn)物，每年的產(chǎn)量約5萬噸以上。甲殼素的加工處理帶來的污染十分嚴(yán)重。甲殼素(chitin)廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動物，部分植物，細(xì)菌及真菌等生物中，是僅次于纖維素的第二大類天然高分子化合物，年平均產(chǎn)量達(dá)數(shù)十億噸之多。殼寡糖(Chitosanoligosaccharides)是指由2_10個氨基葡萄糖以β _1，4_糖苷鍵連接而成的低聚氨基葡萄糖，是由甲殼素脫乙?；蠼到饣蚣讱に亟到夂竺撘阴；玫降漠a(chǎn)物，具有提高免疫力、促進(jìn)鈣吸收、增殖腸道有益菌、防治成人疾病、抑制癌細(xì)胞生長、促進(jìn)肝脾抗體形成等生物活性功能。殼寡糖在人體內(nèi)的吸收率近100%，其功效是殼聚糖的數(shù)十倍，有“軟黃金”之稱謂。
[0003]在殼寡糖制備過程中，甲殼素的脫乙?；敖到馐巧a(chǎn)的關(guān)鍵。目前，以甲殼素直接制備殼寡糖主要有二種方法:化學(xué)法及化學(xué)-酶解法。即先通過化學(xué)方法將甲殼素脫乙?；?，再用化學(xué)法或酶法降解得到低分子的殼寡糖。這些方法中均用到無機(jī)強(qiáng)堿或強(qiáng)酸，存在著耗能大、產(chǎn)物純化難、易污染環(huán)境、產(chǎn)品脫乙酰度不均一等缺點(diǎn)。因此得到高活性胞外甲殼素脫乙?；傅奈⑸锸情_發(fā)甲殼素資源一個急待解決的課題。我們從新疆極端氣候地區(qū)土壤中分離得到一組嗜熱芽孢桿菌ctn C8_3_2a、ctn C8_l、ctn C8_l'、ctn xl0、ctnx5-3能產(chǎn)生高活性的胞外甲殼素脫乙?；负图讱に亟到饷福瑫r高效降解甲殼素，嗜熱芽孢桿菌 ctn C8_3_2a、ctn C8_l、ctn C8-1、ctn xl0、ctn x5_3 最適生長溫度 45-46°C，在特制的甲殼素平板上，培養(yǎng)24h后，其透明圈與菌落直徑比高達(dá)5以上。以1.5%甲殼素為主要碳源發(fā)酵72h后，甲殼素全部降解成可溶性的低聚物。其產(chǎn)生的胞外甲殼素脫乙?；负图讱に亟到饷缸钸m反應(yīng)溫度為46°C，發(fā)酵液經(jīng)微孔過濾除去菌體細(xì)胞后，以1%的甲殼素為底物，46 °C反應(yīng)可完全降解甲殼素。
[0004]本發(fā)明的有益效果:傳統(tǒng)的甲殼素降解生產(chǎn)殼聚糖、不同分子量的殼寡糖和葡萄糖胺(氨基葡萄糖)及其他相關(guān)產(chǎn)品的技術(shù)通常都要使用強(qiáng)堿高溫，對環(huán)境污染嚴(yán)重，能耗聞。
[0005]與傳統(tǒng)的甲殼素降解生產(chǎn)相比，本發(fā)明采用新型嗜熱芽孢桿菌ctn C8-3_2a、ctnC8-1、ctn C8-1'、ctn xlO、ctn x5_3高效降解甲殼素進(jìn)行生產(chǎn),生產(chǎn)條件溫和，不污染環(huán)境，符合節(jié)能減排。
[0006]與傳統(tǒng)的甲殼素降解生產(chǎn)相比，本發(fā)明還可生產(chǎn)高活性甲殼素脫乙?；负徒到饷?，提供給其他甲殼素相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)。
[0007]與傳統(tǒng)的甲殼素降解生產(chǎn)相比，酶法降解甲殼素容易控制產(chǎn)品的組分。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]—種利用嗜熱芽孢桿菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)。