蛇足石杉植物內(nèi)生真菌及其在制備石杉堿甲中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛇足石杉植物內(nèi)生真菌，其生物分類和分子生物學(xué)鑒定為木霉菌（Trichodermasp.）L44，該菌已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC?NO:M2013198。本發(fā)明還提供了其在制備石杉堿甲中的應(yīng)用。本發(fā)明為石杉堿甲的來源提供了一個新的微生物。本發(fā)明發(fā)明的微生物，有生長繁殖迅速，不受季節(jié)，氣候等外界環(huán)境的限制，產(chǎn)量提升空間大等優(yōu)勢。能對藥用植物蛇足石杉的野生資源進行有效的保護，避免過度的采挖。
【專利說明】蛇足石杉植物內(nèi)生真菌及其在制備石杉堿甲中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥用植物的微生物提取和產(chǎn)物培養(yǎng)，具體涉及從蛇足石杉中分離內(nèi)生真菌和利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲。
【背景技術(shù)】 [0002]大量的流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，全球人口的老齡化己成世界趨勢，阿爾茨海默病又稱阿爾茨海默病性老年癡呆，一般簡稱Alzheimer病(Alzheimer’s disease, AD),是癡呆的最主要類型，當(dāng)仁不讓地成為了現(xiàn)代社會的“常見病”。據(jù)Ellis等研究表明，60歲以上老年人發(fā)生癡呆的比率為6-12%;隨著年齡的增長，發(fā)病的可能性也明顯增加，如對于85歲以上的老人來說，癡呆的發(fā)生率高達20-40%。盡管癡呆有多種類型，但50%以上屬于AD。
[0003]目前，全世界AD的發(fā)病人數(shù)高達2000萬。在日本65歲以上者老年癡呆癥發(fā)病率約為3.8%，其中女性患病率高于男性。在美國AD患病人數(shù)已達500萬，并預(yù)期在2050年將增加至1000萬，其中每年為AD患者的藥物及護理所支出的費用高達1500億美元，該病已成為除心血管病、癌癥和腦卒中以外危害人民健康的第4大殺手。
[0004]石杉堿甲，是我國首次從蕨類植物石杉科石杉屬植物蛇足石杉中分離出的一種生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨特，與美國FDA批準(zhǔn)的其他AD治療藥物(Tacrine、Don印ezil、Rivastigmine、Galanthamine等)相比,石杉堿甲具抑制AChE活性高、毒副作用低、可提高記憶力和保護心血管等特點，成為治療AD最有前景的天然藥物[7]。
[0005]目前石杉堿甲生產(chǎn)僅能從蛇足石杉等石松屬植物中提取，存在嚴(yán)重的原料短缺和生態(tài)環(huán)境破壞等問題。由于石松屬植物植株矮小(l(T30cm)，生境要求苛刻，生長緩慢(自然條件下12cm成苗生長需10~15年)，石杉堿甲含量極低(約0.02%左右)，野生資源十分有限(我國為蛇足石杉主產(chǎn)區(qū)，實際商業(yè)可采量僅200噸/年)，收集非常困難，無法滿足日益增長的需求。
[0006]為解決石杉堿甲藥源問題，人們對蛇足石杉人工栽培技術(shù)進行了探索，但令人遺憾的是，其人工栽培技術(shù)一直無法突破。同時，許多機構(gòu)開展了化學(xué)合成及組織細胞培養(yǎng)技術(shù)研究。石杉堿甲結(jié)構(gòu)復(fù)雜，反應(yīng)步驟多、反應(yīng)條件苛刻、得率低、環(huán)境污染大，同分異構(gòu)體因無法分離而導(dǎo)致合成物活性低，化學(xué)合成法現(xiàn)無法應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。蛇足石杉等石松屬植物愈傷組織和細胞培養(yǎng)極其困難，自1957年開展石松屬植物組織培養(yǎng)研究以來，研究進展極其緩慢，直到2008年Ma和Gang才實現(xiàn)了粗糙馬尾杉0°.體外繁殖。
[0007]利用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)植物天然藥物成為一種可供選擇的有效途徑。如能采用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲，不僅能有效地解決HupA的藥物來源、降低藥品價格，而且可有效地保護生態(tài)環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種蛇足石杉植物內(nèi)生真菌，同時還提供一種采用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)高產(chǎn)石杉堿甲的方法，以緩解目前石杉堿甲臨床用藥供給嚴(yán)重不足的局面。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:蛇足石杉植物內(nèi)生真菌，經(jīng)18S rDNA和微生物學(xué)鑒定為木霉菌(Trichoderma sp.)L44，該菌已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間2013年5 月 9 日，保藏號 CCTCC Ν0:Μ 2013198。
