水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒及其檢測方法，專用于水仙遲季黃化病毒的檢測。該試劑盒包括：外側上游引物、外側下游引物、內側上游引物、內側下游引物、RTBuffer、RNA酶抑制因子、反轉錄酶、dNTPs、PCR?Buffer、Mgcl2、Taq?DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和RNase-free?ddH2O。本發(fā)明根據(jù)水仙遲季黃化病毒基因序列設計特異性引物，利用巢式RT-PCR技術對水仙遲季黃化病毒進行檢測。首先以提取的RNA為模板反轉錄合成cDNA，利用cDNA為模板進行第一輪PCR擴增，再以第一輪PCR產物為模板進行第二輪PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)大小為539bp的特異性目的片段，則判定檢測的病毒為水仙遲季黃化病毒。本發(fā)明具有特異性強、靈敏度高、準確性好、檢測時間短的顯著優(yōu)點，適用于進出境口岸及農業(yè)生產上水仙遲季黃化病毒的快速檢測和監(jiān)測。
【專利說明】水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒及其檢測方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒及其檢測方法，屬于植物檢疫【技術領域】，適用于進出境及農業(yè)生產上水仙遲季黃化病毒的快速檢測和監(jiān)測。
【背景技術】
[0002] 水仙遲季黃化病毒(Narcissuslate season yellows virus, NLSYV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員，該病毒具有和其它馬鈴薯Y病毒相似的特性，在受感染的水仙細胞內會出現(xiàn)典型的風輪狀內含體。病毒基因組為正義單鏈RNA，全長約9，651bp。水仙遲季黃化病毒(NLSYV)最早在1980年被報道，此后人們對其病毒粒體結構、寄主范圍、危害癥狀、傳播方式和血清學特性等進行了相關的研究。NLSYV粒體形態(tài)為線條狀，大小約750nmX 12nm。NLSYV自然寄主較窄，已報道的主要局限于水仙的一些品種。NLSYV侵染水仙后可引起葉片、花莖上出現(xiàn)窄長的褪綠條紋或橢圓狀斑塊等癥狀，水仙病株一般不出現(xiàn)畸形、矮化癥狀。癥狀大約在花期之后的2-3周出現(xiàn)，隨后植株逐漸衰老枯萎，但這種發(fā)病癥狀不一定每年都出現(xiàn)。NLSYV可以通過有翅桃蚜(Myzuspersicae)介體在水仙植株間傳播。NLSYV在血清學關系上與馬鈴薯Y病毒(Potato virusY, PVY)、完菁花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)和六出花花葉病毒(Alstroemeriamosaic virus, AIMV)具有血清學相關性,但與另一同為馬鈴薯Y病毒屬病毒的水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus, NDV)沒有血清學關系。據(jù)報道,NLSYV還能夠與其他植物病毒復合侵染水仙，例如虎眼萬年青花葉病毒(Ornithogalum mosaic virus, OrMV)>水仙無癥狀病毒(Narcissus symptomless virus, NSV)0 NLSYV侵染水仙后,能夠影響水仙商品的品質，造成水仙商品價值不同程度降低。
[0003]目前，NLSYV主要分布在英國、荷蘭、德國、意大利、以色列、澳大利亞等國家水仙栽培區(qū)。由于該病毒可隨帶病植株及其產品進行遠距離傳播，因而加強該病毒的檢測，對預防該病毒的發(fā)生和擴散十分重要。由于NLSYV自然寄主較窄，且常潛伏侵染，利用常規(guī)的生物學檢測方法進行鑒定，迄今尚未發(fā)現(xiàn)有效的鑒別寄主。電子顯微鏡觀察病毒粒體具有直接、準確的優(yōu)點，但需要昂貴的儀器設備和專門的技術人員，在口岸應用上有較大的局限性。ELISA檢測具有特異性強、靈敏度高、操作簡單的優(yōu)點，是目前應用廣泛的一種血清學檢測技術，該方法不足之處是需要有特異性強、穩(wěn)定性好的病毒抗體。近年來，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，越來越多的分子生物學技術被應用于植物病毒的診斷鑒定?；诤怂崴降姆肿由飳W檢測方法與傳統(tǒng)植物病毒檢測方法相比，具有檢測時間短、靈敏度高和特異性強的突出優(yōu)點。但到目前為止，關于水仙遲季黃化病毒(NLSYV)分子生物學檢測方法的報道甚少，至今尚未見專門應用于該病毒快速檢測的巢式RT-PCR技術及分子檢測試劑盒。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒及其檢測方法，克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷和不足，能夠對進出境及農業(yè)生產上水仙遲季黃化病毒進行快速、準確的檢疫鑒定。
[0005]本發(fā)明技術方案如下:
[0006](一)一種用于水仙遲季黃化病毒檢測的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:
[0007]I)外側上游引物:10 μ mol/L，引物序列為 5’ -CCACTTGAAGTCTATCACCA-3’ ；
[0008]2)外側下游引物:10 μ mol/L，引物序列為 5’ -CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3’ ；
[0009]3)內側上游引物:10 μ mo I/L，引物序列為 5’ -ATCACATACACACCACGACA-3 ’ ；
[0010]4)內側下游引物:10 μ mol/L，引物序列為 5’ -GTGTGTCTCTCCGTGTTCTC-3’ ；
[0011]5) RTBuffer:5X ；
[0012]6)1?應酶抑制因子:4(^/^1^;
[0013]7)反轉錄酶:200U/yL;
[0014]8) dNTPs: 10mmol /I,；
[0015]9) PCR Buffer:10 X ;
[0016]10) Mgcl2:25mmol/L ；
[0017]11) Taq DNA 聚合酶:5U/ μ L ;
[0018]12)水仙遲季黃化病毒的陽性對照樣品；
[0019]13)不含水仙遲季黃化病毒的陰性對照樣品；
[0020]14) RNase-free ddH20。
[0021](二)上述水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0022]I)反轉錄反應:在PCR管中加入待測樣品總RNA 2 μ L、濃度為10 μ mol/L的外側下游引物I μ L和RNase-free ddH20 5 μ L, 70°C水浴lOmin,迅速冰浴5min,再加入下列試劑:5XRT Buffer 2.5 μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs I μ L、濃度為 200U/μ L 反轉錄酶0.5 μ L、濃度為40U/μ LRNA酶抑制因子0.5μ L。42°C水浴60min，70°C水浴IOmin后自然冷卻至室溫，合成cDNA ；
[0023]2)第一輪PCR反應:取步驟I)合成的cDNA 3 μ L，按每管加濃度為5U/μ L Taq DNA聚合酶 0.5 μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs 0.5 μ L、10 X PCR Buffer 2.5 μ L、濃度為 25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L外側上游引物I μ L、濃度為10 μ mol/L外側下游引物I μ L、RNase-free ddH20 14.5 μ L，使反應總體積為25 μ L ;混合后的反應液，94°C預變性3min,然后94°C變性30s、56°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應結束；
[0024]3)第二輪PCR反應:取第一輪PCR反應產物0.1 μ L，按每管加濃度為5U/μ LTaq DNA 聚合酶 0.5 μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs 0.5 μ L、10 X PCR Buffer 2.5yL、濃度為25mmol/L MgCl22y L、濃度為10 μ mol/L內側上游引物I μ L、濃度為10 μ mol/L內側下游引物I μ L、RNase-freeddH20 17.4 μ L，使反應總體積為25 μ L ;混合后的反應液，94°C預變性3min,然后94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應結束；
[0025]4) PCR擴增產物電泳檢測:第二輪PCR反應結束后，取產物10 μ L用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結果；含有水仙遲季黃化病毒樣品的電泳檢測結果為在539bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶。[0026]本發(fā)明根據(jù)水仙遲季黃化病毒基因序列設計特異性引物，以提取的RNA為模板反轉錄合成cDNA，利用cDNA為模板進行第一輪PCR擴增，再以第一輪PCR產物作為模板進行第二輪PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較之現(xiàn)有技術而言，本發(fā)明所提供的水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒及其檢測方法有益效果在于:1)特異性強:通過使用外側、內側2套引物進行巢式PCR，大大提高了擴增的特異性。由于第2套引物(內側引物)的擴增片段位于第I套引物(外側引物)的擴增片段內部，非目的片段同時包含這兩套引物結合位點的可能性極小，因此有效避免了非特異性擴增的發(fā)生。本發(fā)明能夠從感染水仙遲季黃化病毒的樣品上擴增到大小為539bp的特異性目的片段，而從其他病毒樣品及健康樣品上均未擴增到大小為539bp的特異性目的片段，結果證實本發(fā)明具有很強的特異性。2)靈敏度高:本發(fā)明經過2輪PCR反應，使檢測靈敏度呈數(shù)量級增長，從而實現(xiàn)對微量模板樣品的檢測。與普通RT-PCR相比，本發(fā)明檢測水仙遲季黃化病毒的靈敏度是其IO2倍，這對于攜帶水仙遲季黃化病毒含量少或不表現(xiàn)癥樣品的檢測具有重要應用價值。3)操作簡便、檢測時間短:本發(fā)明提供的檢測方法操作簡便、檢測時間短，能夠克服傳統(tǒng)生物學測定、電鏡觀察和血清學檢測方法存在效率低的不足，實現(xiàn)對水仙遲季黃化病毒的快速、準確和高效檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為實施例2的水仙遲季黃化病毒檢測結果。其中M =DNA分子量標準(IOObp);
