包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠及制備方法。該包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠，粒徑為3-4mm，在明膠核上包覆有氧化硅膜層。其制備方法過程包括：配制明膠及含有醇脫氫酶混合溶液；配制硅酸鈉及戊二醛溶液前驅(qū)體混合溶液；將明膠及醇脫氫酶酶的混合溶液逐滴加入到0～4℃的去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，再經(jīng)攪拌孵化得到包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠。本發(fā)明的優(yōu)點在于：制備條件溫和，制備工藝簡單易行，所得包埋醇脫氫酶的雜化明膠-氧化硅凝膠具有固定能力強，與明膠凝膠相比固定化醇脫氫酶酶的泄漏率低，與明膠凝膠相比本發(fā)明溶脹度低，重復(fù)使用穩(wěn)定性好。
【專利說明】包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠及制備方法，屬于酶的固定化技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]明膠凝膠是一種常用的固定化酶載體。目前，明膠凝膠固定化酶主要采用包埋法。包埋法條件溫和，生物相容性好，有利于維持酶的結(jié)構(gòu)完整性，進而提高酶的活性維持率，而且載體孔徑較大，有利于反應(yīng)物和產(chǎn)物傳遞。
[0003]明膠凝膠固定化酶通常存在的問題是載體的孔徑較大，酶分子容易泄漏。凝膠易溶脹，機械強度差，循環(huán)使用穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性不高。解決問題的方法通常是利用雙功能基團交聯(lián)劑如戊二醛等進行交聯(lián)，使凝膠載體更加致密，或是在凝膠外表面構(gòu)造無機殼層，制備有機一無機雜化凝膠。
[0004]氧化硅是有機一無機雜化材料中常見的無機組分，用于制備雜化載體可以提高凝膠的機械性能，同時抑制酶分子的泄露，提高酶對溫度、PH變化的耐受性，同時提高儲存和循環(huán)使用穩(wěn)定性。仿生硅化為二氧化硅材料的制備提供了一條新途徑，仿生硅化過程避免了酸堿催化劑的使用，制備簡單，所用原料均具有很好的生物相容性，適用范圍廣。
[0005]利用明膠仿生硅化過程制備包埋醇脫氫酶的明膠一氧化硅雜化載體用于固定化酶具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠及制備和方法。以該方法所制得的包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠尺寸均一，方法簡單，包埋醇脫氫酶的泄漏率低，載體溶脹度低，重復(fù)使用性好。
[0007]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方加以實現(xiàn)的，一種包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠，其特征在于，該包埋醇脫氫酶的雜化凝膠為粒徑3-4_，其中在明膠核上包覆有厚度為10-20 μ m的氧化硅膜層，其中一毫升雜化凝膠包埋醇脫氫酶含量為I~4mg。
[0008]上述結(jié)構(gòu)的包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠制備方法，其特征在于包括以下過程:
(1)配制質(zhì)量濃度為15~25%的明膠溶液，向該明膠溶液中加入醇脫氫酶配制成含有醇脫氫酶濃度為I~4mg/mL的混合溶液；
(2)配制濃度40~80mM的硅酸鈉前驅(qū)體溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)硅酸鈉溶液的pH值為6.5~8，按硅酸鈉溶液與質(zhì)量分數(shù)50%戊二醛溶液二者的體積比為1:0.1~0.25，將戊二醛溶液加入硅酸鈉溶液，得到前驅(qū)體混合溶液；
(3)用注射器將步驟(1)的混合溶液逐滴加入到O~4°C的去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，過濾后，用去離子水洗滌，將明膠顆粒浸入步驟(2)制備好的前驅(qū)體混合溶液中，攪拌孵化25~35分鐘后得到包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅凝膠。[0009]本發(fā)明的優(yōu)點在于:制備條件溫和，制備工藝簡單易行，所得包埋醇脫氫酶的雜化明膠-氧化硅凝膠具有固定能力強，與明膠凝膠相比固定化醇脫氫酶酶的泄漏率低，本發(fā)明泄漏率為5%，明膠凝膠泄漏率為83.6%，與明膠凝膠相比本發(fā)明溶脹度低，溶脹度為
