一種基于自誘導仿生鋯化固定化蛋白酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于自誘導仿生鋯化固定化蛋白酶的方法。利用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶對K2ZrF6鋯前驅體仿生鋯化的誘導效應，在誘導仿生鋯化的過程中實現蛋白酶的固定化，獲得以氧化鋯為載體的固定化蛋白酶。本發(fā)明克服了現有傳統(tǒng)固定化方法存在的固定化過程復雜、酶與載體的生物相容性差、其與載體之間的結合作用相對較弱、固定化酶的穩(wěn)定性差、使用壽命低以及固定化反應條件通常較劇烈而造成酶的失活等缺陷，具有固定化過程簡單、無需額外的誘導劑、條件溫和、效率高、可重復利用等優(yōu)點。
【專利說明】一種基于自誘導仿生鋯化固定化蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化酶制備【技術領域】，特別涉及一種基于自誘導仿生鋯化固定化蛋白酶的方法。
【背景技術】
[0002]蛋白酶具有高選擇性、高催化活性、反應條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點。已在食品、醫(yī)藥、環(huán)境等領域得到廣泛應用。然而在自然狀態(tài)下，大多數酶是水溶性的，使得游離狀態(tài)下的酶在生物催化過程中的應用受到很大的限制，主要表現在游離酶的穩(wěn)定性差、不能循環(huán)使用、生成的產物難于從反應混合物中分離、純化等。進行酶的固定化是解決上述問題的有效方法，所以探索酶的固定化載體和固定化方法，制備高活性、高穩(wěn)定性、高機械強度的固定化酶將有重要的理論和實際意義。
[0003]現有的常用酶固定化方法大致可分為4類:吸附法、交聯法、共價結合法、包埋法。吸附法操作簡便，且對酶構象的破壞小，但是酶與載體的結合力弱，酶固定化后易脫落；交聯法的反應條件較激烈，酶分子中有些基團被交聯，會導致酶活回收率降低較大；共價結合法則要求酶具有特殊的能夠與載體發(fā)生偶聯反應的官能團，但劇烈的化學反應常會造成酶的失活，通常情況下酶活力回收率僅有30%左右；與吸附法、交聯法、共價結合法相比，包埋法用到的載體的制備方法具有所需反應條件溫和、酶分子不易泄漏、對生物活性單元失活作用小及可固定高濃度的生物活性單元等優(yōu)點。酶被包在高聚物的網格中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微囊型兩種，又由于載體可將酶與外界環(huán)境隔開，所以還有助于提高酶的穩(wěn)定性。包埋法所具有得較普遍的適用性，使其近年來得到了廣泛的關注。
[0004]目前固定化酶載體價格昂貴，多數固定化酶的活力熱穩(wěn)定性還不夠高，操作半衰期也不夠長，很難以實現工業(yè)上的連續(xù)化生產。在改進傳統(tǒng)載體材料的同時，研究開發(fā)新型材料成為今后固定化酶載體研究的主要方向。隨著材料仿生學的不斷發(fā)展，固定化酶領域的研究人員將仿生的思想，特別是結構仿生和過程仿生的思想引入到固定化酶載體這種特殊材料的設計和制備中，開發(fā)出了新型的固定化酶載體。
[0005]模擬生物礦化的仿生礦化就是將生物礦化的機理引入無機材料的合成，以有機物組裝體為模板，去控制無機物形成，制備具有特殊組裝方式和多級結構特點的有機無機復合體，使材料具有優(yōu)異的物理化學性能。誘導仿生礦化的基本方法一般是利用誘導劑誘導帶有負電的無機前驅體(如正硅酸乙酯、氟鋯酸鉀、二氫氧化二銨合鈦等)水解并縮聚生成氧化物，同時將酶包埋于氧化物顆粒之中，形成固定化酶，在材料學、工業(yè)生產、化學分析和醫(yī)藥等方面有誘人的應用前景。
[0006]目前利用仿生礦化進行酶固定化的一般方法是利用精蛋白等堿性蛋白作為誘導劑。由于體系中加入了額外的蛋白質誘導劑，該方法只適用于非蛋白質水解酶類的固定化而不宜進行蛋白質水解酶類的固定化。本發(fā)明利用菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對仿生鋯化的誘導作用實現仿生礦化固定化，體系中不需額外加入蛋白誘導劑，克服了上述方法的不足。目前利用自誘導仿生鋯化固定化蛋白酶的方法尚未見報道。
【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)固定化方法的缺陷，提供一種基于自誘導仿生鋯化固定化蛋白酶的方法。
[0008]具體步驟為:
室溫下，在固定化反應器中加入8~12 mL濃度為0.01、.05 mol/L的鋯前驅體溶液，然后加入8~24 mL用pH 6.0~8.0、濃度0.02 mol/L~0.12 mol/L的緩沖液配制的濃度為4 mg/mL~12 mg/mL游離蛋白酶溶液,使錯前驅體溶液與游離蛋白酶溶液的體積比為1: 1~2 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀；沉淀用蒸懼水洗漆3次后,冷凍干燥,得到固定化酶。
[0009]所述游離蛋白酶為菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一種。
[0010]所述鋯前驅體溶液為K2ZrF6溶液。