1:陽性對照；2-5:攜帶有水仙遲季黃化病毒的樣品；6:陰性對照；7:空白對照。
[0028]圖2為實施例3的特異性測定結果。其中M =DNA分子量標準(IOObp) ；1:水仙遲季黃化病毒(NLSYV)樣品；2:水仙花葉病毒(NMV)樣品；3:水仙黃條病毒(NYSV)樣品；4:水仙退化病毒(NDV)樣品；5:水仙潛隱病毒(NLV)樣品；6:南芥菜花葉病毒(ArMV)樣品；7:陰性對照。
[0029]圖3-4為實施例4的`靈敏度測定結果(圖3為第一輪PCR測定結果，圖4為第二輪PCR測定結果)。其中M:DNA分子量標準(IOObp);1:RNA原液；2 =KT1稀釋；3:10_2稀釋；4:10_3 稀釋；5:10_4 稀釋；6:10_5 稀釋；7:10-6 稀釋；8:10_7 稀釋；9:10_8 稀釋；10:10_9 稀釋；
I1:陰性對照；12:空白對照。
【具體實施方式】
[0030]以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0031]實施例1:水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒的配置(10次檢測量)
[0032]I)外側上游引物:10 μ mol/L, I 管(30yL);
[0033]2)外側下游引物:10 μ mol/L, I 管(30yL)；
[0034]3)內側上游引物:10 μ mol/L, I 管(30yL)；
[0035]4)內側下游引物:10 μ mol/L, I 管(30yL)；
[0036]5)RT Buffer:5X，1 管(30yL);
[0037]6) RNA 酶抑制因子:40U/μ L，I 管(5 μ L)；
[0038]7)反轉錄酶:200υ/μ L，1 管(5μ L);
[0039]8) dNTPs:10mmol/L，I 管(30μ L);
[0040]9)PCR Buffer:10Χ，1 管(60yL);[0041]10) Mgcl2:25mmol/L，I 管(50μ L);
[0042]11) Taq DNA 聚合酶:5U/y L, I 管(IOyL);
[0043]12)水仙遲季黃化病毒的陽性對照樣品，I管(50μ L)；
[0044]13)不含水仙遲季黃化病毒的陰性對照樣品，I管(50μ L);
[0045]14) RNase-free ddH20,1 管(lmL)。
[0046]實施例2:水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒的檢測方法
[0047]上述水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
[0048]I)反轉錄反應:在PCR管中加入待測樣品總RNA 2 μ L、濃度為10 μ mol/L的外側下游引物I μ L和RNase-free ddH20 5 μ L, 70°C水浴IOmin,迅速冰浴5min,再加入下列試劑:5 X RTBuffer 2.5 μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs I μ L、濃度為 200U/μ L 反轉錄酶
0.5 μ L、濃度為40U/ μ LRNA酶抑制因子0.5 μ L。42°C水浴60min，70°C水浴IOmin后自然冷卻至室溫，合成cDNA;
[0049]2)第一輪PCR反應:取步驟I)合成的cDNA 3 μ L，按每管加濃度為5U/μ L Taq DNA聚合酶 0.5 μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs 0.5 μ L、10 X PCR Buffer 2.5 μ L、濃度為 25mmol/LMgCl22yL、濃度為10 μ mol/L外側上游引物I μ L、濃度為10 μ mol/L外側下游引物I μ L、RNase-free ddH20 14.5 μ L，使反應總體積為25 μ L ;混合后的反應液，94°C預變性3min,然后94°C變性30s、56°C退 火45s、72°C延伸lmin，如此共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應結束；
[0050]3)第二輪PCR反應:取第一輪PCR反應產物0.1 μ L，按每管加濃度為5U/μ LTaq DNA 聚合酶 0.5 μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs 0.5 μ L、10 X PCR Buffer 2.5yL、濃度為25mmol/L MgCl22y L、濃度為10ymol/L內側上游引物I μ L、濃度為10ymol/L內側下游引物I μ L,RNase-free ddH20 17.4 μ L，使反應總體積為25 μ L ;混合后的反應液，94°C預變性3min,然后94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應結束；