7.9%，明膠凝膠的溶脹度為120%，重復(fù)使用穩(wěn)定性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明實施例一制備的包埋醇脫氫酶明膠一氧化硅雜化凝膠顆粒表面掃描電鏡(SEM)照片。
[0011]圖2為本發(fā)明實施例二制備的包埋醇脫氫酶明膠一氧化硅雜化凝膠顆粒斷面掃描電鏡(SEM)照片。
[0012]圖3為本發(fā)明實施例四制備的包埋醇脫氫酶明膠一氧化硅雜化凝膠與明膠凝膠的泄漏率變化圖。
[0013]圖4為采用本發(fā)明實施例五制備的包埋醇脫氫酶明膠一氧化硅雜化凝膠與明膠凝膠的溶脹度變化圖。
[0014]圖5為采用本發(fā)明實施例四制備的包埋醇脫氫酶明膠一氧化硅雜化凝膠固定的醇脫氫酶的循環(huán)使用活力的變化圖。
【具體實施方式】
[0015]實施例一
將706mg明膠溶于4mL的去離子水中，配制成質(zhì)量分數(shù)為15%的明膠溶液，向上述明膠溶液中加入4mg醇脫氫酶,攪拌,混合均勻，配制20 mL濃度為40mM的娃酸鈉前驅(qū)體溶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)硅酸鈉溶液的P`H值為6.5，取質(zhì)量分數(shù)50%戊二醛溶液40 μ L加入硅酸鈉溶液，得到前驅(qū)體混合溶液，然后用注射器將明膠與醇脫氫酶的混合溶液逐滴滴加到0°C去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，過濾后，用去離子水洗滌三次后，將包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒加入配制得硅酸鈉前驅(qū)體混合溶液，孵化25分鐘，制得包埋醇脫氫酶明膠-氧化硅雜化凝膠。
[0016]對上述過程制得的明膠-氧化硅雜化凝膠進行循環(huán)使用穩(wěn)定性的測定:
將甲醛和還原型輔酶I 二鈉加到0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，
配成甲醛濃度為IOmM，還原型輔酶I 二鈉濃度為133 μ M，加入制備的固定化醇脫氫酶的雜化凝膠顆粒，在25°C，攪拌的條件下進行甲醛的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，用紫外分光光度計測定還原型輔酶I 二鈉的轉(zhuǎn)化量，得到固定化醇脫氫酶的酶活力，并以此酶活力為初始酶活力，定義為100%。
[0017]將反應(yīng)液過濾，用去離子水清洗顆粒至上清液中無甲醛和原型輔酶I 二鈉。重復(fù)上述反應(yīng)過程，得到第二次重復(fù)使用的固定化醇脫氫酶的酶活力，與初始活力相比，此時的相對酶活力為90.3%。
[0018]重復(fù)分離和反應(yīng)過程，得到第三次重復(fù)使用的固定化醇脫氫酶的相對酶活力為84% ;第四次重復(fù)使用的固定化醇脫氫酶的相對酶活力為75.7% ;第五次重復(fù)使用的固定化醇脫氫酶的相對酶活力為66.5% ;第六次重復(fù)使用的固定化醇脫氫酶的相對酶活力為59.5%。[0019]實施例二
將Ig明膠溶于3mL的去離子水中，配制成質(zhì)量分數(shù)為25%的明膠溶液，向上述明膠溶液中加入12mg醇脫氫酶，攪拌，混合均勻，配制20 mL濃度為80mM的硅酸鈉前驅(qū)體溶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)硅酸鈉溶液的PH值為8，取質(zhì)量分數(shù)50%戊二醛溶液100 μ L戊二醛加入硅酸鈉溶液，得到前驅(qū)體混合溶液，然后用注射器將明膠與醇脫氫酶的混合溶液逐滴滴加到4°C去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，過濾后，用去離子水洗滌三次后，將包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒加入配制得硅酸鈉前驅(qū)體混合溶液，孵化35分鐘，制得包埋醇脫氫酶明膠-氧化硅雜化凝膠。
[0020]實施例三
將Ig明膠溶于3mL的去離子水中，配制成質(zhì)量分數(shù)為25%的明膠溶液，向上述明膠溶液中加入12mg醇脫氫酶，使其濃度為4mg/mL,攪拌,混合均勻，配制20 mL濃度為50mM的硅酸鈉前驅(qū)體溶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)硅酸鈉溶液的pH值為7.0，取質(zhì)量分數(shù)50%戊二醛溶液使40 μ L戊二醛加入硅酸鈉溶液，得到前驅(qū)體混合溶液，然后用注射器將明膠與醇脫氫酶的混合溶液逐滴滴加到4 °C去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，過濾后，用去離子水洗滌三次后，將包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒加入配制得硅酸鈉前驅(qū)體混合溶液，孵化30分鐘，制得了包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠，將包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠浸泡于PH為7三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，在前三個小時內(nèi)測得溶液中無醇脫氫酶的泄漏，泄漏率為O,十個小時后泄漏率為5%。