[0011]所述緩沖液為磷酸鹽(磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合)緩沖液。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于:游離酶的固定化過程簡單，條件溫和，時間縮短，生物相容性好，能耗降低；固定化酶的酶活回收率和包埋率較高；固定化的酶穩(wěn)定性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明實施例1仿生鋯化固定化菠蘿蛋白酶、二氧化鋯標準參照及K2ZrF6的紅外光譜圖。
[0014]圖中:A- 二氧化鋯；B-固定化菠蘿蛋白酶；C_ K2ZrF6。
【具體實施方式】
[0015]下述磷酸鹽緩沖液為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合配制的緩沖液。
[0016]實施例1:
室溫下，在固定化反應器中加入10 mL 0.02 mol/L K2ZrF6溶液，再向固定化反應器中加入20 mL用pH 7.5、濃度為0.10 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的濃度為6 mg/mL菠蘿蛋白酶溶液，使K2ZrF6溶液與菠蘿蛋白酶溶液的體積比為1:2 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀。蒸餾水洗滌沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后將沉淀冷凍干燥24小時，所得的固定化酶酶活回收率為59.52%，菠蘿蛋白酶包埋率為63.03%,同批固定化酶重復使用6次后酶活仍可保持60%以上。
[0017]所獲的固定化菠蘿蛋白酶，樣品研細后，溴化鉀壓片，采用傅立葉紅外光譜儀測定其紅外光譜，如圖1所示。對比固定化菠蘿蛋白酶(圖1-B)與鋯前驅體K2ZrF6 (圖1-C)可知，經菠蘿蛋白酶誘導鋯前驅體K2ZrF6鋯化后，在3360 cm'2977 cm'1667 cm'1557cm'537 cnT1等波數處出現新的譜峰,其中3360 cnT1歸屬于菠蘿蛋白酶分子中的酰胺基中的胺基基團，2977 cnT1歸屬于烷基，1667 cnT1和1557 cnT1是由酰胺基中的羰基伸縮振動引起的，表明菠蘿蛋白酶誘導K2ZrF6鋯化產生的沉淀中確實包埋有菠蘿蛋白酶。對比固定化菠蘿蛋白酶(圖1-B)與二氧化鋯(圖1)可知，在500飛00 cnT1范圍內均有明顯吸收，這是由Zr-O-Zr伸縮振動引起的，表明在菠蘿蛋白酶的誘導下，K2ZrFf-g化確實生成了二氧化鋯。結果表明，菠蘿蛋白酶可作為模板誘導K2ZrF6鋯化生成二氧化鋯且菠蘿蛋白酶分子本身被包埋在沉淀中從而實現固定化。
[0018]實施例2:
室溫下，在固定化反應器中加入10 mL 0.035 mol/L K2ZrF6溶液，再向固定化反應器中加入10 mL用pH 8.0、濃度為0.08 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的濃度為8 mg/mL胰蛋白酶溶液，使K2ZrF6溶液與胰蛋白酶溶液的體積比為1:1 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀；蒸餾水洗滌沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后將沉淀冷凍干燥24小時，所得的固定化酶酶活回收率為46.69%，胰蛋白酶包埋率為63.03%,同批固定化酶重復使用5次后酶活仍可保持60%以上。[0019]實施例3:
室溫下，在固定化反應器中加入10 mL 0.02 mol/L K2ZrF6溶液，再向固定化反應器中加入20 mL用pH 6.5、濃度為0.08 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的濃度為8 mg/mL木瓜蛋白酶溶液，使K2ZrF6溶液與木瓜蛋白酶溶液的體積比為1:2 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀；蒸餾水洗滌沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后將沉淀冷凍干燥24小時，所得的固定化酶酶活回收率為54.45%，木瓜蛋白酶包埋率為89.15%，同批固定化酶重復使用6次后酶活仍可保持60%以上。
【權利要求】
1.一種基于自誘導仿生鋯化固定化蛋白酶的方法，其特征在于具體步驟為: 室溫下，在固定化反應器中加入8-12 mL濃度為0.01、.05 mo I/L的鋯前驅體溶液，然后加入8-24 mL用pH 6.0-8.0、濃度0.02 mol/L-0.12 mol/L的緩沖液配制的濃度為4 mg/mL-12 mg/mL游離蛋白酶溶液,使錯前驅體溶液與游離蛋白酶溶液的體積比為1: 1-2 ;輕輕攪拌5 min, 5000 rpm冷凍離心10 min,收集沉淀；沉淀用蒸懼水洗漆3次后,冷凍干燥,得到固定化酶； 所述游離蛋白酶為菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一種； 所述鋯前驅體溶液為K2ZrF6溶液； 所述緩沖液為磷酸鹽 緩沖液，為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合制成。
【文檔編號】C12N11/14GK103451176SQ201310427882
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月21日 優(yōu)先權日:2013年9月21日
【發(fā)明者】李海云, 余艷葵, 阮貴華, 李子院 申請人:桂林理工大學