[0010]本發(fā)明所屬的菌株(Trichoderma sp.) L44,固體培養(yǎng)特征為:
采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)L44菌株，菌落形態(tài)為:28°C培養(yǎng)2_3天菌落直徑為50mm，培養(yǎng)到5-6天可以鋪滿整個培養(yǎng)皿，菌落在生長2-3天顏色為白色，菌絲細絲狀，5-6天生長至整個平皿。菌落中間有細小的深綠色顆粒狀，培養(yǎng)至6-7天，培養(yǎng)菌落上布滿綠色顆粒狀物，在PDA培養(yǎng)基上反面為乳白色，菌落邊緣一圈略顯淡黃色。
[0011]菌絲形態(tài):菌絲平滑，分枝，無色有隔菌絲。
[0012]菌株(Trichoderma sp.) L44的分生孢子梗粗，無色，直徑為10-15 μ m ;分生孢子頂囊近乎球形，直徑為50-65 μ m，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層或雙層，分生孢子球形至近球形，直徑為
2.5-5 μ m0
[0013]本發(fā)明以(Trichoderma sp.) L44為發(fā)酵生產(chǎn)菌株，培養(yǎng)條件為:
以PDA為培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為:常規(guī)方法，土豆200g，加水煮沸過濾得濾液，蔗糖20g，加水定容到lL，pH6.5。
[0014]發(fā)酵條件:溫度28°C，接種量10%，種齡48h，轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵時間7天。發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵液和菌絲進行化學(xué)提取，分離可得石杉堿甲及其類似物。
[0015]本發(fā)明所述的蛇足石杉內(nèi)生真菌(Trichoderma sp.)L44，基因登錄號為KF018088ITS堿基序列為:`
GAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA本發(fā)明的效果:本發(fā)明為石杉堿甲的來源提供了一個新的微生物。
[0016]本發(fā)明發(fā)明的微生物，有生長繁殖迅速，不受季節(jié)，氣候等外界環(huán)境的限制，產(chǎn)量提升空間大等優(yōu)勢。能對藥用植物蛇足石杉的野生資源進行有效的保護，避免過度的采挖。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44的菌落形態(tài)。
[0018]圖2為本發(fā)明所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44在400倍顯微鏡下的菌絲形態(tài)。
[0019]圖3和圖4為本發(fā)明所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44在電鏡下的孢子形態(tài)。
[0020]圖5為本發(fā)明所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44發(fā)酵提取物的薄層圖。
[0021]圖6為本發(fā)明所述木霉菌(Trichoderma sp.)L44發(fā)酵提取物高效液相圖譜，A為石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。圖7為本發(fā)明所述木霉菌(Trichoderma sp.) L44發(fā)酵提取物高效液相圖譜，B為木霉菌(Trichoderma sp.) L44發(fā)酵提取物色譜圖。
【具體實施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0023]步驟一:產(chǎn)石杉堿甲木霉菌(Trichoderma sp.)L44的分離篩選 從浙江省杭州市，天目山采集野生蛇足石杉植株，帶回實驗室培養(yǎng)。
[0024]選用新鮮，健康的植物蛇足石杉，去污粉洗凈后，流水沖洗4h。
[0025]在超凈工作臺上按莖、葉、根分開，莖用0.1%升汞溶液消毒15min，葉片和根在
0.1%升汞溶液中浸泡lOmin，取出材料，無菌水沖洗6遍。