該技術(shù)所用這組嗜熱芽孢桿菌菌種ctn C8-3-2a、ctn C8_l、ctn C8-1'革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽孢，菌落高凸起，圓形，邊緣完整，表面光滑，乳白色，半透明，柔軟；ctn xlO和ctnx5-3的菌落高凸起，不規(guī)則邊緣葉狀，表面粗糙，不透明，淺棕色；這組嗜熱芽孢桿菌ctnC8-3-2a的最適生長溫度45-46°C，最適生長pH7.2-7.6 ;在以甲殼素為唯一碳源的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，產(chǎn)生顯著的透明圈，具有同時產(chǎn)生高活性甲殼素脫乙酰基酶和降解酶并高效降解甲殼素的生物特性；在以甲殼素為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中(甲殼素含量1.5%)培養(yǎng)60-72h，可高效降解甲殼素；其高活性甲殼素脫乙?；负徒到饷傅淖钸m反應(yīng)溫度是46°C，最適反應(yīng)pH為7.4。
[0009]本發(fā)明一種利用嗜熱芽孢桿菌(ThermophilicBacillus)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)，根據(jù)不同需要進(jìn)行(I)降解甲殼素生產(chǎn)殼聚糖、不同分子量的殼寡糖和葡萄糖胺(氨基葡萄糖)及其他相關(guān)產(chǎn)品；(2)生產(chǎn)高活性甲殼素脫乙?；负图讱に亟到饷?；

【具體實(shí)施方式】
[0010]—種利用嗜熱芽孢桿菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脫乙酰基降解甲殼素的技術(shù)
[0011]1、菌種制備
[0012]I)平板菌種培養(yǎng):將嗜熱芽孢桿菌 C8-3_2a、ctn C8_l、ctn C8_l'、ctn xlO、ctn x5-3分別在以甲殼素為唯一碳源的雙層平板培養(yǎng)基上劃線接種，45-46°C進(jìn)行24小時培養(yǎng)，培養(yǎng)好后置冰箱備用；2)液體菌種培養(yǎng):用接種環(huán)挑取培養(yǎng)好的平板嗜熱芽孢桿菌C8_3_2a、ctnC8_l、ctn C8_l'、ctn xlO、ctn x5_3 菌種接種到 10mL 以甲殼素為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，45-46°C進(jìn)行72小時培養(yǎng),培養(yǎng)好后置冰箱備用；
[0013]3)原料處理:用于配制平板培養(yǎng)基的甲殼素要先磨碎，再過30目篩。用于發(fā)酵生產(chǎn)的甲殼素剪碎成小段或小顆粒。
[0014]2、發(fā)酵生產(chǎn)
[0015]以5%的接種量將培養(yǎng)好的液體菌種接入200mL以甲殼素為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，45-46°C培養(yǎng)，146rpm,60-72小時，甲殼素完全降解后終止發(fā)酵。離心去除菌體后，按不同用途和生產(chǎn)目的處理，備用。
【專利附圖】

【附圖說明】
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[0016]圖1是嗜熱芽孢桿菌ctnC8-3_2a在特制的以甲殼素為唯一碳源的雙層平板上的菌落形態(tài)示意圖。
[0017]圖2是嗜熱芽孢桿菌ctnC8-1在特制的以甲殼素為唯一碳源的雙層平板上的菌落形態(tài)示意圖。
[0018]圖3是嗜熱芽孢桿菌ctnC8-1'在特制的以甲殼素為唯一碳源的雙層平板上的菌落形態(tài)示意圖。
[0019]圖4是嗜熱芽孢桿菌ctn x5-3在特制的以甲殼素為唯一碳源的雙層平板上的菌落形態(tài)示意圖。
[0020]圖5是嗜熱芽孢桿菌ctn xlO在特制的以甲殼素為唯一碳源的雙層平板上的菌落形態(tài)示意圖。
【權(quán)利要求】