[0051]4) PCR擴增產物電泳檢測:第二輪PCR反應結束后，取產物10 μ L用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結果；含有水仙遲季黃化病毒樣品的電泳檢測結果為在539bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶(圖1)，否則無。
[0052]實施例3:水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒的特異性測定
[0053]I)水仙樣品總RNA的提取:分別以攜帶有水仙遲季黃化病毒(NLSYV)、水仙花葉病毒(Narcissus mosaic virus, NMV)、7jC仙黃條病毒(Narcissus yellow stripe virus,NYSV)、水仙退化病毒(NDV)、水仙潛隱病毒(Narcissus latent virus, NLV)、南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)的水仙樣品為材料，各取0.1g置于研缽中，加入ImLPBST緩沖液研磨，4°C，1000Og離心5min，取上清并將上清液迅速轉移至滅菌的1.5mL離心管中，加入ImL TrizoL試劑，劇烈振蕩后，室溫靜置5min ;4°C，12000g離心lOmin，取上清；加入氯仿300 μ L，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min，4°C，12000g離心15min，取上層水相；加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜置15min，4°C，12000g離心lOmin，棄上清；加入lmL75%的乙醇洗滌沉淀2次，每次4°C，7500g離心3min，棄上清；RNA沉淀干燥后，用20 μ LRNase-free ddH20 溶解；
[0054]2)反轉錄反應:在PCR管中加入待測樣品總RNA 2 μ L、濃度為10 μ mol/L的外側下游引物1 U L和RNase-free ddH20 5 ii L, 70°C水浴lOmin,迅速冰浴5min,再加入下 列試劑：5XRTBuffer 2. 5 y L、濃度為 10mmol/L dNTPs 1 U L、濃度為 200U/y L 反轉錄酶 0. L、濃度為40U/ii LRNA酶抑制因子0. L。42°C水浴60min，70°C水浴lOmin后自然 冷卻至室溫，合成cDNA;
[0055]3)第一輪PCR反應：取步驟2)合成的cDNA 3 ii L，按每管加濃度為5U/ii L Taq DNA 聚合酶 0. L、濃度為 lOmmol/L dNTPs 0. 5u LU0XPCR Buffer 2. 5 y L、濃度為 25mmol/ L MgCl22 u L、濃度為10 u mol/L外側上游引物1 u L、濃度為10 u mol/L外側下游引物1 u L、 RNase-free ddH20 14. 5 u L,使反應總體積為25 u L ;混合后的反應液，94°C預變性3min, 然后94°C變性30s、56°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后 72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應結束；
[0056]4)第二輪PCR反應：取第一輪PCR反應產物0. liiL，按每管加濃度為5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. L、濃度為 lOmmol/L dNTPs 0. 5u LU0XPCR Buffer 2.5yL、濃度為 25mmol/L MgCl22 y L、濃度為10 u mol/L內側上游引物1 U L、濃度為10 u mol/L內側下游引 物1 u L,RNase-free ddH20 17. 4uL,使反應總體積為25 u L ;混合后的反應液，94°C預變性 3min,然后94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結 束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應結束；
[0057]5) PCR擴增產物電泳檢測：第二輪PCR反應結束后，取產物10 ii L用1. 5%瓊脂糖 凝膠電泳進行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結果（圖2)。從圖2 可見，僅水仙遲季黃化病毒樣品在539bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶，其他病毒樣品和健康水仙 樣品均無，說明本發(fā)明試劑盒特異性強。
[0058]實施例4 :水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒的靈敏度測定