[0026]在無菌條件下，將根莖葉分別切成0.5cm的長度接種于MS培養(yǎng)基上。MS培養(yǎng)基配方為:硝酸鉀(KN03 ) 1900mg/L，硝酸銨(NH4N03 ) 1650 mg/L，磷酸二氫鉀(KH2P04) 170mg/L，硫酸鎂(MgS04.7H20) 370 mg/L，氯化鈣(CaC12.2H20) 440 mg/L，碘化鉀(KI)0.83mg/L,硼酸(H3B03) 6.2 mg/L,硫酸錳(MnS0.44H20) 22.2 mg/L,硫酸鋅(ZnS04.7H20)8.6 mg/L，鑰酸鈉(Na2Mo04.2H20) 0.25 mg/L，硫酸銅(CuS04.5H20) 0.025 mg/L，氯化鈷(CoC12) 0.025 mg/L,乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 37.3 mg/L，硫酸鐵(FeS04.7H20) 27.8mg/L,肌酉享100 mg/L,甘氨酸2 mg/L,鹽酸硫銨素0.1 mg/L ，鹽酸批卩多醇0.5 mg/L,煙酸 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 7 mg/L, ρΗ6.0。28。。，光照強度為 16001ux 培養(yǎng) 40d，將最后一次蕩洗的水涂布在平板上作對照。培養(yǎng)7d以后，對照板上并沒有菌生長，而千層塔的切口處有菌絲長出，用接種環(huán)將菌絲接種到新的PDA培養(yǎng)基上，平板劃線分離，得到純的菌株。
[0027]步驟二:產(chǎn)石杉堿甲木霉菌L44菌絲體的培養(yǎng)
將木霉菌L44接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中250ml的錐形瓶裝100ml的培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件--溫度28°C，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時間48h。
[0028]將種子液按10%的體積比接種到250ml的擴大培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件:溫度28V，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時間7d，得到菌絲體。
[0029]步驟三:菌絲體的收集和產(chǎn)物提取
過濾收集菌絲體，用蒸餾水清洗3次，擠干水，于50°C真空干燥箱干燥至衡重，稱重備用。
[0030]稱取菌絲體，用100倍的無水乙醇熱回流提取有效成分，濃縮提取液到原體積的1/10。發(fā)酵液濃縮后用3倍體積的無水乙醇醇沉，5000r/min離心除去沉淀，將上清液濃縮到 ImL。
[0031]實施四:菌絲體提取物中石杉堿甲的鑒定
采用2cmX IOcm的硅膠板,展開劑為:氯仿/丙酮/異丙醇(4:6:4),顯色劑:0.3%高猛酸鉀溶液，用毛細管直接將0.4μ L樣品和石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品點在距薄層板一端約Icm處，點完干燥后將板置于展開液中，待展開到離板另一端約Icm處取出層析板，自然干燥。待溶劑基本揮發(fā)后，用噴霧器噴上顯色劑，吹干，記錄斑點，測Rf值。
[0032]結(jié)果顯示,木霉菌(Trichoderma sp.)L44菌絲提取物樣品中有石杉堿甲的類似物，遷移率與石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品非常接近，菌絲L44中有石杉堿甲或類似物，見圖5。[0033]采用D10NEX-3000 色譜系統(tǒng)，0DS-C18 反相柱(5 μ m，4.6_X 150_)，色譜條件為:流動相為甲醇:0.1 moL/L醋酸銨(pH 6.0) =36:64 ;流速lmL/min，進樣量20 μ L，柱溫25°C，檢測波長308nm。稱取石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品12.75mg,于25mL的容量瓶中用流動相溶解置亥IJ度。吸取石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1,0.2,0.4,0.8、1.0mL置于IOmL容量瓶中稀釋到刻度，樣品用流動相稀釋成5mL的溶液，膜過濾備用，根據(jù)石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時間對樣品定性，以峰面積與對應(yīng)濃度繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品中石杉堿甲的含量。
[0034]石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過高效液相色譜檢測，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品都在保留時間5.97min有強的吸收峰，菌株木霉菌(Trichoderma sp.)L44的菌絲體提取物在保留時間5.960min,有相似的吸收峰，與其他雜質(zhì)成良好的分離，可見木霉菌(Trichoderma sp.)L44能產(chǎn)石杉堿甲，并且石杉堿甲在菌絲體中，應(yīng)為胞內(nèi)產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，算的木霉菌(Trichoderma sp.) L44樣品中石杉堿甲含量為7.43 μ g/mL,共為5mL ,樣品中石杉堿甲量為37.15 μ g，菌絲體的重量為0.387g，所以每克干菌體的石杉堿甲的含量95.99 μ g，見圖6和圖7。
[0035]步驟五:菌株的形態(tài)學(xué)鑒定