[0021]實施例四
將706mg明膠溶于4mL的去離子水中，配制成質(zhì)量分數(shù)為15%的明膠溶液，向上述明膠溶液中加入4mg醇脫氫酶, 使其濃度為lmg/mL,攪拌,混合均勻，配制20 mL濃度為50mM的硅酸鈉前驅(qū)體溶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)硅酸鈉溶液的pH值為7.0，取質(zhì)量分數(shù)50%戊二醛溶液40 μ L戊二醛加入硅酸鈉溶液，得到前驅(qū)體混合溶液，然后用注射器將明膠與醇脫氫酶的混合溶液逐滴滴加到O °C去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，過濾后，用去離子水洗滌三次后，將包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒加入配制得硅酸鈉前驅(qū)體混合溶液，孵化30分鐘，制得了包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠，將該雜化凝膠浸泡于PH為7三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的緩沖溶液中，室溫下存放30個小時，稱量雜化凝膠顆粒質(zhì)量變化，計算出溶脹度為7.9%。
[0022]對比例一
將Ig明膠溶于3mL的去離子水中，配制成質(zhì)量分數(shù)為25%的明膠溶液，向上述明膠溶液中加入12mg醇脫氫酶，使其濃度為4mg/mL,攪拌,混合均勻,然后注射器將明膠與醇脫氫酶混合溶液逐滴滴加到4 °C去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，過濾，用去離子水洗滌三次后，將包埋醇脫氫酶的凝膠顆粒浸泡于PH為7三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中5h，測定溶液中醇脫氫酶含量，得到明膠凝膠存放過程中醇脫氫酶的泄漏率為83.6%
對比例二
將706mg明膠溶于4mL的去離子水中，配制成質(zhì)量分數(shù)為15%的明膠溶液，向上述明膠溶液中加入4mg醇脫氫酶,使其濃度為lmg/mL,攪拌,混合均勻，然后注射器將明膠與醇脫氫酶混合溶液逐滴滴加到O °C去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，過濾，用去離子水洗滌三次后，將包埋醇脫氫酶的凝膠顆粒浸泡于PH為7三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液，室溫下存放30個小時，稱量明膠凝膠顆粒質(zhì)量變化，計算出溶脹度為120%。
【權(quán)利要求】
1.一種包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠，其特征在于，該包埋醇脫氫酶的雜化凝膠為粒徑3-4mm，其中在明膠核上包覆有厚度為10-20 μ m的氧化硅膜層，其中一毫升雜化凝膠包埋醇脫氫酶含量為I~4mg。
2.一種按權(quán)利要求1所述的包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠制備方法，其特征在于包括以下過程: (1)配制質(zhì)量濃度為15~25%的明膠溶液，向該明膠溶液中加入醇脫氫酶配制成含有醇脫氫酶濃度為I~4mg/mL的混合溶液； (2)配制濃度40~80mM的硅酸鈉前驅(qū)體溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)硅酸鈉溶液的pH值為6.5~.8，按硅酸鈉溶液與質(zhì)量分數(shù)50%戊二醛溶液二者的體積比為1:0.1~0.25，將戊二醛溶液加入硅酸鈉溶液，得到前驅(qū)體混合溶液； (3)用注射器將步驟(I)的混合溶液逐滴加入到O~4°C的去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，過濾后，用去離子水洗滌，將明膠顆粒浸入步驟(2)制備好的前驅(qū)體混合溶液中，攪拌孵化25~35分鐘.后得到包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠。
【文檔編號】C12N11/14GK103468669SQ201310425486
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】吳洪, 宋曉凱, 姜忠義, 王曉莉 申請人:天津大學(xué)