1.一種利用嗜熱芽孢桿菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)，其特征是: 1)該技術(shù)使用的是一組嗜熱芽孢桿菌ctnC8_3_2a、ctn C8_l、ctn C8_l'、ctn xlO、ctn x5_3,這組菌種都產(chǎn)芽孢,其中ctn C8_3_2a、ctn C8_l、ctn C8-1'的菌落高凸起，圓形，邊緣完整，表面光滑，乳白色，半透明，柔軟；ctn xlO和ctn x5_3的菌落高凸起，不規(guī)則邊緣葉狀，表面粗糙，不透明，淺棕色；這組菌種的最適生長溫度45-46°C，最適生長PH7.2-7.6，在以甲殼素為唯一碳源的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，降解甲殼素產(chǎn)生顯著的透明圈，其中ctn C8-3-2a、ctn C8_l、ctn C8-1'的透明圈與菌落的直徑比在5以上；這組菌種具有同時產(chǎn)高活性甲殼素脫乙?；负徒到饷傅纳锾匦裕辉谝约讱に貫槲ㄒ惶荚吹囊后w培養(yǎng)基中(甲殼素含量1.5% )培養(yǎng)60-72h，可高效降解甲殼素；其高活性甲殼素脫乙?；负徒到饷傅淖钸m反應(yīng)溫度是46°C，最適反應(yīng)pH為7.4，其遺傳基因可作為構(gòu)建基因工程菌優(yōu)良的基因供體。 2)米用這組嗜熱芽抱桿菌ctn C8_3_2a、ctn C8_l、ctn C8-1'、ctn xl0、ctn x5_3 可降解甲殼素生產(chǎn)殼聚糖、不同分子量的殼寡糖和葡萄糖胺(氨基葡萄糖)及其他相關(guān)產(chǎn)品，還可生產(chǎn)甲殼素脫乙?；负图讱に亟到饷浮?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用嗜熱芽孢桿菌(ThermophilicBacillus)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)，其特征是嗜熱芽孢桿菌ctn C8-3-2a、ctn C8_l、ctn C8_l'、ctnxlO,ctn χ5-3可作為降解甲殼素生產(chǎn)殼聚糖、不同分子量的殼寡糖和葡萄糖胺(氨基葡萄糖)及其他相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)菌種；可作為生產(chǎn)甲殼素脫乙?；负图讱に亟到饷傅纳a(chǎn)菌種:菌種可以單個使用也可以組合使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用嗜熱芽孢桿菌(ThermophilicBacillus)酶高效脫乙酰基降解甲殼素的技術(shù)，其特征是利用嗜熱芽孢桿菌(ThermophilicBacillus)產(chǎn)生的酶進(jìn)行甲殼素降解生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品，其產(chǎn)品殼聚糖、不同分子量的殼寡糖、葡萄糖胺(氨基葡萄糖)和乙酰氨基葡萄糖及其他相關(guān)產(chǎn)品可作為食品、保健品和藥品及其原料，還可作為化工原料和生物質(zhì)材料原料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用嗜熱芽孢桿菌(ThermophilicBacillus)酶高效脫乙?；到饧讱に氐募夹g(shù)，其特征是:一組嗜熱芽孢桿菌ctn C8-3-2a、ctn C8_l、ctnC8-l\ctn xlO,ctn χ5_3可作為構(gòu)建基因工程菌優(yōu)良的基因受體，其遺傳基因可作為構(gòu)建基因工程菌優(yōu)良的基因供體。
【文檔編號】C12P19/26GK104450832SQ201310431678
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】活潑, 林榮業(yè), 李成平, 饒桂維, 梅瑜, 王楠, 金建昌, 嚴(yán)小平, 朱曉娟 申請人:浙江樹人大學(xué)