[0059]將水仙遲季黃化病毒（NLSYV)樣品的RNA 稀釋成 10—1,10_2,10_3,10_4,10_5,10_6, 10_7，10_8和10_9倍，分別作為模板，按實施例2方法進行檢測，試驗同時設置陰性對照和空 白對照。從圖3和圖4可見，經第二輪PCR，可將靈敏度提高102倍，即巢式RT-PCR可以檢 測稀釋到10_6倍的NLSYV樣品RNA，表明本發(fā)明試劑盒具有很高的靈敏度。
[0060]實施例5 :進境水仙、中國水仙上水仙遲季黃化病毒的檢測
[0061]選取我國口岸截獲的進境水仙樣品8份、中國水仙72份，共80份樣品。提取所有 樣品總RNA后按實施例2方法進行檢測，同時還采用IndirectELISA方法對所有樣品進行 檢測。結果采用本發(fā)明能夠從80份水仙樣品中檢測出水仙遲季黃化病毒22份，檢出率為 27. 5%，而IndirectELISA僅檢出15份，檢測率比本發(fā)明低8. 75%。
【權利要求】
1.一種水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:1)外側上游引物:10 μ mol/L，引物序列為5’ -CCACTTGAAGTCTATCACCA-3’ ；2)外側下游引物:，10μ mo 1/L，引物序列為 5’ -CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3’ ；3)內側上游引物:10 μ mol/L，引物序列為5 ’ -ATCACATACACACCACGACA-3 ’； 4 )內側下游引物:IO μ mo I /L，引物序列為5’ -GTGTGTCTCTCCGTGTTCTC-3’ ；5) RT Buffer:5X ；6) RNA 酶抑制因子:40U/ μ L ；7)反轉錄酶:200υ/μ L ；8) dNTPs:10mmol/L ；9)PCR Buffer:10X ; 10) Mgcl2:25mmol/L ; 11) TaqDNA聚合酶:5U/y L ;12)水仙遲季黃化病毒的陽性對照樣品；13)不含水仙遲季黃化病毒的陰性對照樣品；14) RNase-freeddH2Oo
2.利用權利要求1所述的水仙遲季黃化病毒檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: O反轉錄反應:在PCR管中加入待測樣品總RNA 2 μ L、濃度為10 μ mol/L的外側下游引物I μ L和RNase-free ddH20 5 μ L, 70。。水浴IOmin,迅速冰浴5min,再加入下列試劑:，5 X RTBuffer 2.5 μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs I μ L、濃度為 200U/μ L 反轉錄酶 0.5 μ L、濃度為40U/y LRNA酶抑制因子0.5μ L。42°C水浴60min，70°C水浴IOmin后自然冷卻至室溫，合成cDNA ； 2)第一輪PCR反應:取步驟I)合成的cDNA3 μ L，按每管加濃度為5U/μ L Taq DNA聚合酶 0.5μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs 0.5 μ L、10 X PCR Buffer 2.5 μ L、濃度為 25mmol/LMgCl22yL、濃度為10 μ mol/L外側上游引物I μ L、濃度為10 μ mol/L外側下游引物I μ L、RNase-free ddH2014.5 μ L，使反應總體積為25 μ L ;混合后的反應液，94°C預變性3min，然后94°C變性30s、56°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應 結束； 3)第二輪PCR反應:取第一 輪PCR反應產物0.1 μ L，按每管加濃度為5U/ μ L Taq DNA聚合酶 0.5 μ L、濃度為 10mmol/L dNTPs 0.5 μ L、10 X PCR Buffer 2.5yL、濃度為 25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L內側上游引物I μ L、濃度為10 μ mol/L內側下游引物I μ L、RNase-free ddH20 17.4 μ L，使反應總體積為25 μ L ;混合后的反應液，94°C預變性3min,然后94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應結束； 4)PCR擴增產物電泳檢測:第二輪PCR反應結束后，取產物10 μ L用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結果；含有水仙遲季黃化病毒樣品的電泳檢測結果為在539bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶。
【文檔編號】C12Q1/70GK103484567SQ201310416761
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權日:2013年9月13日
【發(fā)明者】沈建國, 于文濤, 黃振, 廖富榮, 蔡偉, 林雙慶 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心