一種用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法，將EGF—TCSKDEL基因亞克隆至Bac-to-Bac系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTb的多克隆位點中，轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DH10BmBac細胞內(nèi)，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆，隨后從陽性克隆中抽提質(zhì)粒DNA，用抽提的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，獲得含有EGF—TCSKDEL基因的重組桿狀病毒，用收集到的重組桿狀病毒大量感染BmN細胞，獲得大量表達EGF—TCSKDEL融合蛋白；本發(fā)明具有較高的表達量和生物活性，為創(chuàng)造新的高活性、高抑瘤率、低免疫原性、小分子量的靶向性抗腫瘤藥物奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種用家奮桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種表達EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法，尤其涉及一種用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法。
【背景技術(shù)】[0002]目前，應(yīng)用于臨床腫瘤治療的蛋白藥物主要有干擾素、白介素等，盡管在臨床上已成功的治療了某些特定來源的腫瘤，但從總體上來說臨床療效一般，同時也產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒副作用和劑量依賴性等，且只有部分病人對治療敏感。因此有必要研究具有更好臨床療效和較小副作用的蛋白藥物。
[0003]人表皮生長因子(human epidemal growth factor, EGF)是一種通過受體起作用刺激細胞增殖和分化的重要生長因子，很多惡性腫瘤如腎癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、非小細胞肺癌、膀胱癌等均過度表達EGF受體。EGF可競爭結(jié)合癌細胞表面受體，攜帶毒素特異地殺傷癌細胞。天花粉蛋白(TrichosantIlin，TCS)是一種自然存在的植物單鏈毒素，具有抑制腫瘤生長的作用。KDEL則是一段高疏水的序列，將其應(yīng)用于TCS的末端可以提高TCS的活性，利用EGF的靶向性和TCSKDEL蛋白的細胞毒性構(gòu)建的EGF — TCSKDEL融合蛋白，能夠靶向性殺傷腫瘤細胞，有利于臨床腫瘤的治療。體外實驗和移植實體瘤整體動物實驗研究表明，該融合蛋白具有明顯的靶向抗腫瘤效果。
[0004]家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)由供體質(zhì)粒、含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DHlOBmBac構(gòu)成，其產(chǎn)生重組病毒的原理是:首先將外源目的基因克隆入供體質(zhì)粒中，然后將供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DHlOBmBac感受態(tài)細胞中，通過細菌轉(zhuǎn)座子的定點轉(zhuǎn)位作用，將啟動子和目的基因一起轉(zhuǎn)入家蠶桿狀病毒基因組而產(chǎn)生重組病毒DNA，再通過轉(zhuǎn)染家蠶細胞而獲得含有目的基因的重組桿狀病毒。我們利用該系統(tǒng)快速產(chǎn)生能夠表達EGF—TCSKDEL融合蛋白的重組病毒，并利用家蠶BmN細胞表達出具有活性的EGF — TCSKDEL融合蛋白，為利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)該融合蛋白打下基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明提供了一種具有較高表達量和生物活性的用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法。
[0006]技術(shù)方案:為達到上述目的，本發(fā)明一種用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF-TCSKDEL融合蛋白的方法，包括以下步驟:
[0007](I)將 EGF — TCSKDEL 基因從質(zhì)粒 pET28a_EGF — TCSKDEL 中亞克隆至 Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒PFastBacHTb的多克隆位點中，使目的基因位于桿狀病毒多角體啟動子的下游；
[0008](2)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DHlOBmBac細胞內(nèi)，在含有抗生素和半乳糖苷類似物X-Gal的培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)；[0009](3)通過藍白斑篩選獲得陽性克隆，隨后從陽性克隆中抽提質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA即為重組病毒的基因組；
[0010](4)用此DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，72h后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有EGF—TCSKDEL基因的重組桿狀病毒；
[0011](5)利用N1- NTA柱從感染重組桿狀病毒的家蠶細胞中分離純化重組EGF—TCSKDEL融合蛋白:用收集到的重組桿狀病毒大量感染BmN細胞，觀察到細胞有感染跡象時，收集細胞，將細胞經(jīng)超聲破碎后離心取上清，將上清液利用N1- NTA柱分離純化獲得相應(yīng)的目的蛋白質(zhì)，并通過SDS-PAGE分析純化的蛋白純度。
[0012]更為優(yōu)選的，所述步驟(1)中多克隆位點為BamHI和Hindlll。
[0013]更進一步的，所述步驟(2)中抗生素為卡那霉素和慶大霉素中的一種或多種。
[0014]更進一步的,所述卡那霉素的濃度為50 ii g/mL。
[0015]更進一步的，所述慶大霉素的濃度為30 u g/mL。
[0016]更進一步的,所述半乳糖苷類似物X-Gal的濃度為40 U g/mL。
[0017]有益效果:本發(fā)明所提供的一種用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法，將EGF — TCSKDEL基因亞克隆至Bac-to-Bac系統(tǒng)的供體質(zhì)粒PFastBacHTb的多克隆位點中，轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DHlOBmBac細胞內(nèi)，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆，隨后從陽性克隆中抽提質(zhì)粒DNA，用抽提的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，獲得含有EGF — TCSKDEL基因的重組桿狀病毒，用收集到的重組桿狀病毒大量感染BmN細胞，獲得大量表達EGF — TCSKDEL融合蛋白；本發(fā)明具有較高的表達量和生物活性，為創(chuàng)造新的高活性、高抑瘤率、低免疫原性、小分子量的靶向性抗腫瘤藥物奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTb圖；