將內(nèi)生真菌菌株L44接種于PDA培養(yǎng)基中，對真菌菌落的形態(tài)特征進行觀察，見圖1。
[0036]菌絲體顯微觀察:將滅菌的濾紙于無菌水中濕潤，置于培養(yǎng)皿中，放上滅菌載玻片上，在載玻片上滴上一滴PDA培養(yǎng)基，將真菌木霉菌L44接種到培養(yǎng)基上，蓋上蓋玻片培養(yǎng)，培養(yǎng)后對菌株的菌絲、 孢子囊等微觀形態(tài)進行觀察記錄，見圖2、圖3，最后，比照《真菌鑒定手冊》。
[0037]菌株的分子鑒定:將培養(yǎng)在PDA上的內(nèi)生真菌菌絲刮下，置于試管中，加500μ LCTAB提取緩沖液，玻棒研磨，65 °C保溫lh，12000 r/min離心10 min，取上清，飽和酚和氯仿異戊醇分別抽提后，用無水乙醇沉淀，12000 r/min離心，倒出乙醇溶液，沉淀晾干后，溶于50 μ L純水中備用。
[0038]PCR擴增菌株ITS區(qū)段根據(jù)已知真菌的保守序列設(shè)計特異性引物ITSl(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) ’ 和 ITS4 (5，-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3) ’，以真菌基因組DNA為模板，擴增菌株ITS區(qū)段。PCR反應(yīng)體系為:PCR體系建立(25 μ L) =TempLate(基因組)IuL，引物各(10 μ moL/L) 0.5 μ L，dNTP (各 10 mmoL/L) 0.5 μ L, 10XPCRBuffer 2.5 μ L，Taq (5U/ μ L) 0.2 μ L 加水至 25 μ L。反應(yīng)條件:預(yù)變性 94°C 5mim ;循環(huán)94°C 30S，55°C 35S，72°C lmin，35個循環(huán)，延伸8min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳進行檢測，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，所得ITS序列如下:GAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫并得到登錄號KF018088。
【權(quán)利要求】
1.蛇足石杉植物內(nèi)生真菌，其特征在于:生物分類和分子生物學(xué)鑒定為木霉菌(Trichoderma sp.) L44，該菌已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2013198。
2.根據(jù)權(quán)利I所述的蛇足石杉植物內(nèi)生真菌，其特征在于:其在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落形態(tài)為:28°C培養(yǎng)2-3天菌落直徑為50mm，培養(yǎng)到5_6天可以鋪滿整個培養(yǎng)皿，菌落在生長2-3天顏色為白色，菌絲細絲狀，5-6天生長至整個平皿， 菌落中間有細小的深綠色顆粒狀，培養(yǎng)至6-7天，培養(yǎng)菌落上布滿綠色顆粒狀物，在PDA培養(yǎng)基上反面為乳白色，菌落邊緣一圈略顯淡黃色。
3.根據(jù)權(quán)利I所述的蛇足石杉植物內(nèi)生真菌，其特征在于:菌絲平滑，分枝，無色有隔菌絲， 菌株的分生孢子梗粗，無色，直徑為10-15μπι;分生孢子頂囊近乎球形，直徑為50-65 μ m，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層或雙層，分生孢子球形至近球形，直徑為2.5_5 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利I所述的蛇足石杉植物內(nèi)生真菌，其特征在于:基因登錄號為KF018088ITS堿基序列為:
GAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC`AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAo
5.根據(jù)權(quán)利I所述的蛇足石杉植物內(nèi)生真菌在制備石杉堿甲中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利5所述的蛇足石杉植物內(nèi)生真菌在制備石杉堿甲中的應(yīng)用，其特征在于:發(fā)酵條件:溫度28°C，接種量10%，種齡48h，轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵時間7天，發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵液和菌絲進行化學(xué)提取，分離可得石杉堿甲。
【文檔編號】C12R1/885GK103667070SQ201310343403
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月8日
【發(fā)明者】董麗輝, 凌慶枝 申請人:浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校