[0019]圖2為本發(fā)明重組EGF — TCSKDEL融合蛋白經(jīng)純化后的SDS-PAGE分析；
[0020]圖3為本發(fā)明MTT法檢測經(jīng)EGF — TCSKDEL處理的95-D細胞生長情況。
【具體實施方式】
[0021]實施例1:
[0022]材料來源:重組質(zhì)粒pET28a-EGF — TCSKDEL為本公司保存；DNA marker、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等均購于Takara ;桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb、Iipofectin和N1-NTA樹脂均為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清FCS、家蠶BmN細胞培養(yǎng)基TC-100均為GibcoBRL的產(chǎn)品。
[0023]一種用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法，包括以下步驟:
[0024](I)將 EGF — TCSKDEL 基因從質(zhì)粒 pET28a_EGF — TCSKDEL 中亞克隆至 Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTb的多克隆位點BamHI和HindIIII之間，使目的基因位于桿狀病毒多角體啟動子的下游；
[0025](2)將重組的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DHlOBmBac細胞內(nèi)，涂布于含卡那霉素50μ g/mL、慶大霉素30 μ g/mL以及半乳糖苷類似物X-Gal40 μ g/mL的培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)；
[0026](3)通過藍白斑篩選獲得陽性克隆，隨后從陽性克隆中抽提質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA即為重組病毒的基因組；
[0027](4)用此DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，72h后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有EGF—TCSKDEL基因的重組桿狀病毒；
[0028](5)利用N1- NTA柱從感染重組桿狀病毒的家蠶細胞中分離純化重組EGF—TCSKDEL融合蛋白:用收集到的重組桿狀病毒大量感染BmN細胞，觀察到細胞有感染跡象時，收集細胞，將細胞經(jīng)超聲破碎后離心取上清，將上清液利用N1- NTA柱分離純化獲得相應(yīng)的目的蛋白質(zhì)，并通過SDS-PAGE分析純化的蛋白純度。圖2為重組EGF — TCSKDEL融合蛋白經(jīng)純化后的SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，純化后，重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE顯示，純度超過95%。
[0029]利用MTT法來檢測重組EGF—TCSKDEL的抗腫瘤活性的方法:將對數(shù)生長期的高轉(zhuǎn)移人肺腺癌細胞95-D (2X105cell/ml)接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度的EGF—TCSKDEL樣品，空白對照組加等體積的培養(yǎng)液，置37 °C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸取含EGF-TCSKDEL血清，每孔加入MTT工作液100 μ L，使EGF — TCSKDEL終濃度為0.5g/L，于細胞培養(yǎng)條件下保溫72h ;取出培養(yǎng)板，每孔吸取上清100 μ L，加入100 μ L DMS0，于酶標(biāo)儀570nm處測吸光度A值，計算細胞存活率:細胞存活率=[實驗組A均值一背景組A均值]/[空白組A均值一背景組A均值]X100%，并以EGF — TCSKDEL的不同濃度和細胞存活率作圖，確定EGF — TCSKDEL對腫瘤細胞的IC50 ;實驗重復(fù)3次，圖3即為MTT法檢測經(jīng)EGF—TCSKDEL處理的95-D細胞生長情況，顯示了重組EGF — TCSKDEL較對照組具有明顯的抗腫瘤活性作用。
`[0030]應(yīng)當(dāng)指出，以上【具體實施方式】僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF — TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將EGF — TCSKDEL 基因從質(zhì)粒 pET28a-EGF — TCSKDEL 中亞克隆至 Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒PFastBacHTb的多克隆位點中，使目的基因位于桿狀病毒多角體啟動子的下游； (2)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DHlOBmBac細胞內(nèi)，在含有抗生素和半乳糖苷類似物X-Gal的培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)； (3)通過藍白斑篩選獲得陽性克隆，隨后從陽性克隆中抽提質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA即為重組病毒的基因組； (4)用此DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，72h后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有EGF— TCSKDEL基因的重組桿狀病毒； (5)利用N1- NTA柱從感染重組桿狀病毒的家蠶細胞中分離純化重組EGF — TCSKDEL融合蛋白:用收集到的重組桿狀病毒大量感染BmN細胞，觀察到細胞有感染跡象時，收集細胞，將細胞經(jīng)超聲破碎后離心取上清，將上清液利用N1- NTA柱分離純化獲得相應(yīng)的目的蛋白質(zhì)，并通過SDS-PAGE分析純化的蛋白純度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(1)中多克隆位點為BamHI和HindIIK
3.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(2)中抗生素為卡那霉素和慶大霉素中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述卡那霉素的濃度為50 ii g/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述慶大霉素的濃度為30ii g/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達EGF— TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于:所述半乳糖苷類似物X-Gal的濃度為40 u g/mL。
【文檔編號】C12N15/866GK103695468SQ201310407023
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】張俊紅, 余永建, 趙順華, 朱婷 申請人:江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司